一株重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用

1.本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株过表达pas_fragb_0067基因的毕赤酵母菌及其构建方法与在产木聚糖酶中的应用。


背景技术：

2.生物膜是微生物的一种普遍的存在方式，因为微生物在多细胞群体下的生存能力会大大提高，所以微生物会自发地倾向于形成生物膜或者菌落。生物膜能够形成在生物体或者非生物体的表面，呈膜样生长，对抗菌因子及外界各种压力有高度抗性。因此，生物膜在工业生产和医疗方面均被广泛关注。近年来对于真菌生物膜在人类医学中的作用研究越来越多，对真菌生物膜形成过程中基因的表达研究也日益增多，主要包括:与生物膜形成相关的主要基因、与对抗真菌药物抵抗相关的基因以及黏附及细胞壁合成基因等方面。
3.酵母菌絮凝作为细胞之间粘附的一种方式，有着非常重要的科学研究及工业应用价值。良好的絮凝特性既是酵母细胞应对环境胁迫产生的一种群体保护机制，同时为工业发酵过程提供了一种更加有效的、环境友好的、低廉的细胞分离及产品澄清途径。许多酵母在不利的环境条件下分化为多细胞表型。在酿酒酵母体系中，研究人员已经对flo基因家族功能开展了丰富的研究。但是，细胞粘附过程和相关基因的调控机制是十分复杂的，flo基因对酿酒酵母生物成膜能力及其对酿酒酵母发酵效果的影响，仍然未有普适性的调控理论。例如，paola di gianvito等人在酿酒酵母f6789中敲除flo1对絮凝能力无影响(sci.rep.,2017,7(1):1-12)；但johan o.westman等人的研究表明，逐渐删除flo1中的串联重复会导致不同粘附表型的相应减少，例如粘附塑料和絮凝(appl.environ.microb.,2014,80(22):6908-6918)。
4.毕赤酵母表达系统是当前流行的真核表达系统之一，具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点，有可诱导的强启动子，具有高表达、高稳定、高密度发酵、适度糖基化、表达产物生物活性好、发酵纯化操作方法简便及易于工业化生产等特点，已成功地表达了许多极具价值的蛋白。目前，毕赤酵母菌体系中生物成膜吸附固定化发酵的研究报道较少，毕赤酵母flo家族基因与生物成膜的相关调控机制也尚待探索。现有技术中，cn113046256a通过构建了一株过表达hsf1的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。cn112592844a构建了一株过表达凝集素lman2的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。然而毕赤酵母菌的生物成膜机制仍不明朗，这促使本领域技术人员继续探究细胞粘附相关基因与生物成膜的调控关系，从而更好的利用生物膜固定发酵，实现缩短发酵周期、循环使用细胞的目的。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种过表达
pas_fragb_0067基因的重组毕赤酵母基因工程菌，以期进一步研究毕赤酵母成膜机制和粘液素样蛋白基因pas_fragb_0067(与flo11结构域相关)在其中的调控作用。
6.本发明还要解决的技术问题是，提供上述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法。
7.本发明最后要解决的技术问题是，提供上述重组毕赤酵母基因工程菌的应用。
8.具体地，本发明公开了一种重组毕赤酵母基因工程菌，其在所述出发毕赤酵母菌中过表达粘液素样蛋白基因pas_fragb_0067，所述出发毕赤酵母为能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌komagataella phaffii gs115-xyn，所述絮凝基因pas_fragb_0067的ncbi登录号为xm_002490834.1(seq id no.1)。
9.本发明进一步提出了上述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
10.(1)以毕赤酵母表达菌komagataella phaffii gs115-xyn(毕赤酵母菌gs115-xyn，k.phaffii gs115-xyn均具有相同含义)基因组为模板，利用pcr扩增pas_fragb_0067基因片段；
11.(2)将步骤(1)获得的pas_fragb_0067基因片段克隆到表达质粒上，得到重组质粒；
12.(3)将步骤(2)获得的重组质粒线性化后导入毕赤酵母表达菌komagataella phaffii gs115-xyn中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌。
13.优选地，通过在含有zeocin的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(ypd)抗性平板上筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌。优选地，zeocin浓度为100μg/ml。
14.步骤(1)中，所述pcr扩增所用的引物为引物1和引物2，其核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。
15.步骤(2)中，所述的表达质粒优选为pgapz a。
16.本发明进一步公开了所述的重组毕赤酵母基因工程菌在细胞膜生物发酵中的应用。本技术研究表明，通过过表达pas_fragb_0067基因，提升了毕赤酵母生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，发酵效率低等的问题，可以更好的应用于生物膜固定化发酵中。
17.在一个具体的应用中，可以利用所述重组毕赤酵母基因工程菌0067*发酵生产木聚糖酶。
18.优选地，所述重组毕赤酵母基因工程菌通过固定发酵的方式产木聚糖酶。
19.具体地，所述固定发酵为向含有固定化载体的发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液，优选地，在发酵过程中加入甲醇诱导木聚糖酶的表达。
20.上述过程中，所述的重组毕赤酵母基因工程菌菌泥为重组毕赤酵母基因工程菌种子液离心所得。
21.其中，所述重组毕赤酵母基因工程菌种子液的制备方法包括如下步骤：
22.(a)将重组毕赤酵母基因工程菌接种到活化培养基中，培养得到活化液；
23.(b)将步骤(a)所得的活化液接种到种子培养基中，培养得到重组毕赤酵母基因工程菌的种子液。
24.步骤(a)中，所述的活化培养基中，各组分的浓度为蛋白胨10-30g/l、酵母粉5-15g/l、葡萄糖10-30g/l、生物素0.1-5mg/l；优选为蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、葡萄糖20g/
l、生物素0.4mg/l。
25.步骤(a)中，所述活化培养基的溶剂为水。
26.步骤(a)中，所述的培养为在28-30℃，200-300rpm条件下培养16-24h，优选为为在28℃，250rpm条件下培养24h。
27.步骤(b)中，所述的种子培养基中，各组分的浓度为蛋白胨10-30g/l、酵母粉5-15g/l、无氨基酵母氮源10-20g/l、磷酸氢二钾0.1-1g/l、磷酸二氢钾1-5g/l、生物素0.1-5mg/l，溶剂为水，优选为蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、甘油10g/l、ynb 13.4g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、磷酸二氢钾1.18g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为水。
28.优选地，步骤(b)中，所述培养为在28-30℃，200-300rpm条件下培养16-24h；优选为28℃，250rpm条件下培养24h。
29.其中，上述固定发酵中，所述固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合；优选为棉纤维织物。
30.优选地，将固定化载体进行预处理，即将固定化载体剪成2-8cm
×
2-8cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡0.5-4h，再用纯水清洗后沸水浴10-40min后干燥；优选地，所述的预处理为将固定化载体剪成4cm
×
4cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗后沸水浴30min后干燥。
31.其中，所述固定化载体的用量为2-80g/l发酵培养基，优选为40g/l发酵培养基。
32.上述产木聚糖酶的发酵培养基中，各组分的浓度为：蛋白胨10-30g/l、酵母粉5-15g/l、无氨基酵母氮源(ynb)10-20g/l、磷酸氢二钾0.1-1g/l、磷酸二氢钾1-5g/l、生物素0.1-5mg/l，溶剂为水；优选为蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、ynb 13.4g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、磷酸二氢钾1.18g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为水。
33.进一步优选地，发酵过程中每24h加入甲醇。
34.更进一步优选地，甲醇的加入量为发酵培养基的0.1-2％v/v。
35.优选地，上述发酵的温度为28-30℃，优选为30℃。
36.上述发酵的转速为200-300rpm，优选为250rpm。
37.上述发酵的时间为3-5d，优选为5d。
38.有益效果：本发明提出的重组毕赤酵母基因工程菌0067*是由出发毕赤酵母gs115-xyn的pas_fragb_0067基因过表达后改造得到。本发明首次过表达pas_fragb_0067基因，提升了毕赤酵母生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，发酵效率低等的问题。具体地，经qrt-pcr检测发现，重组菌中pas_fragb_0067基因表达量为出发菌中pas_fragb_0067基因表达量的3673.4倍；在单次固定化发酵条件下毕赤酵母基因工程菌产木聚糖酶酶活最高可达4905.8u/ml，是同一时间下出发菌gs115-xyn产酶酶活的1.57倍；通过固定化连续发酵，以棉纤维为载体，出发菌株在发酵至第3批次时产酶能力显著下降，而重组菌株能够稳定连续进行至少5批次固定化发酵。经过5批次固定化发酵后，重组菌发酵产酶的酶活为出发菌的3.90倍，重组菌在发酵上具有明显优势。
附图说明
39.图1为表达质粒pgapz a-pas_fragb_0067示意图；
40.图2a为目的基因pas_fragb_0067的pcr电泳图，泳道m为dl5000 dna marker，泳道1为目的基因pas_fragb_0067；图b为pgapz a载体片段的pcr电泳图，泳道m为dl 5000dna marker，泳道1为pgapz a载体片段；图c为重组质粒pgapz a-pas_fragb_0067电泳图，其中泳道m为dl 5000dna marker，泳道1为pgapz a载体片段，泳道2为重组质粒pgapz a-pas_fragb_0067；
41.图3为重组菌0067*的验证图，其中泳道m为dl 5000dna marker，泳道1为0067*阴性对照，泳道2、3为0067*验证基因片段，泳道4为0067*阳性对照；
42.图4为检测出发菌gs115-xyn和重组菌0067*细胞爬片结果图，其中图a为出发菌gs115-xyn的细胞爬片检测图，图b为重组菌株0067*的细胞爬片检测图；
43.图5为利用荧光显微镜观察出发菌gs115-xyn和重组菌0067*生物膜形成差异结果图，其中图a为出发菌gs115-xyn的荧光检测图，图b为重组菌株0067*的荧光检测图；
44.图6为出发菌和重组菌结晶紫染色法半定量测生物膜量实验结果图；
45.图7为重组菌中pas_fragb_0067基因相对表达量；
46.图8为出发菌与重组菌固定化单批次发酵产木聚糖酶活力对比图；
47.图9为出发菌与重组菌固定化连续发酵产木聚糖酶酶活力对比图。
具体实施方式
48.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
49.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
50.实施例1产木聚糖酶重组毕赤酵母gs115-xyn的构建
51.将来自厌氧真菌neocallimastix patriciarum的木聚糖酶(pdb no.:3wp4_a)基因片段插入ppic9k质粒ecor i和not i酶切位点之间，构建了ppic9k-xyn质粒，密码子优化和质粒亚克隆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。使用sal i限制性内切酶来线性化ppic9k-xyn质粒，将线性化片段导入毕赤酵母gs115感受态细胞中，转化子在md平板(md平板培养基配方为：13.4g/l酵母基本氮源，0.4mg/l生物素，20g/l葡萄糖，20g/l的琼脂)上30℃培养至长出单菌落。将md平板上的单菌落转接至含有4mg/ml g418的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(ypd)抗性平板上进行筛选，28-30℃培养2-3d至长出菌落。
52.将上述菌落转接至装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。将种子液在4500rpm条件下离心5min，弃去上清，菌泥接入发酵培养基(500ml摇瓶，装液量100ml)当中，在30℃，250rpm条件下游离发酵。发酵过程中每隔24h加入1％v/v的甲醇(相对于发酵培养基的体积)进行木聚糖酶表达的诱导。取发酵72h后发酵液样品检测木聚糖酶的酶活为3025u/ml。出发毕赤酵母菌gs115-xyn构建成功，用于后续实验。
53.实施例2：木聚糖酶活性的测定。
54.1、木糖标准曲线的绘制
55.取10ml离心管，逐个加入各组分，进行木糖标准曲线的绘制。
56.其中，dns试剂每升组分如下：3.5-二硝基水杨酸7.5g，氢氧化钠14.0g，酒石酸钾
钠216.0g，苯酚5.0g，偏重亚硫酸钠6.0g，溶剂为水。
57.其中，木糖标准液每升组分如下：木糖10g，溶剂为水。
58.其中，磷酸钾缓冲液每升组分如下：三水磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾11.8g，溶剂为水。
59.其中，木糖标准曲线反应体系见表1。
60.表1木糖标准曲线反应体系
[0061][0062]
按上述体系，于10ml的离心管中逐个加入各组分；充分混匀后，置于沸水中煮沸5min，反应液迅速用冷水冷却至室温，补加蒸馏水至5ml，以空白对照调零，于540nm处测吸光值。以木糖含量为纵坐标，吸光值为横坐标，制作标准曲线，并拟合出回归方程。
[0063]
2、木聚糖酶活性的测定
[0064]
木聚糖酶酶活测定采用3.5-二硝基水杨酸(dns)试剂法：木聚糖酶水解木聚糖(榉木)生成的单糖与3.5-二硝基水杨酸(dns)试剂发生显色反应，使用紫外分光光度法于540nm处检测吸光值，通过测定酶促反应所生成的还原性木糖来定量的计算酶活性。
[0065]
测定方法如下：于0.225ml磷酸钾缓冲液中加入25μl适当稀释的酶液，再加入0.5ml的木聚糖底物，于50℃条件下准确反应15min后，加入1ml dns试剂充分混合煮沸5min，反应液迅速用冷水冷却至室温，补加蒸馏水至5ml，以不加粗酶液的空白对照调零，于540nm处测吸光值。酶活定义为：在此测定的条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(u/ml)。
[0066]
实施例3构建过表达pas_fragb_0067基因的过表达质粒。
[0067]
1、目的基因pas_fragb_0067的扩增：以提取的k.phaffii gs115-xyn基因组为模板，用引物1(seq id no.2)和引物2(seq id no.3)对基因pas_fragb_0067进行扩增。
[0068]
pcr反应体系见表2。
[0069]
表2目的基因pas_fragb_0067扩增pcr体系
[0070][0071]
按上述体系，每管50μl。
[0072]
pcr条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火55℃，5s；4)延伸72℃，45s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。
[0073]
目的基因pas_fragb_0067的扩增产物大小为4251bp(seq id no.1)，电泳图如附图2a所示。pcr产物经takara胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
[0074]
2、表达质粒pgapz a的提取及目的片段扩增
[0075]
1)表达质粒pgapz a的提取：将带有质粒pgapz a的大肠杆菌top 10甘油菌接种于5ml的lb液体培养基(含有zeocin 25μg/ml)，37℃培养过夜；用2.0ml离心管收集细胞，10000rpm离心2min，弃上清液；依照axyprep质粒dna小量试剂盒说明书中的步骤进行操作，提取质粒pgapz a。
[0076]
2)pgapz a片段的扩增
[0077]
以线性化pgapz a质粒为模板，用引物3(seq id no.4)和引物4(seq id no.5)对pgapz a片段进行扩增。
[0078]
pcr反应体系见表3。
[0079]
表3线性化质粒pgapz a的扩增pcr体系
[0080][0081]
按上述体系，每管50μl。
[0082]
pcr条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火55℃，5s；4)延伸72℃，30s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。pcr产物经takara胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
[0083]
pgapz a片段的扩增产物大小为2857bp(seq id no.6)，电泳图如附图2b所示。pcr
产物经takara胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
[0084]
3、重组质粒的构建
[0085]
将步骤1得到的目的基因片段与步骤2得到的pgapz a片段按照peasy-basic seamless cloning and assembly kit试剂盒的说明书的步骤相连接，得到重组质粒pgapz a-pas_fragb_0067。克隆反应体系见表4，在试剂盒中提供的trans-t1感受态细胞中加入重组产物，在冰上放置30分钟，42℃水浴中热激30秒，之后马上转至冰上冷却2min。
[0086]
表4连接反应体系
[0087][0088][0089]
将上述得到的连接液转入到450μl lb培养基中，复苏后涂布于lb抗性平板(含25μg/ml zeocin)，37℃培养12h至长出明显单菌落。
[0090]
挑取上述平板单菌落，接种于lb液体培养基(含25μg/ml zeocin)中37℃过夜培养12h后，提取质粒，经测序表明序列无误。重组质粒大小为7108bp(seq id no.7)，pgapz a-pas_fragb_0067示意图见附图1，其电泳图见附图2c。
[0091]
实施例2：构建过表达pas_fragb_0067基因的毕赤酵母基因工程菌。
[0092]
4、重组质粒的转化
[0093]
使用avrⅱ将质粒pgapz a-pas_fragb_0067酶切线性化。
[0094]
重组质粒pgapz a-pas_fragb_0067线性化体系见表5。
[0095]
表5重组质粒pgapz a-pas_fragb_0067线性化体系
[0096][0097]
酶切的条件为37℃，1h，酶切反应结束后将酶切产物进行胶回收，用于后续的实验。
[0098]
将上述线性化的重组质粒pgapz a-pas_fragb_0067导入k.phaffii gs115-xyn感
受态细胞中，在含有100μg/ml zeocin的ypd平板上进行筛选，28-30℃培养2-3d至长出单菌落。
[0099]
5、重组菌株0067*的验证
[0100]
挑取上述单菌落，以引物5(seq id no.8)和引物6(seq id no.9)进行菌落pcr，验证重组菌基因组上是否含有zeocin基因片段。
[0101]
pcr反应体系见表6。
[0102]
表6重组菌株0067*的菌落pcr体系
[0103][0104]
按上述体系，每管50μl。
[0105]
pcr条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火55℃，5s；4)延伸72℃，25s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。pcr产物以2.0％核酸胶验证。验证基因片段pcr产物大小为1482bp(seq id no.10)，重组菌验证结果电泳图如附图3所示。
[0106]
实施例4：生物膜的成膜表征检测。
[0107]
图4中，a和b分别是出发菌gs115-xyn和重组菌株0067*，经过细胞爬片实验后在40
×
显微镜下进行观察的结果图，可以明显看出重组菌株成膜效果比出发菌成膜效果好，生物膜形成量多。
[0108]
图5中，a和b分别是出发菌gs115-xyn和重组菌株0067*，经过con a染色后在荧光显微镜下进行观察的结果，可以明显看出重组菌株相较出发菌株表现出比较集中的绿色，成膜效果更佳。
[0109]
图6进行的结晶紫染色法半定量测生物膜量实验，在每孔装有190μl的ypd的96孔板中分别加入10μl的出发菌和重组菌的菌液，培养到1-3d时，每隔24h用结晶紫染色法和酶标仪测其od
570
。从图中可以看出重组菌株0067*成膜效果优于gs115-xyn。
[0110]
实施例5重组菌中pas_fragb_0067基因的相对表达量的测定。
[0111]
取游离培养毕赤酵母重组菌的48h样品，离心收集细胞，送至擎科生物，利用qrt-pcr对重组菌中pas_fragb_0067基因表达量进行测定，以actin为内参基因，采用相对定量法计算基因的相对表达量。结果如图7所示，重组菌中pas_fragb_0067基因表达量为出发菌中pas_fragb_0067基因表达量的3673.4倍。
[0112]
实施例6重组菌固定化单批次发酵产木聚糖酶实验
[0113]
1、活化培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g、生物素0.4mg，溶剂为水。
[0114]
种子培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、甘油10g、ynb 13.4g、三水磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾1.18g、生物素0.4mg，溶剂为水。
[0115]
发酵培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、ynb 13.4g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾1.18g、生物素0.4mg，溶剂为水，加入预处理过的棉纤维织物载体(40g/l发酵培养基)，其中，所述预处理为将棉纤维织物剪成4cm
×
4cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗后沸水浴30min后干燥。
[0116]
2、活化：将0067*从-80℃冰箱取出，试管中准备5ml活化培养基，接种量50μl，于30℃摇床中培养24h，转速为250rpm。
[0117]
转接：活化完成后分别倒入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。
[0118]
发酵：将发酵液分装于500ml摇瓶，装液量100ml，115℃，20min。将种子液在4500rpm条件下离心5min，弃去上清，菌泥接入发酵培养基当中，在30℃，250rpm条件下发酵4d。发酵过程中每隔24h加入1％v/v的甲醇(相对于发酵培养基的体积)进行木聚糖酶表达的诱导。
[0119]
如图8所示，重组菌固定化单次发酵产木聚糖酶，产量最高可达4905.8u/ml。同一时间下，相比于重组菌，出发菌固定化单次发酵所得的木聚糖酶酶活较低，且重组菌固定化单次发酵产酶的酶活是出发菌的1.57倍。
[0120]
对比例1出发菌固定化单批次产酶。
[0121]
将实施例6中接入的重组菌更换为出发菌gs115-xyn，其余步骤同实施例6，检测得发酵产物酶活如图8所示。
[0122]
实施例7生物膜固定化连续发酵比较木聚糖酶酶活。
[0123]
本实验一共分为5批次连续发酵，一共耗时600h，单批次发酵同实施例6，以棉纤维为载体，每隔24h取一次样，培养至120h时一批次的发酵结束。每一批次发酵结束后，便将固定化载体在无菌工作台中转移至新的培养基中培养。以此类推，直至第5批次发酵结束。重组菌的固定化连续发酵酶活见附图9。通过固定化连续发酵，以棉纤维为载体，出发菌株在发酵至第3批次时，产酶能力显著下降，出发菌株第5批酶活是第一批的28.48％。而重组菌株能够稳定连续进行至少5批次固定化发酵，经过5批次固定化发酵后，重组菌发酵产酶的酶活为出发菌的约3.90倍。
[0124]
对比例2出发菌固定化连续发酵产酶。
[0125]
将实施例7中接入的重组菌更换为出发菌gs115-xyn，其余步骤同实施例7，检测得发酵产物酶活见图9。
[0126]
本发明提供了一种重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与在产木聚糖酶中增加生物膜的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一株重组毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过在出发毕赤酵母菌中过表达絮凝基因pas_fragb_0067得到，其中，出发毕赤酵母菌为能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌komagataella phaffii gs115-xyn，所述絮凝基因pas_fragb_0067的ncbi登录号为xm_002490834.1。2.根据权利要求1所述重的组毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以毕赤酵母表达菌komagataella phaffii gs115-xyn为模板，利用pcr扩增pas_fragb_0067基因片段；（2）将步骤（1）获得的pas_fragb_0067基因片段克隆到表达质粒上，得到重组质粒；（3）将步骤（2）获得的重组质粒线性化后转化至毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌，将其命名为0067*。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，通过在含有zeocin的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基抗性平板上筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌。4.权利要求1所述的重组毕赤酵母基因工程菌在生物膜固定化发酵中的应用。5.权利要求1所述的重组毕赤酵母基因工程菌在发酵生产木聚糖酶中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组毕赤酵母基因工程菌通过固定发酵的方式产木聚糖酶。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，向含有固定化载体的发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌的菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液，其中，在发酵过程中加入甲醇诱导木聚糖酶的表达。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合，固定化载体的用量为2-80 g/l发酵培养基。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，重组毕赤酵母基因工程菌种子液离心所得；所述发酵培养基的组分为：蛋白胨10-30 g/l、酵母粉5-15 g/l、无氨基酵母氮源10-20 g/l、磷酸氢二钾0.1-1 g/l、磷酸二氢钾1-5 g/l、生物素0.1-5 mg/l，溶剂为水。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养条件为：28-30℃，200-300 rpm条件下培养3-5d，发酵过程中每24 h加入甲醇，甲醇的加入量为发酵培养基体积的0.1-2%。

技术总结
本发明公开了一株重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用。所述重组毕赤酵母基因工程菌是由出发毕赤酵母的PAS_FragB_0067基因过表达后改造得到。本发明以能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌Komagataella phaffii GS115-xyn为出发菌，首次过表达PAS_FragB_0067基因，成功构建重组菌0067*，提升了毕赤酵母生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，发酵效率低等的问题。并且改造后的毕赤酵母基因工程菌在连续发酵过程中发酵性能更高，产酶酶活性更强，在发酵上具有明显优势。势。势。


技术研发人员：牛欢青 闵志迪 应汉杰 赵谷林 陈勇 柳东 朱晨杰 庄伟 李明
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/4