一种基于纤维蛋白原的贴片及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种基于纤维蛋白原的贴片及其制备方法和应用，属于医学组织工程领域。


背景技术：

2.创伤后或手术期间发生无法控制的出血是全球死亡的主要原因，导致每年200万多人的死亡。对于外科手术操作中使失血最小化、封闭组织和器官结构，减少外科手术后并发症以及手术室中手术时间是很必要和关键的。伤口敷料和组织粘合剂是用于防止血液和其他体液渗漏的装置。
3.目前常用的外科手术止血剂，包括纤维蛋白胶、明胶和氧化纤维素。其中，由于纤维蛋白胶具有良好的促凝血性能和生物相容性，是最广泛使用的止血剂之一。其作用机制是模拟人体自体凝血反应过程的最后一步酶级联反应，利用凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，交联成纤维蛋白胶网络以封堵伤口，起到止血作用。纤维蛋白胶机械强度的黏附性能较差，无法实现对创伤湿态组织的高效黏附和封闭。虽然纤维蛋白胶具有较高的促凝血性能，但止血效果不是很理想。那么，如何增强纤维蛋白凝胶的机械强度，是解决止血性能弱的关键挑战。
4.纤维蛋白胶的物理机械强度，取决于纤维蛋白单体的结构、纤维蛋白胶交联网状结构及交联程度。纤维蛋白原是一个分子量为340kda的低聚糖蛋白，由两个对称的半部分组成，每半部分包含aα、bβ和γ三个多肽链。纤维蛋白原被凝血酶剪切释放肽链fpa和fpb，形成的纤维蛋白单体暴露的氨基酸残基，与另一纤维蛋白单体互补形成“纽扣-孔相互作用(knob-hole interaction)”，最终延伸、交替、重叠形成纤维蛋白胶交联网状结构。目前，改善纤维蛋白胶机械强度的手段主要包括：调控纤维蛋白原和凝血酶的浓度、引入填充的蛋白质。第一，据文献报道，凝血酶的浓度会影响纤维蛋白形成的纤维丝粗细，关系着纤维蛋白胶的机械强度。最初，研究者们通过调节纤维蛋白胶中纤维蛋白原和凝血酶的浓度，来改善机械性能。因此，目前商品纤维蛋白胶(tisseel，evicel，hemaseel等)的纤维蛋白原和凝血酶浓度均有差异，但是黏附的机械性能并未得到明显的提升。第二，科学家们通过在凝胶网络中引入蛋白质来提升水凝胶的整体力学性能。研究者们通过添加胶原蛋白、明胶的方式(如costasis等)作为纤维蛋白胶网络结构的填充材料，对机械强度虽有改善但提升仍然有限。此外，也有将纤维蛋白原和凝血酶固定在载体上，来改善机械性能。tachosil fibrin sealant patch是一种将人纤维蛋白原和凝血酶负载在马胶原蛋白海绵的密封剂。tachosil应用出血或者其他体液区域时，水分会使得凝血酶剪切纤维蛋白原，快速形成纤维蛋白胶的凝块，粘合在组织表面，用于实现止血和密封伤口的作用。但是，海绵吸收水分用于溶解纤维蛋白原是一个比较费时的过程，不利于快速封堵含血液的伤口；同样地，其性能仍然主要依赖于纤维蛋白胶自身的机械性能，对整体止血和密封性能提升有限。根据文献报道，在猪肝损伤出血模型(10mm直径，10mm深的缺口)，使用tachosil贴片按压伤口3min后，并没有成功封堵伤口，血液仍然持续流出(nature biomedical engineering 5,1131
–
1142(2021))。因此，纤维蛋白原/胶虽然具有优异的促凝血性能和生物相容性能，但是其机械强度(本体自身强度和黏附性能)并未在现有技术改进下产生明显的提升。
5.为了实现纤维蛋白原/胶的止血性能突破，其关键在于：如何调控纤维蛋白原/胶自身的组成和结构以提升其机械强度及黏附性能？


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种基于纤维蛋白原的贴片及其制备方法和应用，本发明意外地用简单的方法得到一种全新的组织贴片，通过结构的改进使得所述的贴片具有优异的机械强度和黏附性能，能够更好地应用于止血或组织粘合，能够快速高效实现封闭。
7.本发明采用如下的技术方法：
8.一种基于纤维蛋白原的贴片，所述贴片包含纤维蛋白原和稳定剂，所述纤维蛋白原的部分赖氨酸残基含有疏水性基团；所述稳定剂用于保持纤维蛋白原的活性。
9.上述技术方案中，所述的稳定剂用于保持纤维蛋白原的活性不仅指保持纤维蛋白原的空间结构和生物活性；还包括保持贴片状态下以及在制作贴片过程中纤维蛋白原的稳定性。所述的稳定剂通常可以为氯化钠，氯化钙，氯化钾，氯化镁，柠檬酸钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，盐酸精氨酸，甘氨酸的一种或多种。
10.所述疏水性基团是包含有羰基、碳碳双键、酯基、酰胺键、苯基的一种或多种基团的烃基。
11.作为优选，所述的疏水性基团为-co-(ch2)nch3，n＝1-19；更优选的，所述的疏水性基团为-co-(ch2)nch3，n＝2-10；最优选的，所述的疏水性基团为-co-(ch2)nch3，n＝3-6。
12.作为优选，所述疏水性基团与纤维蛋白原赖氨酸残基的伯胺形成酰胺键(-nh-co-)。
13.所述纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的2％-70％，按数量计；所述的赖氨酸残基总数为含有疏水性基团的赖氨酸残基与未修饰的赖氨酸残基的和。
14.作为优选，纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的5％-40％；更优选的，纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的10％-30％。
15.所述纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的比例需要在特定范围，才能确保微观层面含疏水性基团的纤维蛋白原分子相互缠结作用，使得纤维蛋白原贴片的机械性能在宏观层面上得以体现。若纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的比例过低，如低于2％，则在宏观层面纤维蛋白原贴片相对于未修饰的纤维蛋白原贴片的力学性能并没有明显变化。若纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的比例高于70％，由于蛋白质表面大量碱性氨基酸(赖氨酸)被取代，会导致纤维蛋白原蛋白质变性和空间结构不稳定，最终导致贴片力学性能变差，甚至不及原未修饰型的纤维蛋白原。因此，特定比例的赖氨酸残基修饰程度，有利于实现修饰型纤维蛋白原的高力学性能。
16.所述贴片每平方厘米不少于含有2mg含疏水性基团的纤维蛋白原。作为优选，所述
co-)。
33.本发明还提供一种基于纤维蛋白原贴片的应用，所述的贴片可用于组织粘合。
34.所述的贴片用于止血；所述止血可用于心血管、肝脏、胰脏、甲状腺手术中止血；所述贴片与组织和/血液接触时可发生凝血反应而随后形成凝块，并且基于纤维蛋白原分子间强相互作用与附近组织具有强的粘合能，这两方面的协同作用可以有效防止、减少或者停止出血。
35.所述的贴片用于接合结构和/或封闭生理渗漏；用于脑脊液、淋巴、胆汁、胃肠内容物的渗漏，用于肺的空气渗漏。
36.所述的贴片用于受损组织的修复，所述的受损组织是指组织结构的正常连续性的破坏，诸如由外科手术、生物或者化学手段引起的切口；还包含挫伤组织，以及例如通过撕裂、压力和啃咬引起的切伤、刺伤、撕裂伤、开放性损伤、穿透性损伤、穿刺性损伤。
37.相对于现有技术，本发明具有以下优点：
38.1、本发明首次意外制备得到了一种全新的纤维蛋白原贴片，所述贴片包括含疏水性基团的纤维蛋白原，含疏水性基团的纤维蛋白原相对野生型(未修饰)的纤维蛋白原具有强的分子间相互作用，疏水性基团促进纤维蛋白原蛋白质分子之间相互缠结，形成贴片具有超强的机械性能和黏附性能。
39.2、本发明提供的纤维蛋白原贴片是不依赖外加凝血酶的作用，自身形成纤维蛋白原贴片。现有技术中纤维蛋白原/胶在组织密封和止血的应用，都是基于纤维蛋白原与凝血酶反应，未见单独使用纤维蛋白原即可发挥组织密封的相关作用。不依赖外加的凝血酶，可以降低材料的成本，杜绝酶储存困难的问题。现有的技术都是依赖于将纤维蛋白原和凝血酶溶解形成溶液，或者吸收水分溶解，一般溶解过程都是费时且复杂的，需要提前准备。本发明所述的贴片，可以在实际应用过程中随用随取。
40.3、本发明提供的基于疏水性基团的纤维蛋白原贴片具有良好的生物活性，能促进细胞的增殖和分化，有利于伤口的愈合和缺损组织的恢复；可以通过改变疏水性基团的成分来调节贴片的降解速度，从而满足自体组织器官的再生速度。
41.4、本发明所使用的制备方法操作方便，工艺简单；所得贴片使用方便，可以根据伤口的大小需要进行裁剪。
附图说明
42.图1实施例1纤维蛋白原贴片的扫描电子显微镜图；
43.图2分子动力学模拟未修饰的纤维蛋白原分子相互作用、本发明所述的含疏水性基团的纤维蛋白原分子相互作用，对比可看出含疏水性基团的纤维蛋白原分子发生强的相互作用，诱导分子的缠结；
44.图3未修饰的纤维蛋白原和本发明所述实施例1的含疏水性基团的纤维蛋白原被凝血酶识别形成纤维蛋白凝胶的时间；
45.图4实施例1、对比实施例1和对比实施例4的surgicel fibrillar产品对应的ph和体外细胞毒性；
46.图5实施例1、对比实施例1和对比实施例4的3种手术粘合剂产品(fibrin glue、surgicel fibrillar、gelatin sponge)的剪切强度；
47.图6实施例1、对比实施例1和对比实施例4的3种手术粘合剂产品(fibrin glue、surgicel fibrillar、gelatin sponge)的粘合能；
48.图7实施例1和对比实施例4的手术粘合剂产品(surgicel fibrillar、gelatin sponge)的新西兰大白兔肝部止血时间和失血量；
49.图8实施例1和对比实施例4的4种紧急止血产品(combat gauze、hemcon、celox、chitosam)的新西兰大白兔肝部止血时间和失血量；
具体实施例
50.下面结合具体实施例对本发明要解决的技术问题、技术方案和有益效果进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前体下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
51.本发明提供一种具有优异机械性能和黏附性能的纤维蛋白原贴片，所述贴片包含纤维蛋白原和稳定剂，所述纤维蛋白原的部分赖氨酸残基含有疏水性基团。纤维蛋白原表面赖氨酸残基疏水性基团修饰，在溶液状态，由于水分子的参与(静电作用、氢键等)，大部分疏水基团的范德华相互作用被破坏。在除去水形成贴片过程中，疏水链之间的范德华作用由于距离靠近相互作用增强，导致纤维蛋白原贴片具有强的机械性能和黏附性能。所述的稳定剂为氯化钠，氯化钙，柠檬酸钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，盐酸精氨酸，甘氨酸的一种或多种。
52.所述的稳定剂是为了保持纤维蛋白原的空间结构和生物活性。所述的稳定剂是为了保持贴片状态纤维蛋白原的稳定性，也是为了保持制备贴片过程中纤维蛋白原的稳定性。所述的稳定剂是在制备贴片中配制纤维蛋白原溶液时引入。
53.剪切强度测试：参照美国材料与试验协会标准(astm f2255-05)。将纤维蛋白原的贴片加入到新鲜猪皮表面，贴片的面积为10
×
20mm，将另一猪皮在贴片表面放置粘合，保持两片猪皮在贴片部位重叠。采用万能材料试验机在5mm/min应变速率条件下测试样品的剪切强度。
54.粘合能测试：参照美国材料与试验协会标准(astm f2256-05)。将纤维蛋白原的贴片加入到新鲜猪皮表面，贴片的面积为15
×
35mm，将另一猪皮在贴片表面对齐放置。采用万能材料试验机在5mm/min应变速率条件下测试样品的粘合性能。
55.新西兰大白兔肝部止血实验：采用新西兰大白兔(2.5～3kg)的肝叶，在肝脏表面切开一个长10mm深5mm的切口，自由出血10s记录前出血量。将贴片加到肝切口表面，按压15s。评价对创伤出血的伤口封闭状态、止血时间和失血量。
56.实施例1
57.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
58.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m的n-(己酰氧基)琥珀酰亚胺，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
59.③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在4℃条件下，透析72h；
60.④
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温
度为37℃；再进行冷冻干燥，得到纤维蛋白原的贴片。
61.所述含疏水性基团的纤维蛋白原溶液中疏水改性试剂(n-(己酰氧基)琥珀酰亚胺)与纤维蛋白原溶液不是属于简单的混合物，而是与纤维蛋白原表面赖氨酸残基的伯胺反应形成稳定的酰胺键，结合在纤维蛋白原分子上。
62.本实施例制备得到的贴片微观结构如图1所示，其表面具有孔状结构。贴片中纤维蛋白原的疏水性基团为-co-(ch2)4ch3，与纤维蛋白原表面赖氨酸残基的伯胺反应形成酰胺键(-nh-co-)。疏水链之间的范德华作用由于距离靠近相互作用增强诱导蛋白质分子间缠结(图2)，使得贴片具有强的机械性能和黏附性能。本实施例中贴片的稳定剂是na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl。为了便于比较不同实施例与对比实施例的机械性能，以下制备过程的稳定剂保持相同。同时，本发明中稳定剂还可以为氯化钠，氯化钙，氯化钾，氯化镁，柠檬酸钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，盐酸精氨酸，甘氨酸的一种或多种。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg含疏水性基团的纤维蛋白原。
63.实施例1贴片的粘合能为160j/m2，剪切强度为8750pa。此外，未修饰的纤维蛋白原和本发明所述含疏水性基团的纤维蛋白原被凝血酶催化形成纤维蛋白凝胶的时间相近，说明修饰后的纤维蛋白原保留被凝血酶识别的能力(图3)。所述贴片具有合适的ph值和低细胞毒性(图4)；将其植入大鼠肝脏伤口区域28天后，伤口愈合良好。
64.实施例2
65.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
66.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m的2,5-二氧代吡咯烷-1-基十二酸酯，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应5h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
67.③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在4℃条件下，透析72h；
68.④
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；再进行冷冻干燥，得到纤维蛋白原的贴片。
69.本实施例贴片中纤维蛋白原的疏水性基团为-co-(ch2)
10
ch3，与纤维蛋白原表面赖氨酸残基的伯胺反应形成酰胺键(-nh-co-)。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg含疏水性基团的纤维蛋白原。粘合能为175j/m2，剪切强度为10320pa。所述贴片具有合适的ph值和低细胞毒性；将其植入大鼠肝脏伤口区域28天后，伤口愈合良好。
70.实施例3
71.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
72.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m的甲基丙烯酸n-羟琥珀酸亚胺酯，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应3h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
73.③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在25℃条件下，透析24h；
74.④
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为4℃；再进行冷冻干燥，得到纤维蛋白原的贴片。
75.本实施例贴片中纤维蛋白原的疏水性基团为-co-ch(ch3)＝ch2，含有碳碳双键，与纤维蛋白原表面赖氨酸残基的伯胺反应形成酰胺键(-nh-co-)。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg含疏水性基团的纤维蛋白原。粘合能为146j/m2，剪切强度为7320pa。所述
贴片具有合适的ph值和低细胞毒性；将其植入大鼠肝脏伤口区域28天后，伤口愈合良好。
76.实施例4
77.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
78.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m的2,5-dioxopyrrolidin-1-yl methyl glutarate(2，5-二氧代吡咯烷-1-基甲基戊二酸酯)，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应3h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
79.③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在25℃条件下，透析24h；
80.④
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；再进行冷冻干燥，得到纤维蛋白原的贴片。
81.本实施例贴片中纤维蛋白原的疏水性基团为-co-(ch2)
3-cooch3，含有酯基，与纤维蛋白原表面赖氨酸残基的伯胺反应形成酰胺键(-nh-co-)。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg含疏水性基团的纤维蛋白原。粘合能为156j/m2，剪切强度为8568pa。所述贴片具有合适的ph值和低细胞毒性；将其植入大鼠肝脏伤口区域28天后，伤口愈合良好。
82.实施例5
83.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
84.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m的1-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)8-methyl octanedioate(1-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)8-甲基辛二酸酯)，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应3h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
85.③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在25℃条件下，透析24h；
86.④
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；再进行冷冻干燥，得到纤维蛋白原的贴片。
87.本实施例贴片中纤维蛋白原的疏水性基团为-co-(ch2)
5-cooch3，含有酯基，与纤维蛋白原表面赖氨酸残基的伯胺反应形成酰胺键(-nh-co-)。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg含疏水性基团的纤维蛋白原。粘合能为159j/m2，剪切强度为8850pa。所述贴片具有合适的ph值和低细胞毒性；将其植入大鼠肝脏伤口区域28天后，伤口愈合良好。
88.对比实施例1
89.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
90.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl的pbs溶液，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到未修饰的纤维蛋白原溶液；
91.③
将所得未修饰的纤维蛋白原溶液在4℃条件下，透析72h。
92.④
将所得未修饰的纤维蛋白原溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；然后进行冷冻干燥，得到未修饰的纤维蛋白原贴片(未修饰的纤维蛋白原在冻干过程中，分子间相互作用相对弱，形成的贴片不成形)。
93.对比实施例1相对与实施例1的区别是，没有疏水性基团修饰。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg的纤维蛋白原。
94.粘合能为10j/m2，剪切强度为1233pa。未修饰的纤维蛋白原贴片的机械性能和黏
附性能远低于本发明所述的贴片(图5和图6)。由此说明，疏水性基团修饰是本发明所述纤维蛋白原贴片性能提升的关键因素。
95.对比实施例2
96.(1)含疏水性基团的纤维蛋白原溶液：
97.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
98.②
在避光条件下，向所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m的n-(己酰氧基)琥珀酰亚胺，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
99.③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在4℃条件下，透析72h。
100.(2)未修饰的纤维蛋白原溶液：
101.①
取质量分数为100mg/ml纤维蛋白原溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
102.②
在避光条件下，将所述纤维蛋白原溶液在搅拌条件下滴加入200μl的pbs溶液，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到未修饰的纤维蛋白原溶液；
103.③
将所得未修饰的纤维蛋白原溶液在4℃条件下，透析72h。
104.含疏水性基团的纤维蛋白原溶液的粘合能为7.5j/m2，剪切强度为800pa。本发明实施例1贴片的力学性能远优于本例得到的含疏水性基团的纤维蛋白原溶液，说明本发明需要形成贴片才能达到优异的力学效果。一方面，本发明所述的贴片可以通过吸水作用增加与组织的黏附性能；另一方面，在除去水形成贴片制备过程中，疏水链之间的范德华作用由于距离靠近相互作用增强，促使纤维蛋白原贴片具有强的机械性能。本发明所述的贴片形式对其总体性能具有重要的作用。
105.未修饰的纤维蛋白原溶液的粘合能为6.5j/m2，剪切强度为750pa。可见，含疏水性基团的纤维蛋白原溶液与未修饰的纤维蛋白原溶液，在溶液粘度和机械性能方面均无明显区别。
106.对比实施例3
107.(1)含疏水性基团修饰的明胶贴片和未修饰的明胶贴片
108.含疏水性基团修饰的明胶贴片：
109.①
取质量分数为100mg/ml明胶溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
110.②
在避光条件下，向所述明胶溶液在搅拌条件下滴加入200μl 0.4m n-(己酰氧基)琥珀酰亚胺，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到含疏水性基团的明胶溶液；
111.③
将所得含疏水性基团的明胶溶液在37℃条件下，透析72h；
112.④
将所得含疏水性基团的明胶溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；再进行冷冻干燥，得到疏水性基团修饰的明胶贴片。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg的修饰型明胶。
113.未修饰的明胶贴片：
114.①
取质量分数为100mg/ml明胶溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
115.②
在避光条件下，向所述明胶溶液在搅拌条件下滴加入200μl的pbs溶液，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到未修饰的明胶溶
液；
116.③
将所得未修饰的明胶溶液在37℃条件下，透析72h；
117.④
将所得未修饰的明胶溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；再进行冷冻干燥，得到未修饰的明胶贴片。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg的明胶。
118.(2)含疏水性基团修饰的白蛋白贴片和未修饰的白蛋白贴片
119.含疏水性基团修饰的白蛋白贴片：
120.①
取质量分数为100mg/ml牛血清白蛋白溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
121.②
在避光条件下，将所述牛血清白蛋白溶液在搅拌条件下滴加入200μl0.4m的n-(己酰氧基)琥珀酰亚胺，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到含疏水性基团的白蛋白溶液；
122.③
将所得含疏水性基团的白蛋白溶液在4℃条件下，透析72h；
123.④
将所得含疏水性基团的白蛋白溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；然后进行冷冻干燥，得到疏水性基团修饰的白蛋白贴片。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg的修饰型白蛋白。
124.未修饰的白蛋白贴片：
125.①
取质量分数为100mg/ml牛血清白蛋白溶液(pbs缓冲溶液)，搅拌、超声分散均匀；
126.②
在避光条件下，向所述牛血清白蛋白溶液在搅拌条件下滴加入200μl的pbs溶液，涡旋5min和超声5min三重混匀工艺下进行分散，在37℃条件下，反应4h，得到未修饰的白蛋白溶液；
127.③
将所得未修饰的白蛋白溶液在4℃条件下，透析72h；
128.④
将所得未修饰的白蛋白溶液进行冷冻，浓缩至100mg/ml，浓缩的温度为37℃；再进行冷冻干燥，得到未修饰的白蛋白贴片。本实施例制备的贴片每平方厘米含有20mg的白蛋白。
129.该对比实施例中含疏水性基团修饰的明胶贴片和未修饰的明胶贴片，与含疏水性基团修饰的白蛋白贴片和未修饰的白蛋白贴片，在疏水基团修饰前后的贴片机械性能和组织黏附性能均无明显改变。并且，不管修饰前的明胶和白蛋白，还是修饰后的明胶和白蛋白，冻干后并未真正形成贴片结构，而是粉末状，不是本发明所述的贴片。
130.由此说明，疏水性基团修饰到纤维蛋白原分子上，冻干后能形成贴片，而不是粉末状，并且冻干后的纤维蛋白原具有强的机械性能。在同样的条件下，明胶和白蛋白并不能产生相应的现象。我们推测，纤维蛋白原贴片的形态和机械性能增强与其自身的组成特点有关。纤维蛋白原由两个对称的半部分组成，每半部分包含aα、bβ和γ三个多肽链，是一个线状结构的蛋白质分子。由于其特殊的组成和结构，经疏水性基团修饰后，得到了机械性能意想不到的提升。
131.对比实施例4
132.商业途径购买的3种手术粘合剂产品(可吸收性)：强生surgicel fibrillar、上海莱士纤维蛋白胶fibrin glue、祥恩明胶海绵gelatin sponge；
133.商业途径购买的4种紧急止血产品(不可吸收性、体外使用)：quikclot作战纱布
combat gauze(高岭土浸渍到纱布)、celox gauze hemostat(壳聚糖层压到纱布)、chitosam 100(用壳聚糖纺制成的无纺布)、hemcon chitogauze(壳聚糖负载到纱布)。
134.该对比实施例所选取的3种手术粘合剂产品是现有技术中应用广泛，且在现有同类产品中性能较好的手术粘合剂；选取的4种紧急止血产品是日常意外事故、战争、自然灾害中用于大出血的主要代表。不管是现有的手术粘合剂产品，还是紧急止血材料，它们的组织黏附性能和止血性能都有待于进一步提高。
135.将实施例1、对比实施例1和对比实施例4的3种手术粘合剂产品(可吸收性、体外使用；fibrin glue、surgicel fibrillar、gelatin sponge)进行比较，可以发现，本发明所述的纤维蛋白原贴片在剪切强度和粘合能都明显高于对比实施例1和对比实施例4的3种手术粘合剂产品(图5和图6)。同时，本发明所述的贴片在机械性能上，也显著优于商品的纤维蛋白胶(fibrin glue)，有望成为一种新型的组织密封剂。
136.在新西兰大白兔肝部止血实验(手术创伤模型)，对相同/相近形式(贴片/海绵)的密封剂的止血功能进行对比。本发明所述的纤维蛋白原贴片(实施例1)与对比实施例1(未修饰的纤维蛋白原贴片)和对比实施例4的手术粘合剂产品(surgicel fibrillar、gelatin sponge)比较，由于本发明所述的纤维蛋白原贴片具有优异的机械强度和黏附性能，表现出更短的止血时间和更少的失血量，表现出优异的止血性能(图7)。
137.将实施例1和对比实施例4的4种紧急止血产品(不可吸收性、体外使用；combat gauze、hemcon、celox、chitosam)进行比较。这4种紧急止血产品都被推荐用于大出血情况下的止血，原理主要依赖材料自身的促凝血性能，但止血效率有待进一步提高。本发明所述的纤维蛋白原贴片具有优异的机械强度和黏附性能，能在出血损伤部位有很好的粘合作用，因此止血性能方面明显优于紧急止血产品combat gauze、hemcon、celox和chitosam(图8)。
138.综上，本发明所述的纤维蛋白原贴片在黏附性能和止血性能两个方面，都明显优于现有技术中的手术粘合剂产品和紧急止血产品。同时，本发明意外发明得到的贴片具有良好的生物相容性，可以被人体吸收。本发明所述贴片在性能和安全性两个层面都表现优异，在临床应用中具有巨大的潜力。

技术特征：
1.一种基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述贴片包含纤维蛋白原和稳定剂，所述纤维蛋白原的部分赖氨酸残基含有疏水性基团；所述稳定剂用于保持纤维蛋白原的活性。2.根据权利要求1所述的基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述疏水性基团是包含有羰基、碳碳双键、酯基、酰胺键、苯基的一种或多种基团的烃基。3.根据权利要求1所述的基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述疏水性基团与纤维蛋白原赖氨酸残基的伯胺形成酰胺键(-nh-co-)。4.根据权利要求1所述的基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述纤维蛋白原上含有疏水性基团的赖氨酸残基占赖氨酸残基总数的2％-70％。5.根据权利要求1所述的基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述贴片每平方厘米含有不少于2mg含疏水性基团的纤维蛋白原。6.根据权利要求1所述的基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述的稳定剂为氯化钠，氯化钙，氯化钾，氯化镁，柠檬酸钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，盐酸精氨酸，甘氨酸的一种或多种。7.根据权利要求1所述的基于纤维蛋白原的贴片，其特征在于，所述贴片包含药物活性成分。8.权利要求1所述的一种基于纤维蛋白原贴片的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
①
将纤维蛋白原与稳定剂混合溶液进行超声处理，所得纤维蛋白原溶液的质量分数为5～200mg/ml；
②
在搅拌条件下向所述纤维蛋白原溶液中滴加入疏水改性试剂，在37℃条件下，反应0.5～5h，得到含疏水性基团的纤维蛋白原溶液；
③
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液在4～37℃条件下，透析5～72h；
④
将所得含疏水性基团的纤维蛋白原溶液进行冷冻干燥，得到所述基于纤维蛋白原的贴片。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的疏水改性试剂中含有疏水性基团，所述的疏水性基团用于修饰到纤维蛋白原赖氨酸残基上；所述的疏水性改性试剂中还包含琥珀酰亚胺基团，所述的琥珀酰亚胺基团用于与赖氨酸残基的伯胺反应，形成稳定的酰胺键。10.权利要求1所述的一种基于纤维蛋白原的贴片的应用，其特征在于，所述的贴片用于止血或组织粘合。

技术总结
本发明公开了一种基于纤维蛋白原的贴片及其制备方法和应用，所述贴片包含纤维蛋白原和稳定剂，所述纤维蛋白原的部分赖氨酸残基含有疏水性基团；所述稳定剂用于保持纤维蛋白原的活性。其制备方法包括：向纤维蛋白原溶液中滴加入疏水改性试剂，反应后进行透析，之后再进行冷冻干燥，得到所述贴片。采用该方法制得的贴片具有优异的机械强度和黏附性能，同等条件下性能明显优于现有手术粘合剂产品和紧急止血产品。该贴片具有良好的生物相容性，可以被人体吸收，在临床应用中具有巨大的潜力。在临床应用中具有巨大的潜力。在临床应用中具有巨大的潜力。


技术研发人员：毛峥伟 余丽莎 丁元
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/4