一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用

1.本发明属于生物技术领域，进一步涉及固定化酶技术领域，具体涉及一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.布瓦西坦(brivaracetam)(化学名称为(2s)-2-[(4r)-2-氧代-4-丙基-1-吡咯烷基]丁酰胺)是左乙拉西坦的结构衍生物，为比利时优时比(ucb)最新开发的第三代抗癫痫药物。能与突触囊泡糖蛋白2a结合，亲和力较左乙拉西坦强15～30倍，更有效地降低部分性癫痫发作的频率。分别于2016年1月和2月被欧洲emea和美国fda批准上市，用于治疗成人和16岁以上青少年癫痫患者的部分发作、伴有或不伴有继发全身发作的辅助治疗。
[0003]
对布瓦西坦的合成方法已有较多研究，涉及化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法不对称合成和酶法手性拆分。由于布瓦西坦存在两个手性中心，化学合成法往往涉及复杂的对映体分离与纯化，成本较高；酶法手性拆分具备温和条件，降低手性化合物纯化成本，但其理论转化率只有50％。近几年，生物酶法的不对称合成技术不断地被开发应用，逐渐被应用到布瓦西坦中间体的合成中。
[0004]
酶的固定化能促使酶与反应体系分离，实现酶的循环使用，同时增加了酶对环境的耐受性。现有的固定化酶方法可分为物理作用力固定和化学共价键结合固定等。依赖于物理作用力的固定化方式主要包括包埋、吸附、离子键合等，由于其不会破坏蛋白的三维结构，往往能获得较高的酶活回收率。但由于物理作用力相对较弱，不稳定，其固定的蛋白容易脱落，影响固定化酶的循环稳定性。而化学键共价连接主要包括载体与酶的共价连接和酶之间的共价交联等。与借助物理作用力的固定化方式不同，共价连接直接通过化学键共价的方法将酶与载体结合。因其共价键的相互作用较强，所制得的固定化酶的循环稳定性较好。但由于共价连接的氨基酸残基容易残留在酶的内部，同时其能够催化活性口袋，致使其对酶的结构和催化功能造成破坏，进一步导致酶活回收率偏低。


技术实现要素：

[0005]
本发明是为了克服现有技术中制备的固定化烯还原酶与醇脱氢酶的双酶体系酶活偏低、循环稳定性差、难以实现辅酶的循环利用、环境耐受性较差、催化效果差的缺陷，提供了一种固定化双酶树脂及其制备方法，并将其应用于不对称还原制备布瓦西坦中间体中。
[0006]
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：一种固定化双酶树脂，包括树脂载体以及连接在所述树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。
[0007]
烯酮还原酶能够立体选择性不对称加氢被激活的c＝c，即由吸电子基团激活的c＝c，如α,β-不饱和羰基化合物中的c＝c，一次加氢反应可引入两个潜在的手性中心，用于高效合成光学纯饱和氰化合物、光学纯硝基烷烃以及光学纯饱和醛或酮类化合物等。烯酮
还原酶是手性分子生物催化合成的重要酶类之一，该酶广泛存在于微生物中，尤其是细菌、真菌及植物中。烯酮还原酶催化反应过程是基于反式加氢的原则，同时在还原型辅酶ⅰ(nadh)或者还原型辅酶ⅱ(nadph)当作辅酶的条件下，不对称加氢c＝c，产生辅酶因子nad(p)
+
。为了使加氢反应不断进行，需要对这种辅酶因子进行再生反应，通常利用醇脱氢酶、甲醛脱氢酶或葡萄糖脱氢酶等脱氢酶类作为辅助催化剂，利用相对应的醇、甲酸或葡萄糖等廉价底物来实现辅酶因子的再生。因此，烯酮还原酶被用于生物催化过程，通常还需要辅酶再生系统的辅助，也即需要构筑双酶系统。有鉴于此，以简单方便且易于操作的方式建立双酶固定化方法，同时实现高酶活回收率和高循环稳定性，具有一定的应用价值。
[0008]
此外，氧化还原酶的固定化过程中，常常由于其多聚体酶结构和辅基结构，其固定化过程中往往伴随着较高酶活的损失。除了通常的酶三级结构扭曲和化学失活的原因外，多聚体酶的单亚基解离和辅酶因子的解离也可能是重要的影响因素。因此，本发明人经多次实验后开发出一种基于烯酮还原酶和辅酶循环系统的双酶固定化方法，从而制备出一种能够保持高的酶活和循环稳定性的固定化双酶树脂。该固定化双酶树脂包括树脂载体以及连接在树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。
[0009]
作为优选，所述树脂载体为环氧树脂、伯氨基树脂中的任意一种或两种的组合。
[0010]
环氧树脂的化学稳定性和机械强度较高，其作为树脂载体有助于在化学反应过程中提高反应的稳定性和转化率。伯氨基树脂是一种含有氨基官能团的聚合物，具有活性表面和极好的吸附能力，其表面的氨基官能团有助于促进烯还原酶以及醇脱氢酶中多肽链的生长。此外，伯氨基树脂表面的氨基官能团具有亲水性，能够吸附类似于酸、离子等杂质，从而有效提高反应产物的纯度。
[0011]
作为优选，所述环氧树脂中包含有如下式(1)、式(2)中的任意一种或两种的组合的环氧官能团：
[0012]
作为优选，所述环氧树脂为lx-1000ep环氧树脂、lx-1000epa环氧树脂、lx-103b环氧树脂、es-103b环氧树脂、es-109环氧树脂中的任意一种或多种的组合。
[0013]
一种制备如上所述的固定化双酶树脂的方法，包括以下步骤：(s.1)发酵制备烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液并混合均匀得到混合发酵双酶液；(s.2)将步骤(s.1)中得到的混合发酵双酶液破碎、重悬、离心后得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(s.3)将树脂载体加入步骤(s.2)中得到的双酶粗酶混合液中，使得树脂载体与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应，得到固定化双酶树脂。
[0014]
作为进一步优选，所述步骤(s.1)中产烯还原酶发酵液的菌体与产醇脱氢酶发酵液的菌体浓度比为1:1～10:1，按菌体浓度比混合两种发酵液后进行离心，弃去上层清液并收集细胞，得到混合发酵双酶液。
[0015]
作为进一步优选，所述步骤(s.2)得到双酶粗酶混合液的具体步骤如下：向步骤(s.1)中得到的混合发酵双酶液中加入缓冲液并震荡至混合均匀，得到细胞悬浊液；使用高压均质机将重悬后的细胞悬浊液破碎，得到细胞破碎液并进行离心，去除沉淀并收集上层清液，得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液。
[0016]
作为更进一步优选，所述缓冲液为磷酸缓冲液，较佳地为20～2000mmol/l的磷酸缓冲液；更佳地为50～500mmol/l的磷酸盐缓冲液；进一步更佳地为100mmol/l的磷酸盐缓冲液。所述的磷酸缓冲液优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。所述的磷酸缓冲液的ph较佳地为6～9，更佳地为7～8。
[0017]
作为更进一步优选，磷酸盐缓冲液中需添加金属离子，优选镁离子，镁离子的浓度较佳地为1～100mmol/l，更佳地为1～10mmol/l，所述添加的镁离子优选氯化镁。
[0018]
作为进一步优选，所述步骤(s.3)中得到固定化双酶树脂的具体步骤如下：将树脂载体加入步骤(s.2)中得到的双酶粗酶混合液中，使得树脂载体与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应，过滤除去上层清液并洗涤、冷冻干燥得到固定化双酶树脂。
[0019]
作为优选，所述步骤(s.3)中双酶粗酶混合液中含有的烯还原酶与树脂载体的相对用量为1
×
10-5
～1
×
10-2
u/g，双酶粗酶混合液中含有的醇脱氢酶与树脂载体的相对用量为10～1000u/g；所述步骤(s.3)中反应时间为1～24h，反应温度为10～40℃。
[0020]
作为进一步优选，所述步骤(s.3)中反应时间为1～5h，反应温度为25～35℃。
[0021]
作为进一步优选，一种制备如上所述的固定化双酶树脂的方法，还包括以下步骤：将步骤(s.3)中得到的固定化双酶树脂投入到0.1～5wt％的戊二醛溶液中并加入缓冲液，使得固定化双酶树脂与戊二醛进行交联反应。所述交联反应时间较佳地为0.5～2h，交联反应温度较佳地为25～35℃。
[0022]
通过上述步骤，有助于对固定化双酶树脂进一步修饰以加强其结构刚性与循环稳定性。
[0023]
一种如上所述的固定化双酶树脂在不对称加氢还原4-丙基呋喃-2(5h)-酮中的应用。
[0024]
一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，包括以下步骤：在如上所述的固定化双酶树脂的催化下，将4-丙基呋喃-2(5h)-酮进行还原反应，得到(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮。
[0025]
作为优选，所述4-丙基呋喃-2(5h)-酮的浓度为0.1～100g/l。
[0026]
作为进一步优选，所述4-丙基呋喃-2(5h)-酮的浓度为1～20g/l，进一步优选为1～10g/l。
[0027]
作为优选，在所述还原反应过程中需加入nadp
+
，所述nadp
+
的浓度为1mmol/l～100mmol/l；在所述还原反应过程中需添加异丙醇，所述异丙醇的浓度为1～20wt％；在所述还原反应过程中固定化双酶树脂的添加量为1～50wt％。
[0028]
作为进一步优选，所述还原反应在缓冲液中进行，所述缓冲液为磷酸缓冲液，较佳地为20～2000mmol/l的磷酸缓冲液；更佳地为50～500mmol/l的磷酸盐缓冲液；进一步更佳地为100mmol/l的磷酸盐缓冲液。所述的磷酸缓冲液优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
所述的磷酸缓冲液的ph较佳地为6～9，更佳地为7～8。
[0029]
作为进一步优选，所述还原反应的反应温度为5～37℃，所述还原反应的反应时间为24～120小时。
[0030]
作为进一步优选，在所述还原反应结束后，可通过过滤回收得到固定化双酶树脂，以再次用于(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备，从而实现对固定化双酶树脂的循环利用。
[0031]
因此，本发明具有以下有益效果：(1)本发明方法制备的固定化双酶树脂简单、酶活回收率高达90％以上、蛋白回收效率达65％。多次使用后固定化双酶树脂的活力剩余高(套用10批次后酶活力剩余甚至可达80％以上)，转化率高(可实现5
‰
底物投料量的完全反应)，蛋白载量可达250mg/g，高于已有报道的通过包埋(20mg/g)等固定化方法的蛋白载量；(2)本发明方法制备的固定化双酶树脂酶活高、循环稳定性高、有效提高辅酶的循环利用，具有机械强度高、生物相容性好、环境耐受性强、不易失活、稳定性高的优良特性；(3)本发明得到的固定化双酶树脂，用鼓泡或搅拌混合方式，可使其均匀分散于溶液中用于催化制备(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮，具有产物选择性高、工艺操作简单、固废和产品损失低、产品收率高，有效降低反应成本等优势。
附图说明
[0032]
图1为本发明的催化反应方程式。
[0033]
图2为使用固定化双酶树脂催化4-丙基呋喃-2(5h)-酮加氢合成(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的气相色谱图。
[0034]
图3为制备的基于烯还原酶及醇脱氢酶双酶催化体系的固定化双酶树脂图。
具体实施方式
[0035]
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0036]
下述实施例中，所用树脂中es-103b、es-109树脂及部分伯氨基树脂购买自天津南开和成科技有限公司，其余树脂若没有特殊说明均购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
[0037]
固定化双酶树脂催化4-丙基呋喃-2(5h)-酮制备(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的浓度，采用气相色谱进行分析，具体的分析方法为：采用8890agc系统(agilent，santa clara，ca，usa)。使用hp-5柱测定加氢底物和加氢产物的浓度(30m
×
0.32mm
×
0.25μm；agilent)。气化室温度和火焰离子化(fid)检测器的温度分别为220℃和250℃，使用氮气用作载气(1ml
·
min-1
)带有分流进样比例为1:50。初始柱温箱温度为80℃、紧随其后增加15℃
·
min-1
加热至230℃。
[0038]
实施例1
本实施例中提供一种制备固定化双酶树脂的方法。
[0039]
一种制备如上所述的固定化双酶树脂的方法，包括以下步骤：(s.1)选取产烯还原酶重组大肠杆菌(escherichia coli)(参考发明专利cn112143764b)和产醇脱氢酶的重组大肠杆菌(e.coli)(参考发明专利cn112143764b)，根据已公开的(参考发明专利cn112143764b)方法进行接种发酵，获得烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液。将烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液按最终菌体浓度比例4:1混合均匀，用柜式离心机以转速4400rpm离心30min后，弃去上层清液并收集细胞，得到混合发酵双酶液；(s.2)向步骤(s.1)中得到的混合发酵双酶液中加入与发酵液等体积的100mmol/l磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)，其中磷酸盐缓冲液中需添加2mmol/l的氯化镁，在漩涡混合器中转速8000rpm的条件下，震荡10min至均匀混合，得到细胞悬浊液。使用高压均质机在4℃、800bar的条件下破碎重悬后的细胞悬浊液，循环破碎2次，得到细胞破碎液。然后用柜式离心机以转速4400rpm离心30min，去除沉淀并收集上层清液，得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(s.3)将lx-1000ep加入步骤(s.2)中得到的双酶粗酶混合液中(其中，双酶粗酶混合液中含有的烯还原酶与lx-1000ep的相对用量为3.5
×
10-4
u/g，双酶粗酶混合液中含有的醇脱氢酶与lx-1000ep的相对用量为100u/g)，在恒温金属振荡仪中转速为800rpm，30℃下使得lx-1000ep与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应1h。反应结束后，抽滤滤去上层清液，用10bv的去离子水(ph＝8)分3次洗涤，再次抽滤后即得到固定化双酶树脂。固定化双酶树脂的外形如图3所示。所得固定化双酶树脂置于4℃环境中储存，也可进一步将其在-20℃冷冻2h后，使用冷冻干燥机在-50℃的温度下冷冻干燥48h，所得固定化双酶树脂可在-4℃长期保存。
[0040]
本实施例中还提供一种如上所述的固定化双酶树脂在不对称加氢还原4-丙基呋喃-2(5h)-酮中的应用。催化反应方程式如图1所示。
[0041]
一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，包括以下步骤：取上述步骤(s.3)中得到的固定化双酶树脂0.4g于2ml离心管，加入100μl 2mmol/l nadp
+
，50μl异丙醇，1μl 4-丙基呋喃-2(5h)-酮，加入850μl 0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.2)，在恒温金属振荡仪中转速为800rpm，30℃下反应10h。还原反应结束后，取1ml反应液加入1ml乙酸乙酯萃取，在漩涡混合器(漩涡混合器转速为8000rpm)中震荡1min至混合均匀，离心后取上层有机相用于气相色谱分析。气相色谱图如图2所示，其中加氢底物4-丙基呋喃-2(5h)-酮和加氢产物(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的保留时间分别为5.4min和6.1min。
[0042]
作为另一种实施方式，在上述还原反应结束后，可通过过滤回收得到固定化双酶树脂，以再次用于(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备，从而实现对固定化双酶树脂的循环利用。
[0043]
实施例2本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中在步骤(s.3)中采用lx-1000epa作为树脂载体来代替lx-1000ep，其他都与实施例1中相同。
[0044]
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中在步骤(s.3)中采用lx-103b作为树脂载体来代替lx-1000ep，其他都与实施例1中相同。
[0045]
实施例4本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中在步骤(s.3)中采用es-103b作为树脂载体来代替lx-1000ep，其他都与实施例1中相同。
[0046]
实施例5本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中在步骤(s.3)中采用es-109作为树脂载体来代替lx-1000ep，其他都与实施例1中相同。
[0047]
实施例6【经戊二醛交联改性处理后的固定化双酶树脂的制备】本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中取按照实施例1中的制备方法制备得到的固定化双酶树脂进一步衍生化。配置质量百分浓度为0.5wt％的双功能交联剂戊二醛水溶液，溶剂为去离子水(ph＝8)。取上述实施例1所得的固定化双酶树脂加入该水溶液中，使得固定化双酶树脂与戊二醛进行交联反应。在恒温金属振荡仪中30℃下交联1h，转速为800rpm。抽滤滤去上层清液，置于烧杯中用10bv的去离子水(ph＝8)分3次洗涤，抽滤滤去上层清液后，即得通过交联进一步提高了结构刚性与循环稳定性的固定化双酶树脂。其他都与实施例1中相同。
[0048]
实施例7【经戊二醛交联改性处理后的固定化双酶树脂的制备】本实施例与实施例6的区别在于：本实施例中戊二醛溶液浓度为0.1wt％，交联反应时间为0.5h，交联反应温度为25℃。其他都与实施例6中相同。
[0049]
实施例8【经戊二醛交联改性处理后的固定化双酶树脂的制备】本实施例与实施例6的区别在于：本实施例中戊二醛溶液浓度为5wt％，交联反应时间为2h，交联反应温度为35℃。其他都与实施例6中相同。
[0050]
实施例9本实施例中提供一种制备固定化双酶树脂的方法。
[0051]
一种制备如上所述的固定化双酶树脂的方法，包括以下步骤：(s.1)选取产烯还原酶重组大肠杆菌(escherichia coli)(参考发明专利cn112143764b)和产醇脱氢酶的重组大肠杆菌(e.coli)(参考发明专利cn112143764b)，根据已公开的(参考发明专利cn112143764b)方法进行接种发酵，获得烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液。将烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液按最终菌体浓度比例1:1混合均匀，用柜式离心机以转速4400rpm离心30min后，弃去上层清液并收集细胞，得到混合发酵双酶液；(s.2)向步骤(s.1)中得到的混合发酵双酶液中加入与发酵液等体积的20mmol/l
磷酸盐缓冲液(ph＝6)，其中磷酸盐缓冲液中需添加1mmol/l的氯化镁，在漩涡混合器中转速8000rpm的条件下，震荡10min至均匀混合，得到细胞悬浊液。使用高压均质机在4℃、800bar的条件下破碎重悬后的细胞悬浊液，循环破碎2次，得到细胞破碎液。然后用柜式离心机以转速4400rpm离心30min，去除沉淀并收集上层清液，得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(s.3)将lx-1000ep加入步骤(s.2)中得到的双酶粗酶混合液中(其中，双酶粗酶混合液中含有的烯还原酶与lx-1000ep的相对用量为1
×
10-5
u/g，双酶粗酶混合液中含有的醇脱氢酶与lx-1000ep的相对用量为10u/g)，在恒温金属振荡仪中转速为800rpm，10℃下使得lx-1000ep与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应5h。反应结束后，抽滤滤去上层清液，用10bv的去离子水(ph＝8)分3次洗涤，再次抽滤后即得到固定化双酶树脂。所得固定化双酶树脂置于4℃环境中储存，也可进一步将其在-20℃冷冻2h后，使用冷冻干燥机在-50℃的温度下冷冻干燥48h，所得固定化双酶树脂可在-4℃长期保存。
[0052]
本实施例中还提供一种如上所述的固定化双酶树脂在不对称加氢还原4-丙基呋喃-2(5h)-酮中的应用。
[0053]
一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，包括以下步骤：取上述步骤(s.3)中得到的固定化双酶树脂0.01g于2ml离心管，加入100μl 1mmol/l nadp
+
，10μl异丙醇，0.1μl 4-丙基呋喃-2(5h)-酮，加入890μl 0.02mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝6)，在恒温金属振荡仪中转速为800rpm，5℃下反应120h。还原反应结束后，取1ml反应液加入1ml乙酸乙酯萃取，在漩涡混合器(漩涡混合器转速为8000rpm)中震荡1min至混合均匀，离心后取上层有机相用于气相色谱分析。作为另一种实施方式，在上述还原反应结束后，可通过过滤回收得到固定化双酶树脂，以再次用于(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备，从而实现对固定化双酶树脂的循环利用。
[0054]
实施例10本实施例中提供一种制备固定化双酶树脂的方法。
[0055]
一种制备如上所述的固定化双酶树脂的方法，包括以下步骤：(s.1)选取产烯还原酶重组大肠杆菌(escherichia coli)(参考发明专利cn112143764b)和产醇脱氢酶的重组大肠杆菌(e.coli)(参考发明专利cn112143764b)，根据已公开的(参考发明专利cn112143764b)方法进行接种发酵，获得烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液。将烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液按最终菌体浓度比例10:1混合均匀，用柜式离心机以转速4400rpm离心30min后，弃去上层清液并收集细胞，得到混合发酵双酶液；(s.2)向步骤(s.1)中得到的混合发酵双酶液中加入与发酵液等体积的2000mmol/l磷酸盐缓冲液(ph＝9)，其中磷酸盐缓冲液中需添加100mmol/l的氯化镁，在漩涡混合器中转速8000rpm的条件下，震荡10min至均匀混合，得到细胞悬浊液。使用高压均质机在4℃、800bar的条件下破碎重悬后的细胞悬浊液，循环破碎2次，得到细胞破碎液。然后用柜式离心机以转速4400rpm离心30min，去除沉淀并收集上层清液，得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(s.3)将lx-1000ep加入步骤(s.2)中得到的双酶粗酶混合液中(其中，双酶粗酶混合液中含有的烯还原酶与lx-1000ep的相对用量为1
×
10-2
u/g，双酶粗酶混合液中含有的醇脱氢酶与lx-1000ep的相对用量为1000u/g)，在恒温金属振荡仪中转速为800rpm，40℃下使
得lx-1000ep与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应24h。反应结束后，抽滤滤去上层清液，用10bv的去离子水(ph＝8)分3次洗涤，再次抽滤后即得到固定化双酶树脂。所得固定化双酶树脂置于4℃环境中储存，也可进一步将其在-20℃冷冻2h后，使用冷冻干燥机在-50℃的温度下冷冻干燥48h，所得固定化双酶树脂可在-4℃长期保存。
[0056]
本实施例中还提供一种如上所述的固定化双酶树脂在不对称加氢还原4-丙基呋喃-2(5h)-酮中的应用。
[0057]
一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，包括以下步骤：取上述步骤(s.3)中得到的固定化双酶树脂1.0g于2ml离心管，加入100μl 100mmol/lnadp
+
，200μl异丙醇，100μl4-丙基呋喃-2(5h)-酮，加入600μl 2mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝9)，在恒温金属振荡仪中转速为800rpm，37℃下反应24h。还原反应结束后，取1ml反应液加入1ml乙酸乙酯萃取，在漩涡混合器(漩涡混合器转速为8000rpm)中震荡1min至混合均匀，离心后取上层有机相用于气相色谱分析。
[0058]
作为另一种实施方式，在上述还原反应结束后，可通过过滤回收得到固定化双酶树脂，以再次用于(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备，从而实现对固定化双酶树脂的循环利用。
[0059]
【性能测试】【实验1】不同固定化双酶树脂的酶活回收以及比酶活测定分别按照实施例1～5中的制备方法获取固定化双酶树脂催化制备(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的反应液并用于气相色谱分析，然后根据获得的气相色谱图，采用面积归一法分别计算产物浓度。将固定化双酶树脂的比酶活定义为每克固定化双酶树脂所具有的酶活力。计算得到固定化双酶树脂的比酶活，其公式如下：不同固定化双酶树脂的比酶活结果如下表1所示。
[0060]
表1不同固定化双酶树脂的比酶活载体名称lx-1000eplx-1000epalx-103bes-103bes-109比酶活(u/g)7.0
×
10-4
6.5
×
10-4
4.3
×
10-44×
10-4
1.9
×
10-4
[0061]
从表1中数据分析可知：树脂载体选用lx-1000ep和lx-1000epa制备得到的固定化双酶树脂的比酶活最高，其比酶活分别为7.0
×
10-4
u/g和6.5
×
10-4
u/g。
[0062]
【实验2】不同固定化双酶树脂的蛋白载量、蛋白回收测定分别按照实施例1～5中的制备方法制备固定化双酶树脂并对其蛋白载量、蛋白回收率进行测定。分别按照实施例1～5中的制备方法取固定化前的双酶粗酶混合液和固定化反应后抽滤得到的滤液，稀释1000倍后，各取20μl与200μl考马斯亮蓝g250混合，静置5min后，紫外可见分光光度计595nm下测定其总蛋白的吸光度，与bsa蛋白标曲比较计算得不同固定化双酶树脂的蛋白回收和蛋白载量。不同固定化双酶树脂的蛋白载量以及蛋白回收结果如下表2所示。
[0063]
表2不同固定化双酶树脂的蛋白回收与蛋白载量载体名称lx-1000eplx-1000epalx-103bes-103bes-109
蛋白回收(％)44.0243.4765.2136.0634.06蛋白载量(mg/g)220.11217.36326.04180.32170.28
[0064]
从表2中数据分析可知：树脂载体选用lx-103b制备得到的固定化双酶树脂的蛋白回收与蛋白载量最高，能实现65％以上的蛋白回收，其蛋白载量为326.04mg/g。
[0065]
【实验3】双酶粗酶混合液的酶活测定取850μl按照实施例1中的制备方法制备得到的包含有烯还原酶和醇脱氢酶(4:1)的双酶粗酶混合液，加入100μl 2mmol/l nadp
+
，其溶剂为0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.2)，50μl异丙醇，1μl 4-丙基呋喃-2(5h)-酮，在恒温金属振荡仪中30℃下反应10h，转速为800rpm，取1ml反应液加入1ml乙酸乙酯萃取，在漩涡混合器中震荡1min至混合均匀，漩涡混合器转速为8000rpm，离心后取上层有机相用于气相色谱分析，底物和产物浓度可以采用面积归一法计算。1个酶活单位(u)定义为在特定条件下，1分钟转化1微摩尔底物所需的酶量。根据计算得的产物浓度计算双酶粗酶混合液的酶活，其公式如下：
[0066]
【实验4】不同批次固定化双酶树脂的的酶活回收及比酶活测定分别按照实施例1中制备方法制备得到3个批次固定化双酶树脂，分别计算3个批次固定化双酶树脂的比酶活(计算方法及公式参见实验1)。固定化双酶树脂的酶活回收定义为制备得到的固定化双酶树脂的总酶活力占用于固定化的双酶粗酶混合液总酶活的比例。分别计算3个批次固定化双酶树脂的酶活回收，计算公式如下：不同批次固定化双酶树脂的酶活回收及比酶活测定结果如下表3所示。
[0067]
表3不同批次固定化双酶树脂的酶活回收以及比酶活批次比酶活(u/g)酶活回收(％)16.40*10-4
8626.33*10-4
8536.70*10-4
90从表3中数据分析可知，本发明的固定化双酶树脂的酶活回收可达85％以上，固定化双酶树脂的比酶活达到6.33
×
10-4
u/g。同时对不同底物投料量的催化中发现，随着底物浓度增加，固定化双酶树脂的比酶活略有提升，经过168h反应后可实现5
‰
底物投料量的完全反应。
[0068]
【固定化双酶树脂的循环稳定性测定】分别将按照实施例1中以及实施例6中制备方法制备固定化双酶树脂并将反应完成后的固定化双酶树脂颗粒抽滤并滤去上层清液，将所得固定化双酶树脂置于烧杯中，用10bv的去离子水(ph＝8)分3次洗涤，分别取所得固定化双酶树脂0.4g于2ml离心管，再次加入100μl2mmol/l nadp
+
，其溶剂为0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.2)，50μl异丙醇，1μl 4-丙基呋喃-2(5h)-酮，加入850μl 0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.2)，在恒温金属振荡仪中30℃下反应10h，转速为800rpm，取1ml反应液加入1ml乙酸乙酯萃取，在漩涡混合器
中震荡1min至混合均匀，漩涡混合器转速为8000rpm，将有机相进行气相色谱分析检测，采用面积归一法处理数据，分别计算得到该循环的固定化双酶树脂的比酶活(计算方法参见实验1)。固定化双酶树脂的循环稳定性定义为第n个循环批次固定化双酶树脂的比酶活占第一个循环批次的比酶活的比例。计算得到该循环的循环稳定性，重复操作20个循环得到每一个循环的相对活性，其计算公式如下：
[0069]
最终循环稳定性实验结果：该固定化双酶树脂的循环稳定性强，第10个循环批次的相对活性为82.5％。经过戊二醛处理后的固定化双酶树脂的结构刚性有所提升，第10个循环批次的相对活性为90％，表现出良好的循环稳定性。与同类采用包埋等方法制作的固定化酶(10个循环批次的相对活性60％左右)相比其循环稳定性更好。
[0070]
【固定化双酶树脂的批次循环催化时蛋白泄露的测定】对第一个循环批次催化4-丙基呋喃-2(5h)-酮后的反应液用考马氏亮蓝r250分析，测定蛋白泄露情况，结果发现r250上无蛋白条带，说明该共价连接的固定化双酶树脂能使负载蛋白几乎不发生泄露。
[0071]
【固定化双酶树脂的溶胀性测定】固定化双酶树脂的溶胀性定义为在水溶液中静置一段时间后固定化双酶树脂体积的膨胀程度，取按照实施例1中的制备方法制备得到的固定化双酶树脂0.4g于2ml ep管内，加入1ml0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.2)，静置30d，抽滤滤去上层清液后测定其固定化双酶树脂的粒径，计算其溶胀率，其计算公式如下：经测定静置30d后该固定化双酶树脂的溶胀率小于5％，与其他凝胶等固定化材料相比，载体刚性强，溶胀率低。
[0072]
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种固定化双酶树脂，其特征在于，包括树脂载体以及连接在所述树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。2.根据权利要求1所述的一种固定化双酶树脂，其特征在于，所述树脂载体为环氧树脂、伯氨基树脂中的任意一种或两种的组合。3.根据权利要求2所述的一种固定化双酶树脂，其特征在于，所述环氧树脂中包含有如下式(1)、式(2)中的任意一种或两种的组合的环氧官能团：4.根据权利要求2或3所述的一种固定化双酶树脂，其特征在于，所述环氧树脂为lx-1000ep环氧树脂、lx-1000epa环氧树脂、lx-103b环氧树脂、es-103b环氧树脂、es-109环氧树脂中的任意一种或多种的组合。5.一种制备如权利要求1～4中任意一项所述的固定化双酶树脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(s.1)发酵制备烯还原酶发酵液和醇脱氢酶发酵液并混合均匀得到混合发酵双酶液；(s.2)将步骤(s.1)中得到的混合发酵双酶液破碎、重悬、离心后得到包含有烯还原酶和醇脱氢酶的双酶粗酶混合液；(s.3)将树脂载体加入步骤(s.2)中得到的双酶粗酶混合液中，使得树脂载体与烯还原酶和醇脱氢酶交联反应，得到固定化双酶树脂。6.根据权利要求5所述的一种制备固定化双酶树脂的方法，其特征在于，所述步骤(s.3)中双酶粗酶混合液中含有的烯还原酶与树脂载体的相对用量为1
×
10-5
～1
×
10-2
u/g，双酶粗酶混合液中含有的醇脱氢酶与树脂载体的相对用量为10～1000u/g；所述步骤(s.3)中反应时间为1～24h，反应温度为10～40℃。7.一种如权利要求1～4中任意一项所述的固定化双酶树脂在不对称加氢还原4-丙基呋喃-2(5h)-酮中的应用。8.一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在如权利要求1～4中任意一项所述的固定化双酶树脂的催化下，将4-丙基呋喃-2(5h)-酮进行还原反应，得到(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮。9.根据权利要求8所述的一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，其特征在于，所述4-丙基呋喃-2(5h)-酮的浓度为0.1～100g/l。10.根据权利要求8所述的一种(r)-二氢-4-丙基-2(3h)-呋喃酮的制备方法，其特征在于，在所述还原反应过程中需加入nadp
+
，所述nadp
+
的浓度为1mmol/l～100mmol/l；在所述还原反应过程中需添加异丙醇，所述异丙醇的浓度为1～20wt％；在所述还原反应过程中固定化双酶树脂的添加量为1～50wt％。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用。本发明的固定化双酶树脂简单、酶活回收率高达90％以上、蛋白回收效率达65％。多次使用后固定化双酶树脂的活力剩余高、转化率高，蛋白载量可达250mg/g，明显高于已有报道的通过包埋(20mg/g)等固定化方法的蛋白载量。本发明的固定化双酶树脂酶活高、循环稳定性高、有效提高辅酶的循环利用，具有机械强度高、生物相容性好、环境耐受性强、不易失活、稳定性高的优良特性。本发明的固定化双酶树脂用于催化制备(R)-二氢-4-丙基-2(3H)-呋喃酮具有产物选择性高、工艺操作简单、固废和产品损失低、产品收率高，有效降低反应成本等优势。低反应成本等优势。低反应成本等优势。


技术研发人员：陈小龙 朱林江 卢昶鑫 陈翰驰
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/4