一种高产乳酰-N-岩藻糖基五糖Ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用

一种高产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种高产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。


背景技术：

2.母乳是维持、促进婴幼儿成长发育的最佳营养来源，母乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是母乳中继乳糖和脂质之后的第三大固体营养组分。hmos在婴幼儿的成长过程中发挥着重要的作用，其浓度在初乳中最高，之后在哺乳周期中含量逐渐降低，在成熟乳中约为10～15g/l，hmos为婴幼儿提供了普通配方奶粉所不能提供的独特健康益处。目前在母乳中发现了超过200种不同结构的hmos，其中乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ是母乳中五种含量最高的hmos之一。乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ(lacto-n-fucopentaoseⅰ，lnfpⅰ)是岩藻糖基化的中性母乳寡糖之一，也是母乳中继2
′‑
岩藻糖基乳糖之后第二丰富的岩藻糖基化hmo，在泌乳期女性的乳汁中浓度约为1.08～1.53g/l。
3.从结构看，乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ由l-岩藻糖通过α1,2-糖苷键连接在核心结构乳酰-n-四糖的非还原端半乳糖残基的2位上。研究表明乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ在抗病毒、免疫调节、调节肠道微生物群、抗感染和抗粘附功能方面发挥着重要作用。鉴于乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的重要生理功能，目前美国食品药物管理局对将乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ添加进婴幼儿配方奶粉及其他食品中的评估已在进行中，但是受限于目前的技术手段与生产方法，高效生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ仍面临很大的挑战，高效、经济地生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ是目前研究的重点。
4.目前，乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ可以通过化学法合成，酶法合成和细胞工厂法合成。化学法合成涉及到复杂的化学反应过程，通常需要引入和去除保护基团、反应复杂、步骤多，成本较高且存在发生其他副反应的问题，这些问题对于工业生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ是不利的。酶法合成过程需要昂贵的底物和辅因子的参与，并且酶的转化率和工业化需求无法被满足。相比之下，细胞工厂法因其底物廉价，副产物少，产率较高，成本较低，易用于工业化大规模生产。与酶法合成相比，全细胞发酵法无需对所用酶进行纯化，生产的规模、产量和效率都有所提高，利用微生物细胞以乳糖作为起始底物生物合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的技术目前是可行的。
5.细胞工厂法生物合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的路线为：乳糖
→
乳酰-n-三糖ii
→
乳酰-n-四糖
→
乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ，其中包含的三个糖基化步骤是由β1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶和α1,2-岩藻糖基转移酶，分别以尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺、尿苷二磷酸-半乳糖和鸟苷二磷酸-岩藻糖作为供体进行糖基化反应。等人通过引入源于脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)的β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶lgta和源于大肠杆菌(e.coli o55:h7)的β1,3-半乳糖基转移酶wbgo，先构建了一个生产乳酰-n-四糖的工程大肠杆菌，之后引入鸟苷二磷酸-岩藻糖合成补救途径以及源于幽门螺
杆菌(helicobacter pylori)的α1,2-岩藻糖转移酶，在摇瓶中乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量为271.6mg/l。hu等为了增强乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的生物合成，设计并重新编程了乳酰-n-四糖的代谢网络，并建立了鸟苷二磷酸-岩藻糖生物合成的新途径改善鸟苷二磷酸-岩藻糖的生物合成，乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量提高至2.11g/l。derya等使用e.coli bl21(de3)生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ时，加入第二种菌株，以便在每次发酵结束时降解副产物(乳酰-n-三糖ii和剩余的乳糖)以及代谢产生的单糖(n-乙酰葡糖胺、半乳糖和葡萄糖)，便于乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的回收。细胞工厂法高效合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ更加安全和高效，但目前报道的乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的效价仍然较低，由于单糖立体定向转移从乳糖生成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的途径性质导致生产中同时含有副产物2
′‑
岩藻糖基乳糖，通过改造宿主细胞以提高乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量以及减少副产物2
′‑
岩藻糖基乳糖的生成是十分必要的，进而满足大规模工业化生产的需求，以得到能高效生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的菌株。


技术实现要素：

6.为了解决目前存在的相关问题，本发明通过改造大肠杆菌，以甘油为唯一碳源，以乳糖为底物，开发了一个高效生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的菌株；将供体鸟苷二磷酸-岩藻糖从头合成途径和补救途径引入能高效生产乳酰-n-四糖的底盘菌株并比较了两种途径对乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ生成的影响；筛选得到一个高底物特异性的源于大肠杆菌e.coli o128:b12的α-1,2-岩藻糖基转移酶能够消除副产物2
′‑
岩藻糖基乳糖的生成；加强供体鸟苷二磷酸-岩藻糖的供应，提高了乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量(图1)。
7.本发明提供了一种合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的重组大肠杆菌，敲除大肠杆菌基因组与底物乳糖及关键中间产物分解代谢相关的基因，在大肠杆菌基因组的染色体is186基因座多拷贝整合编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta，在大肠杆菌基因组的reca位点整合编码尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶的基因gale，游离表达编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgo和编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因，并强化鸟苷二磷酸-岩藻糖从头合成途径。
8.在一种实施方式中，所述基因lgta来源于脑膜炎奈瑟菌neisseria meningitidis，所述基因gale来源于大肠杆菌mg1655，所述基因wbgo来源于大肠杆菌o55:h7。
9.在一种实施方式中，所述基因lgta的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.在一种实施方式中，所述基因gale的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.在一种实施方式中，所述基因wbgo的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12.在一种实施方式中，所述reca位点的genbank号为act44368.1。
13.在一种实施方式中，在大肠杆菌基因组上染色体is186基因座上插入1～5任一拷贝数的基因lgta。
14.在一种实施方式中，在大肠杆菌基因组上染色体is186基因座上插入4个拷贝的基因lgta。
15.在一种实施方式中，在大肠杆菌基因组上染色体is186基因座的1、2、4、5位点插入基因lgta。
16.在一种实施方式中，所述大肠杆菌基因组上染色体is186基因座的1位点的ncbi登录号为gene id:8180773，2位点的ncbi登录号为gene id:8180306，4位点的ncbi登录号为gene id:8180040，5位点的ncbi登录号为gene id:8183431。
17.在一种实施方式中，所述敲除大肠杆菌基因组上与底物乳糖水解相关基因包括编码β-半乳糖苷酶的基因lacz，所述敲除大肠杆菌基因组上与关键中间产物分解代谢相关的基因包括编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因wecb、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因nagb和编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因ugd。
18.在一种实施方式中，β-半乳糖苷酶lacz的ncbi序列号为np_414878.1，尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecb的ncbi序列号为yp_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagb的ncbi序列号为np_415204.1，尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶ugd的ncbi序列号为wp_000704860.1。
19.在一种实施方式中，所述强化鸟苷二磷酸-岩藻糖从头合成途径为过表达编码磷酸甘露糖酶的基因manb、编码甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶的基因manc、编码鸟苷二磷酸-甘露糖-4,6-脱水酶的基因gmd和编码鸟苷二磷酸-岩藻糖合酶的基因wcag。
20.在一种实施方式中，利用表达载体pcdfduet-1、petduet-1和prsfduet-1；利用表达载体pcdfduet-1过表达基因wbgo，利用表达载体petduet-1过表达编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因，利用表达载体prsfduet-1过表达基因manb、基因manc、基因gmd和基因wcag。
21.在一种实施方式中，所述编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因选自来源于幽门螺杆菌helicobacterpylori的基因fuct2，来源于脆弱拟杆菌bacterooidesfragilis的基因wcfb，来源于大肠杆菌o126的基因wbgl，来源于鼬鼠螺杆菌helicobactermustelae的基因futl，来源于大肠杆菌o128:b12的基因wbsj，来源于嗜热聚球藻vestitus bp-1的基因te2ft或来源于波尔蒂小肠杆菌enterocloster bolteae的基因futcbo。
22.在一种实施方式中，所述基因fuct2的核苷酸序列如seq id no.4所示。
23.在一种实施方式中，所述基因wcfb的核苷酸序列如seq id no.5所示。
24.在一种实施方式中，所述基因wbgl的核苷酸序列如seq id no.6所示。
25.在一种实施方式中，所述基因futl的核苷酸序列如seq id no.7所示。
26.在一种实施方式中，所述基因wbsj的核苷酸序列如seq id no.8所示。
27.在一种实施方式中，所述基因te2ft的核苷酸序列如seq id no.9所示。
28.在一种实施方式中，所述基因futcbo的核苷酸序列如seq id no.10所示。
29.在一种实施方式中，利用表达载体pcdfduet-1、petduet-1；利用表达载体pcdfduet-1过表达基因wbgo，利用表达载体petduet-1过表达编码l-岩藻糖激酶/l-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的基因fkp和基因fuct2。
30.在一种实施方式中，所述基因fkp的核苷酸序列如seq id no.11所示。
31.本发明提供了一种生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的方法，利用所述的重组大肠杆菌为微生物发酵菌株，以甘油为碳源，以乳糖为底物合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ。
32.在一种实施方式中，将种子液以2％的体积比加入含有甘油的发酵体系中，培养至od
600
达0.6～0.8，加入iptg和乳糖，使得iptg在发酵体系中的浓度为0.5mm，乳糖在发酵体系中的浓度为5g/l，诱导培养温度为25℃，诱导培养时间为96h；
33.或者，将种子液以8～12％的体积比接种于含有甘油的发酵体系中，培养至菌体
od
600
达到12～15，添加iptg至终浓度为0.2mm并同时添加乳糖至终浓度为10g/l，当发酵体系中甘油浓度低于5g/l补加甘油以维持发酵体系中甘油的浓度在6～15g/l；当乳糖的浓度低于3g/l时补加乳糖以维持发酵体系中乳糖的浓度在3～10g/l，通过添加氨水维持发酵体系的ph范围在6.6～6.8，并保持溶氧25％～35％。
34.在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌在35～38℃、180～220rpm条件下培养10～15h得到种子液。
35.在一种实施方式中，所述发酵体系含有甘油20g/l，磷酸二氢钾13.5g/l，磷酸氢二氨4.0g/l，柠檬酸1.7g/l，七水硫酸镁1.4g/l和微量金属元素溶液10ml/l，并用氢氧化钠调节培养基ph至6.8，于115℃灭菌30min，在使用前需加入4.5mg/l的硫胺素。
36.在一种实施方式中，所述微量金属元素溶液含有七水合硫酸亚铁10.0g/l，无水氯化钙2.0g/l，七水硫酸锌2.2g/l，一水硫酸锰0.38g/l，五水硫酸铜1.0g/l，钼酸铵0.1g/l，十水合四硼酸钠0.02g/l，溶于5m盐酸。
37.本发明提供了所述重组大肠杆菌在在医药、食品和化工领域中的应用。
38.本发明提供了上述重组大肠杆菌在制备乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ及含有乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产品中的应用。
39.有益效果：
40.本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌宿主，通过在大肠杆菌宿主基因组上整合编码尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶的基因gale从而强化尿苷二磷酸-半乳糖的供应，敲除编码β-半乳糖苷酶的基因lacz使乳糖在细胞内不被水解，敲除大肠杆菌基因组上与关键中间产物分解代谢相关的基因(编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因wecb、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因nagb和编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因ugd)，在基因组is186多拷贝基因座上插入编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgta构建了遗传上稳定的前体物乳酰-n-三糖
ⅰⅰ
生产菌株。通过质粒载体引入外源编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgo得到高效的乳酰-n-四糖底盘菌株，通过质粒载体引入编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因wbsj生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ，通过质粒载体引入编码磷酸甘露糖酶的基因、编码甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶的基因、编码鸟苷二磷酸-甘露糖-4,6-脱水酶的基因和编码鸟苷二磷酸-岩藻糖合酶的基因强化鸟苷二磷酸-岩藻糖从头合成途径中鸟苷二磷酸-岩藻糖的合成(图2)。通过质粒载体引入外源的编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因开发了一个高效的乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的生产菌株，不会生成副产物2
′‑
岩藻糖基乳糖，只有少量的中间产物残留，提高了乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量。在摇瓶发酵实验中，重组大肠杆菌生产的乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ可达到2.53g/l，在5l生物反应器体系中，重组大肠杆菌在分批补料培养47.5h后，其乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的细胞外产量可达到30.47g/l，具备良好的工业化应用前景。
附图说明
41.图1～图5中glycerol表示甘油，lactose表示乳糖，lntriⅱ表示乳酰-n-三糖ⅱ，2'-fl表示2'-岩藻糖基乳糖，lnt表示乳酰-n-四糖，lnfpⅰ表示乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ。
42.图1为重组大肠杆菌合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ代谢通路图；
43.图2为鸟苷二磷酸-岩藻糖从头合成途径和补救途径的代谢通路图；
44.图3为鸟苷二磷酸-岩藻糖从头合成途径和补救途径乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量图；
45.图4为乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ标准品和摇瓶培养重组大肠杆菌en1发酵上清液中乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的uplc/ms图；
46.图5为携带不同α-1,2-岩藻糖基转移酶的工程大肠杆菌合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量比较图；
具体实施方式
47.下面通过具体实施例子对本发明进一步阐述。
48.以下实例中所使用的质粒、内切酶、pcr酶、柱式质粒抽提盒和柱式dna胶回收试剂盒等商用产品，具体操作均按照试剂盒说明书进行。菌落pcr、化学转化法、电转化法、核酸琼脂糖凝胶电泳、化学感受态与电转感受态细胞的制备和细菌基因组抽提等常规分子生物学实验操作根据molecular cloing：alaboratory manua(fourth edition)进行。质粒和dna产物的测序工作交予苏州金唯智生物科技有限公司完成。大肠杆菌感受态制备：takara试剂盒。
49.下述实施例中所涉及的质粒pdonor(addgene#130634)、ptnsabc(addgene#130633)、pqcascade-is186(addgene#140627)、pcutamp(addgene#140632)购自杭州宝赛生物科技有限公司；质粒prsf-cbgw和pet-wbgl公开于公开号为cn114874964a的中国发明专利申请文件中；质粒pet-fkp-fuct2：公开于文章pathway optimization of 2
′‑
fucosyllactose production in engineered escherichia coli，doi号为10.1021/acs.jafc.0c07224，在该文章中名称为pet-ff，在本发明将其命名为pet-fkp-fuct2；质粒pet-fuct2：由pet-fkp-fuct2使用引物对hp-fuct2-f/r经过全质粒pcr去除fkp基因得到；质粒pet-wcfb、pet-futl、pet-wbsj、pet-te2ft、pet-futcbo：由苏州金唯智公司合成目的基因(wcfb、futl、wbsj、te2ft、futcbo)后构建在petduet-1载体的ndei位点，生成质粒pet-wcfb、pet-wbsj、pet-futl、pet-te2ft和pet-futcbo。
50.luria-bertani(lb)固体培养基：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l。
51.luria-bertani(lb)液体培养基：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。
52.发酵培养基(definedmedium，dm)：甘油20g/l，磷酸二氢钾13.5g/l，磷酸氢二氨4.0g/l，柠檬酸1.7g/l，七水硫酸镁1.4g/l和微量金属元素溶液10ml/l，并用氢氧化钠调节培养基ph至6.8，于115℃灭菌30min，在使用前需加入4.5mg/l的硫胺素；
53.微量金属元素溶液：七水合硫酸亚铁10.0g/l，无水氯化钙2.0g/l，七水硫酸锌2.2g/l，一水硫酸锰0.38g/l，五水硫酸铜1.0g/l，钼酸铵0.1g/l，十水合四硼酸钠0.02g/l，溶于5m盐酸。
54.分批补料发酵补料液：(1)甘油发酵补料液：甘油600g/l，硫胺素0.2g/l和七水硫酸镁20g/l；(2)ph调节：14％氨水(v/v)。
55.抗生素浓度：卡那霉素50mg/l，氨苄青霉素200mg/l(固体培养基)，氨苄青霉素100mg/l(液体培养基)，氯霉素50mg/l，壮观霉素50mg/l，链霉素50mg/l。
56.诱导剂浓度：异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)，摇瓶发酵中添加至终浓度
为0.5mm，发酵罐分批补料中添加终浓度为0.2mm，使用crispr-cas9基因编辑系统敲除相关基因过程中，去除ptarget质粒时添加iptg终浓度为0.1mm。制备大肠杆菌电转感受态细胞时l-阿拉伯糖添加的终浓度为30mm。
57.菌株培养及摇瓶发酵：从转化得到含有质粒的大肠杆菌的固体lb平板上挑取形态正常的菌落至添加了相应抗生素的4ml lb培养基试管中，37℃、200rpm培养10～12h后得到种子液，将种子液以2％(v/v)加入含有甘油的dm培养基250ml摇瓶发酵体系中，37℃、200rpm培养至od
600
达0.6～0.8，加入iptg和乳糖，使得iptg在发酵体系中的浓度为0.5mm，乳糖在发酵体系中的浓度为5g/l，诱导培养温度为25℃，200rpm诱导培养96h。收集诱导96h后的发酵液并制备样品进行乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量测定。
58.发酵罐发酵：生物反应器发酵在5l发酵罐中进行，初始发酵培养基体积为1.5l，种子液接种量为10％(v/v)，初始温度为37℃，当罐内菌体od
600
至12～15时，开始对发酵罐进行梯度降温至诱导温度25℃时，加入诱导剂iptg至终浓度为0.2mm和反应底物乳糖至终浓度为10g/l，当罐内甘油浓度消耗至低于5g/l时，通过恒流泵加入甘油发酵补料液进行补料，当罐内乳糖的浓度低于3g/l时通过恒流泵补加乳糖，使得发酵体系中的甘油浓度维持在6～15g/l，乳糖的浓度维持在3～10g/l。通过恒流泵补加14％氨水(v/v)使罐内培养液ph维持在6.6～6.8的范围内，并添加消泡剂来控制罐体内泡沫，将搅拌速度(300～900rpm)和通气量(2vvm～6vvm)关联至溶氧值，使得溶氧维持在20％～30％的水平。生物反应器系统以溶解氧状态运行，通过改变搅拌速度(300-700rpm)和空气流量(2-8l/min)使溶解氧保持在25-35％。
59.乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量检测：为了检测发酵上清液中乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量，将发酵液以10,000rpm离心10min，再将上清液用0.22μm的水系聚醚砜针头式过滤器过滤后用于测定。乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ、乳酰-n-四糖、乳酰-n-三糖
ⅰⅰ
、乳糖和甘油的细胞外浓度由waters e2695高效液相色谱系统检测，该系统配备了rezex roa-有机酸h
+
柱((8％，100mm
×
4.6mm))和waters 2414示差折光检测器。使用5mm h2so4作为流动相，每个样品在60℃和0.6ml/min的流速下运行20min。用紫外分光光度计测量细胞密度(od
600
)。采用超高效液相色谱-质谱法(uplc/ms)(acquity uplc系统，maldi synapt q-tof ms)进一步分析乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的标准品和发酵样品，以确定乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的生物合成情况。
60.表1下述实施例中涉及的引物序列
[0061][0062][0063]
pcr扩增反应体系见表2。pcr反应条件(dna片段扩增)：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸(延伸时长2kb/min)；循环32次，4℃保存，pcr产物进行胶回收。
[0064]
表2 pcr扩增体系
[0065][0066]
gibson组装反应体系见表3，gibson组装反应条件为50℃，1h。
[0067]
x/y根据公式计算可得到载体用量和插入片段用量：
[0068]
最适克隆载体使用量＝(0.02
×
克隆载体碱基对数)ng
[0069]
最适插入片段使用量＝(0.02
×
插入片段碱基对数)ng
[0070]
x+y1+
…
+yn≤5(μl)
[0071]
表3 gibson组装反应体系
[0072][0073]
全质粒pcr扩增反应体系见表4。条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸(延伸时长2kb/min)；循环30次，4℃保存。在体系中加入dpn i在37℃下消化1h以消除模板质粒，再进行转化、测序验证。
[0074]
表4全质粒pcr扩增反应体系
[0075][0076]
实施例1：重组质粒载体的构建
[0077]
wbgo基因片段的获得以及质粒pcd-wbgo的构建，所涉及到的引物序列见表1：
[0078]
来源于大肠杆菌o55:h7的编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgo经密码子优化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(核苷酸序列如seq id no.3所示)，以该合成的基因为模板，以wbgo-f/r为引物，pcr扩增出wbgo基因片段，胶回收dna片段；以wbgo-v-f/r为引物，以pcoladuet-1载体为模板扩增出相应的载体片段，胶回收dna片段，将两片段通过gibson试剂盒(美国neb试剂公司)连接获得质粒pcd-wbgo。
[0079]
实施例2：重组菌株的构建
[0080]
(1)在大肠杆菌reca位点整合gale：
[0081]
以公开号为cn111979168a的中国发明专利中的重组菌株ewnl(敲除编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecb(ncbi序列号为yp_026253.1)的基因wecb、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagb(ncbi序列号为np_415204.1)的基因nagb以及编码β-半乳糖苷酶lacz(ncbi序列号为np_414878.1)的基因lacz)为出发菌株。
[0082]
1)使用引物对gale-n20-f/r对ptargett质粒进行全质粒pcr，得到含有靶向reca位点的质粒ptargett
sgrna-reca
；
[0083]
2)以大肠杆菌k12 mg1655基因组中的gale为模板，使用引物pt-gale-f/r进行pcr，扩增得到gale基因片段；以大肠杆菌bl21(de3)的基因组为模板，使用引物对gale-genome-up-f/r与gale-genome-down-f/r分别进行pcr，得到上下游同源臂片段；以步骤1)中的ptargett
sgrna-reca
质粒为模板，使用引物对pt-gale-v-f/r进行pcr扩增，得到ptargett
sgrna-reca
载体片段；
[0084]
3)将步骤2)中四个片段进行胶回收，使用gibson组装获得质粒ptarget-gale。进行菌落pcr鉴定得到的阳性克隆培养后提取质粒测序，测序正确即得到质粒ptargett-gale；
[0085]
4)通过化学转化法将pcas质粒转入出发宿主大肠杆菌ewnl中，并加入30mm的阿拉
伯糖以诱导λ-red重组酶系统的表达；
[0086]
5)将步骤3)中ptarget-gale质粒电转进入步骤4)中含pcas的大肠杆菌中，后涂布于含有壮观霉素和卡那霉素的lb固体平板上，30℃培养20～24h，对平板上的单菌落进行菌落pcr验证；菌落pcr验证成功后再进行测序，测序正确后即得到整合成功的大肠杆菌宿主；
[0087]
6)将验证成功的大肠杆菌菌落转接至4ml的lb液体试管中，并添加0.1mm的iptg，以诱导去除ptarget-gale质粒，摇床振荡培养12h后，取部分菌液划线培养12～15h，后再验证是否去除ptarget-gale质粒；
[0088]
7)选取成功去除ptarget-gale质粒的单菌落接种至无抗的lb液体试管中，42℃，200rpm过夜培养，取部分菌液划线至无抗的lb固体平板上，后挑取单菌落验证是否去除pcas质粒，验证成功即成功整合了gale基因，获得重组菌株enp4l0。
[0089]
(2)以重组菌株enp4l0为宿主，敲除编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因ugd。
[0090]
以ptargetf质粒为模板，使用引物对ugd-n20-f/r进行全质粒pcr，替换ptargetf质粒上特异性的20个碱基序列。pcr产物经dpni消化后化转至大肠赶紧e.coli dh5α中，经测序验证成功后，得到敲除质粒ptargetf-ugd。与整合基因的操作流程相比，敲除基因时还需要额外的dna模板，以大肠杆菌bl21(de3)的基因组为模板，使用两个引物对ugd-genome-up-f/r和ugd-genome-down-f/r分别扩增出上游同源片段和下游同源片段；将上、下游片段分别胶回收，再使用重叠延伸pcr得到敲除ugd基因的模板片段template-ugd。基因在大肠杆菌基因组上的敲除与整合方法相似，区别在于对含pcas的大肠杆菌电转感受态细胞进行电转化时加入的是质粒ptargetf-ugd和模板片段template-ugd的混合物，其余操作相同，上述所用引物及其序列见表1，得重组菌enp4l1。
[0091]
(3)基因lgta在大肠杆菌染色体上is186基因座上的多拷贝整合：
[0092]
1)以pdonor为模板，使用引物对pd-lgta-f/r与pd-lgta-v-f/r分别进行pcr扩增，将两个片段分别胶回收，再使用gibson组装获得质粒pdonor-lgta；
[0093]
2)将质粒ptnsabc、pqcascade-is186和pdonor-lgta转化进步骤(2)构建的重组菌enp4l1中后，涂布在含有卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素的lb固体培养基平板上；
[0094]
3)待平板上长出菌落后，挑取菌落重悬于lb液体培养基中，并涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素及0.1mm iptg的lb平板上；
[0095]
4)待平板上有生物膜形成后，挑取菌落重悬于lb液体培养基中，取部分菌液适当稀释后涂布在含有卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素和1mm iptg的lb固体平板上。通过增加大肠杆菌在含有1mm iptg的固体平板上的转移次数，iptg诱导转座相关酶的表达以启动转座，所插入基因lgta的拷贝数随着转移次数的增加而增加；
[0096]
5)转座结束后，通过质粒pcutamp同时靶向三个质粒上的ampr启动子，从而消除三个质粒pdonor、ptnsabc、pqcascade-is186，向步骤4)的宿主菌化学转化质粒pcutamp，转化后添加10mm鼠李糖恢复3h，随后将宿主菌涂布在含10g/l蔗糖的lb平板上消除pcutamp获得无质粒菌落，成功构建得到重组菌enp4l2，基因编辑所用质粒或模板如表5所示。
[0097]
表5基因编辑所用质粒或模板
[0098]
[0099][0100]
实施例3：重组菌发酵生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ[0101]
在实施例2构建的重组菌enp4l2的基础上，分别转入实施例1所构建得到的重组质粒，以组合表达乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的关键基因，得到了不同的工程菌，构建得到的重组菌如表6所示。摇瓶发酵实验结果表明，在相同的重组大肠杆菌enp4l2中引入鸟苷二磷酸-岩藻糖的从头合成途径基因的菌株en1，乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量要高于在enp4l2中引入鸟苷二磷酸-岩藻糖的补救途径基因的菌株en2，菌株en1乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的产量可达到0.63g/l(图3和图4)。
[0102]
在重组大肠杆菌enp4l2中过表达不同来源的编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因，结果显示生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ时，表达wbsj基因的重组大肠杆菌en6的乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ产量可达到2.53g/l，显著高于含有其他来源α1,2-岩藻糖基转移酶的重组菌。并且，从图中可以看出，重组菌en4和en5的产物中主要为2
′‑
fl；en6的产物中主要为lnfp i，没有副产物2
′‑
岩藻糖基乳糖的生成(图5)。
[0103]
表6不同重组大肠杆菌摇瓶发酵生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的详细信息
[0104][0105][0106]
实施例4：5l发酵罐分批补料生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ[0107]
选取菌株en6进行发酵罐扩大发酵实验，最终发酵时间为47.5h，最大od
600
达104.6，5l发酵罐分批补料培养重组大肠杆菌的乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ产量达到30.47g/l。
[0108]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上编码β-半乳糖苷酶的基因lacz、编码尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因wecb、编码葡萄糖胺-6-脱氨酶的基因nagb和编码尿苷-葡萄糖-6-脱氢酶的基因ugd；在大肠杆菌基因组的染色体is186基因座多拷贝整合表达编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta，在大肠杆菌基因组的reca位点整合表达编码尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶的基因gale，游离表达编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgo和编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因，并过表达编码磷酸甘露糖酶的基因manb、编码甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶的基因manc、编码鸟苷二磷酸-甘露糖-4,6-脱水酶的基因gmd和编码鸟苷二磷酸-岩藻糖合酶的基因wcag。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌基因组上染色体is186基因座上插入1～5任一拷贝数的基因lgta。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用表达载体pcdfduet-1上过表达基因wbgo，利用表达载体petduet-1上过表达编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因，利用表达载体prsfduet-1上过表达基因manb、基因manc、基因gmd和基因wcag。4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述编码α1,2-岩藻糖基转移酶的基因选自来源于幽门螺杆菌helicobacterpylori的基因fuct2，来源于脆弱拟杆菌bacterooidesfragilis的基因wcfb，来源于大肠杆菌o126的基因wbgl，来源于鼬鼠螺杆菌helicobactermustelae的基因futl，来源于大肠杆菌o128:b12的基因wbsj，来源于嗜热聚球藻vestitusbp-1的基因te2ft，来源于波尔蒂小肠杆菌enteroclosterbolteae的基因futcbo。5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因lgta的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因gale的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述基因wbgo的核苷酸序列如seq id no.3所示。6.一种制备乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌发酵生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，以甘油为碳源，以乳糖为底物合成乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，将种子液加入含有甘油的发酵体系中，培养至od
600
达0.6～0.8，加入iptg和乳糖，使得iptg在发酵体系中的浓度为0.5mm，乳糖在发酵体系中的浓度为5g/l，诱导培养温度为25℃，诱导培养时间为96h；或者，将种子液接种于含有甘油的发酵体系中，培养至菌体od
600
达到12～15，添加iptg至终浓度为0.2mm并同时添加乳糖至终浓度为10g/l，当发酵体系中甘油浓度低于5g/l补加甘油以维持发酵体系中甘油的浓度在6～15g/l；当乳糖的浓度低于3g/l时补加乳糖以维持发酵体系中乳糖的浓度在3～10g/l，通过添加氨水维持发酵体系的ph范围在6.6～6.8，并保持溶氧25％～35％。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌在35～38℃、180～220rpm条件下培养10～15h得到种子液。10.权利要求1～5任一所述重组大肠杆菌在医药、食品和化工领域中生产乳酰-n-岩藻糖基五糖ⅰ的应用。

技术总结
本发明公开了一种高产乳酰-N-岩藻糖基五糖Ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明在大肠杆菌基因组上整合尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶编码基因galE，在基因组IS186多拷贝基因座上插入β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶编码基因lgtA，游离表达β-1,3-半乳糖基转移酶编码基因wbgO使底物乳糖转化为乳酰-N-四糖。发现鸟苷二磷酸-岩藻糖的从头合成途径利于乳酰-N-岩藻糖基五糖Ⅰ的生产。本发明筛选到既能够提高乳酰-N-岩藻糖基五糖Ⅰ的产量，又能避免副产物2


技术研发人员：沐万孟 朱莺莺 赵明利 李泽宇 张文立
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/8/4