天冬氨酸蛋白酶1及其编码基因在调控小麦光合作用、产量及蛋白含量中的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及天冬氨酸蛋白酶1(aspartic protease 1，app1)及其编码基因在调控小麦光合作用、产量及蛋白含量中的应用。


背景技术：

2.全球变暖会带来一系列相关问题，比如海平面的上升、极端气候的高频出现、病虫害的大量发生等。光合作用吸收太阳能，是支持植物生长、生物量积累和库(粮食、块茎等)储存的主要动力。优化作物光合作用是提高谷物产量以养活世界人口的有效策略。科学家们提出了多个理论目标来实现更高的光合效率：通过对叶片冠层的操纵来优化光的捕获，在作物叶绿体中减少能量消耗的替代光呼吸途径，加速光系统ii的非光化学猝灭，通过rubisco酶的修饰来增加羧化能力等等。
3.小麦是我国重要的粮食作物，高产、稳产是保障粮食安全、实现农业现代化的重要基础。功能保持绿色是一种有益的策略，可以维持源库关系中储存的养分的再调动，增强作物对极端天气条件的适应能力，提高作物产量，尤其是在逆境条件下。小麦在抽穗期、开花期和灌浆期的最适大气温度分别为16
±
2.3℃、23
±
1.75℃和26
±
1.53℃。高于适宜温度的温度会破坏叶绿体完整性，加速叶片衰老，干扰光合作用，最终导致产量下降。考虑到目前消费者对转基因作物的担忧，以及欧洲农业生物技术的负面环境，延长光合作用的自然方法可以增加小麦的产量性状，并为世界提供更多的食物。
4.植物的种子含有储存的代谢物，例如碳水化合物、蛋白质、脂质和核酸，当环境适合发芽时，这些代谢物对细胞从休眠向光合自养转变期间的快速分裂和生长至关重要。蛋白质是小麦籽粒的重要组成部分，也是人类植物蛋白的主要来源之一。小麦籽粒蛋白质含量不但是评判营养品质的重要指标，而且其含量的高低直接影响食品的加工品质。因此，小麦籽粒蛋白质含量对小麦品质以及人类营养需求具有非常重要的影响。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是如何调控植物产量、光合作用以及种子大小与蛋白质含量。
6.第一方面，本发明保护天冬氨酸蛋白酶1或其相关生物材料的新用途。
7.本发明保护天冬氨酸蛋白酶1(app1)或其相关生物材料在如下1)-6)任一种中的应用：
8.1)调控植物产量；
9.2)调控植物种子大小；
10.3)调控植物光合作用；
11.4)调控植物种子蛋白质含量；
12.5)培育产量降低和/或光合效率降低和/或种子变小和/或种子蛋白质含量降低的
转基因植物；
13.6)植物育种；
14.所述天冬氨酸蛋白酶1为app-a1蛋白质和/或app-b1蛋白质；所述app-a1蛋白质和所述app-b1蛋白质分别为app1蛋白质在四倍体小麦a基因组和b基因组上的两个拷贝。
15.所述app-a1蛋白质为如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白质：
16.(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
17.(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
18.(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质；
19.(a4)与(a1)具有98％以上同一性且与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质；
20.所述app-b1蛋白质为如下(b1)-(b4)任一所述的蛋白质：
21.(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；
22.(b2)在(b1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
23.(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质；
24.(b4)与(b1)具有98％以上同一性且与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质。
25.上述(a2)或(b2)所述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
26.上述(a3)或(b3)所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
27.上述(a4)或(b4)所述蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
28.所述相关生物材料为编码所述app-a1蛋白质或所述app-b1蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
29.编码所述app-a1蛋白质的核酸分子为如下(a1)或(a2)任一所述的dna分子：
30.(a1)序列表中序列2或序列3所示的dna分子；
31.(a2)与(a1)具有75％以上同一性且编码所述app-a1蛋白质的dna分子；
32.编码所述app-b1蛋白质的核酸分子为如下(b1)或(b2)任一所述的dna分子：
33.(b1)序列表中序列5或序列6所示的dna分子；
34.(b2)与(b1)具有75％以上同一性且编码所述app-b1蛋白质的dna分子。
35.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码app-a1蛋白质或app-b1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的app-a1蛋白质或app-b1蛋白质核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码app-a1蛋白质或app-b1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
36.这里使用的术语“同一性”是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
37.所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达app-a1蛋白质和/或app-b1蛋白质的dna，该dna不但可包括启动app-a1和/或app-b1转录的启动子，还可包括终止app-a1和/或app-b1转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
38.所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
39.所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌；所述细菌可为农杆菌。
40.上述应用中，所述调控植物产量体现为调控植物籽粒重量(如百粒重)。
41.所述调控植物种子大小体现为调控植物籽粒宽度和/或厚度。
42.所述调控植物光合效率体现为调控植物叶绿素含量和/或光合速率。
43.所述调控植物种子蛋白质含量为提高植物籽粒蛋白质含量。
44.上述应用中，所述调控为降低，具体体现为：当小麦中app-a1蛋白质含量提高或app-a1基因表达量提高时，小麦产量和光合效率降低、籽粒变小、籽粒蛋白质含量降低。
45.第二方面，本发明保护抑制上述天冬氨酸蛋白酶1的物质的新用途。
46.本发明保护抑制上述天冬氨酸蛋白酶1的物质在如下(d1)-(d6)任一种中的应用：
47.(d1)提高植物产量；
48.(d2)使植物种子变大；
49.(d3)促进植物光合作用；
50.(d4)促进植物种子蛋白质积累；
51.(d5)培育产量提高和/或光合效率提高和/或种子变大和/或种子蛋白质含量提高的转基因植物；
52.(d6)植物育种。
53.上述应用中，所述提高植物产量体现为提高植物籽粒重量(如百粒重)。
54.所述使植物种子变大体现为增加植物籽粒宽度和/或厚度。
55.所述促进植物光合作用体现为提高植物叶绿素含量和/或光合速率。
56.上述应用中，所述抑制上述天冬氨酸蛋白酶1的物质可为抑制上述天冬氨酸蛋白酶1活性的物质或抑制编码上述天冬氨酸蛋白酶1基因表达的物质或敲除编码上述天冬氨酸蛋白酶1基因的物质。
57.所述抑制上述天冬氨酸蛋白酶1活性的物质可为任何能够使植物中上述天冬氨酸蛋白酶1活性缺失的物质，如抑制上述天冬氨酸蛋白酶1合成或促进上述天冬氨酸蛋白酶1
降解或抑制上述天冬氨酸蛋白酶1功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)。
58.所述抑制编码上述天冬氨酸蛋白酶1基因表达的物质可为任何能够使植物中编码上述天冬氨酸蛋白酶1的基因无法表达的物质，如沉默植物中编码上述天冬氨酸蛋白酶1基因的物质(如mirna、sirna、dsrna、shrna等)。
59.所述敲除意味着携带敲除物质的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物，敲除物质可以是以任何方式实现宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得编码基因序列不被转录、通过与mrna的结合阻止翻译等。通常，敲除在基因组dna水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。进一步的，所述敲除编码上述天冬氨酸蛋白酶1基因的物质可为任何能够使植物中编码上述天冬氨酸蛋白酶1的基因发生突变(所述突变形式可为缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换)从而失去活性的物质，如锌指蛋白zfn基因编辑系统或talens基因编辑系统或crispr/cas9基因编辑系统或ems诱变剂等。
60.第三方面，本发明保护一种培育产量降低和/或光合效率降低和/或种子变小和/或种子蛋白质含量降低的转基因植物的方法。
61.本发明保护的培育产量降低和/或光合效率降低和/或种子变小和/或种子蛋白质含量降低的转基因植物的方法包括提高受体植物中上述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的产量和/或光合效率和/或种子大小和/或种子蛋白质含量小于受体植物。
62.上述方法中，所述转基因植物的产量小于受体植物具体体现为所述转基因植物的百粒重小于受体植物。
63.所述转基因植物的光合效率小于受体植物具体体现为所述转基因植物的叶绿素含量和光合速率小于受体植物。
64.所述转基因植物的种子大小小于受体植物具体体现为所述转基因植物籽粒的宽度和厚度小于受体植物。
65.上述方法中，所述提高受体植物中上述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量的方法可为在受体植物中过表达上述天冬氨酸蛋白酶1。
66.进一步的，所述过表达的方法为将上述天冬氨酸蛋白酶1的编码基因导入受体植物。所述天冬氨酸蛋白酶1的编码基因序列如序列3所示
67.更进一步的，所述天冬氨酸蛋白酶1的编码基因通过重组载体pgwb18-ubi::app-a1导入受体植物中，得到过表达天冬氨酸蛋白酶1的转基因植物。
68.所述提高受体植物中上述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量的方法还可为将天冬氨酸蛋白酶1突变体与上述过表达天冬氨酸蛋白酶1的转基因植物进行杂交，使所述天冬氨酸蛋白酶1突变体中获得天冬氨酸蛋白酶1的编码基因。
69.进一步的，所述天冬氨酸蛋白酶1突变体具体可为小麦突变体app-a1。
70.更进一步的，所述方法还包括筛选含有天冬氨酸蛋白酶1突变基因的杂交子代的步骤。
71.第四方面，本发明保护一种培育产量提高和/或光合效率提高和/或种子变大和/
或种子蛋白质含量提高的转基因植物的方法。
72.本发明保护的培育产量提高和/或光合效率提高和/或种子变大和/或种子蛋白质含量提高的转基因植物的方法包括降低受体植物中上述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的产量和/或光合效率和/或种子大小和/或种子蛋白质含量大于受体植物；
73.上述方法中，所述转基因植物的产量大于受体植物具体体现为所述转基因植物的百粒重大于受体植物。
74.所述转基因植物的光合效率大于受体植物具体体现为所述转基因植物的叶绿素含量和光合速率大于受体植物。
75.所述转基因植物的种子大小大于受体植物具体体现为所述转基因植物籽粒的宽度和厚度大于受体植物。
76.上述方法中，所述降低受体植物中上述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量的方法可为将上述抑制天冬氨酸蛋白酶1的物质导入受体植物中。
77.进一步的，所述抑制天冬氨酸蛋白酶1的物质可为ems诱导剂。
78.更进一步的，所述转基因植物具体可为小麦突变体app-a1、app-b1或app1。
79.所述降低受体植物中上述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量的方法还可为将受体植物与上述天冬氨酸蛋白酶1突变体进行杂交。
80.进一步的，所述受体植物可为上述过表达天冬氨酸蛋白酶1的转基因植物；所述天冬氨酸蛋白酶1突变体可为小麦突变体app-a1。
81.更进一步的，所述方法还包括筛选含有天冬氨酸蛋白酶1突变基因的杂交子代的步骤。
82.上述任一所述方法或应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为禾本科植物；所述禾本科植物具体可为小麦；所述小麦具体可为野生型小麦kronos或小麦突变体app-a1或小麦突变体app-b1或小麦突变体app1或上述过表达天冬氨酸蛋白酶1的转基因植物。
83.所述小麦突变体app-a1与野生型小麦kronos序列的差异仅在于：在小麦a基因组上编码app-a1基因序列(序列3)的第675位由g突变为a。
84.所述小麦突变体app-b1与野生型小麦kronos序列的差异仅在于：在小麦b基因组上编码app-b1基因序列(序列6)的第836位由g突变为a，且在第836位和第837位之间插入了一段内含子序列，插入的内含子序列具体如下：tactgaacggttatcttgatgttaaaatcttaatgcggttaaatctgaattatcttacg tgtgttcacacctaagtcattctcagg。
85.所述小麦突变体app1与野生型小麦kronos序列的差异仅在于：在小麦a基因组上编码app-a1基因序列(序列3)的第675位由g突变为a，且在小麦b基因组上编码app-b1基因序列(序列6)的第836位由g突变为a，且在小麦b基因组上编码app-b1基因序列(序列6)的第836位和第837位之间插入了一段内含子序列，插入的内含子序列具体如下：tactgaacggttatcttgatgttaaaatcttaatgcggttaaatctgaattatcttacg tgtgttcacacctaagtcattctcagg。
86.第五方面，本发明保护检测待测小麦app-a1基因为hapi单倍型还是hapii单倍型的物质的新用途。
87.本发明保护检测待测小麦app-a1基因为hapi单倍型还是hapii单倍型的物质在鉴
定小麦产量和/或籽粒大小和/或光合效率中的应用；
88.所述hapi单倍型为app-a1基因第3960位为a的基因型；
89.所述hapii单倍型为app-a1基因第3960位为g的基因型。
90.第六方面，本发明保护一种鉴定或辅助鉴定小麦产量或籽粒大小或光合效率的方法。
91.本发明提供的鉴定或辅助鉴定小麦产量或籽粒大小或光合效率的方法包括如下步骤：检测待测小麦app-a1基因为hapi单倍型还是hapii单倍型：app-a1基因为hapii单倍型的小麦的产量或籽粒大小或光合效率高于app-a1基因为hapi单倍型的小麦。
92.第七方面，本发明保护一种筛选或辅助筛选产量高和/或籽粒大和/或光合效率高的小麦品种的方法。
93.本发明保护的筛选或辅助筛选产量高和/或籽粒大和/或光合效率高的小麦品种的方法包括选择app-a1基因为hapii单倍型的小麦品种的步骤。
94.上述方法或应用中，所述app-a1基因为hapi单倍型或hapii单倍型是指小麦两条同源染色体上的app-a1基因均为hapi单倍型或hapii单倍型。
95.上述方法或应用中，所述单倍型为hapi的小麦具体可为小麦品种京411、京冬6号、周8425b、郑麦9023、衡观35、西农979、冀麦30、偃展1号、mexipak 66(墨巴66)或豫麦17，以及郑麦9023和扬麦5号的杂交后代群体(重组自交群体)。
96.所述单倍型为hapii的小麦具体可为扬麦158、繁6、烟农19、平原50、扬麦5、中国春、水里站、郑麦366、晋麦8号或冀麦38，以及郑麦9023和扬麦5号的杂交后代群体(重组自交群体)。
97.本发明首先从四倍体小麦ems突变体库中分离出一个光合作用增强，且籽粒变大，粒重增加的突变体app-a1，并检测到一个与表型共分离的天冬氨酸蛋白酶1a(app-a1)的提前终止突变，然后还发现与天冬氨酸蛋白酶1a同源的天冬氨酸蛋白酶1b(app-b1)的剪切突变体app-b1和双突变体app1，也同样增强了光合作用，且籽粒变大、粒重增加和蛋白质含量提高。相反，过表达app-a1加速了叶片衰老并回补了app-a1表型。此外，本发明在小麦自然群体中还发现了app-a1基因存在一个与光合作用和籽粒发育相关的snp位点，app-a1基因的天然变异能促进光合作用和籽粒发育。以上结果证明app1在小麦光合作用、产量及蛋白质含量中发挥负调控作用。本发明对于光合作用增强、高产量、高蛋白质含量的小麦品种的培育与筛选具有重要意义。
附图说明
98.图1为app1功能缺失对小麦光合作用、产量及蛋白质含量的影响。a.wt、app-a1、app-b1、app1的表型。b.wt、app-a1、app-b1、app1中内源性app1蛋白含量。c.wt、app-a1、app-b1、app1中总天冬氨酸蛋白酶活。n＝4。d.wt、app-a1、app-b1和app1中蛋白质含量测定。e-f.wt、app-a1、app-b1和app1中的叶绿素含量和光合速率(净co2同化速率)。g.wt、app-a1、app-b1和app1的籽粒表型。h-k.wt、app-a1、app-b1和app1籽粒的平均重量(百粒重)、长度、宽度和厚度。数据表示均值
±
sd，双尾非配对t检验表示p值。n＝4(c)；n＝10(e，f)；n＝8(h)；n＝25(i-k)。
99.图2为app-a1过表达加速叶片衰老并回补app-a1表型。a.wt、app-a1、app-a1 o.e.
转基因株系的植株和旗叶的早衰表型。b.wt、app-a1、app-a1 o.e.转基因株系中内源性app1蛋白的含量。c.app-a1 o.e.转基因株系的鉴定。d-e.wt、app-a1和app-a1 o.e.转基因株系中的叶绿素含量和光合速率(净co2同化速率)。f.wt、app-a1和app-a1 o.e.转基因株系的籽粒表型。g-j.wt、app-a1和app-a1 o.e.转基因株系籽粒的平均重量(百粒重)、长度、宽度和厚度。k-l.wt、app-a1和app-a1 o.e./app-a1互补系的衰老表型和内源性app1蛋白含量。m-n.wt、app-a1和app-a1 o.e./app-a1互补系中的叶绿素总量和光合速率(净co2同化速率)的比较。o.wt、app-a1和app-a1 o.e./app-a1互补系的籽粒表型。p-s.wt、app-a1和app-a1 o.e./app-a1互补系籽粒的平均重量(百粒重)、长度、宽度和厚度。数据表示均值
±
sd，双尾非配对t检验表示p值。n＝10(d，e，m，n)；n＝8(g，p)；n＝25(h-j，q-s)。
100.图3为app-a1的自然变异模拟app-a1突变体增强co2同化效率和促进籽粒发育。a.app-a1在单倍型app-a1 hapi和单倍型app-a1 hapii中预测的蛋白质结构。注：*表示预测结构中的差异部分。b-e.单倍型app-a1 hapi和单倍型app-a1 hapii品种籽粒的百粒重、长度、宽度和厚度。n＝10。f.单倍型app-a1 hapi和单倍型app-a1 hapii品种的产量。n＝10。g-j.以ym5(app-a1 hapi)和zm9023(app-a1 hapii)亲本品种为对照，研究其叶片衰老进程、内源app1蛋白含量、叶绿素含量和光合速率(净co2同化速率)。n＝9(i,j)。k.亲本和其分离群体(重组自交群体)的籽粒表型。l-o.单倍型app-a1 hapi和单倍型app-a1hapii分离群体(重组自交群体)籽粒的百粒重、长度、宽度和厚度。数据表示均值
±
sd，双尾非配对t检验表示p值。n＝10(l)，n＝25(m-o)。
具体实施方式
101.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
102.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
103.下述实施例中的四倍体杜兰小麦(kronos)记载于文献“krasileva,k.v.,et al.(2017)."uncovering hidden variation in polyploid wheat."proceedings of the national academy of sciences 114(6):e913-e921.”中。
104.下述实施例中的京411、京冬6号、周8425b、郑麦9023、衡观35、西农979、冀麦30、偃展1号、mexipak 66(墨巴66)、豫麦17、扬麦158、繁6、烟农19、平原50、扬麦5、中国春、水里站、郑麦366、晋麦8号、冀麦38均记载于文献“hao,c.y.,et al.(2020).resequencing of 145landmark cultivars reveals asymmetric sub-genome selection and strong founder genotype effects on wheat breeding in china.molecular plant,2020,7；13(12):1733-1751.”中。
105.实施例1、小麦app1基因的克隆
106.1、rna的提取
107.提取四倍体杜兰小麦(kronos)叶片的rna。
108.2、cdna的获得
109.以步骤1获得的rna为模板，反转录得到cdna。
110.3、pcr扩增
111.以步骤2获得的cdna为模板采用引物app1-a1-f：5
′‑
atgggaacccgcggactc-3
′
和app1-a1-r：5
′‑
ggccgccttggcgaatcc-3
′
进行pcr扩增，并将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并送交测序。测序结果结果表明：pcr扩增得到大小为1530bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列3，将序列3所示的基因命名为app-a1基因，app-a1基因编码序列表中序列1所示的蛋白质，将序列1所示的氨基酸序列命名为天冬氨酸蛋白酶1(aspartic protease 1，app-a1)。
112.以步骤2获得的cdna为模板采用引物app1-b1-f：5
′‑
atgggaacccgcggg-3
′
和app1-b1-r：5
′‑
ggccgccttggcgaag-3
′
进行pcr扩增，并将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并送交测序。测序结果结果表明：pcr扩增得到大小为1530bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列6，将序列6所示的基因命名为app-b1基因，app-b1基因编码序列表中序列4所示的蛋白质，将序列4所示的氨基酸序列命名为天冬氨酸蛋白酶1(aspartic protease 1，app-b1)。
113.实施例2、小麦app1突变体的获得及其性状检测
114.一、小麦app1突变体的获得与序列分析
115.1、小麦app1突变体的获得与序列分析
116.小麦突变体app-a1：从ems诱变的突变体库(该突变体库记载于文献“wang,c.y.,etal.(2020).isolation of wheat mutants with higher grain phenolics to enhance anti-oxidant potential.food chem 303:125363.”中)中筛选到的一个滞绿且籽粒变大的突变体，将该突变体回交3代后选取极端表型即滞绿植株和非滞绿植株进行转录组测序，分析纯合snp错义突变，发现滞绿植株在a基因组中的编码天冬氨酸蛋白酶1基因上发生了提前终止突变，将该突变体命名为app-a1。
117.小麦突变体app-b1：购自山东农业大学农学院(具体突变信息可在如下网站中进行查询：https://plants.ensembl.org/，编号为kronos3321.chr1b.658529380)，回交两代去背景后筛选纯合突变株系，将其命名为app-b1。
118.小麦突变体app1：将app-a1纯合突变株系和app-b1纯合突变株系进行杂交，经pcr鉴定筛选在a、b基因组上均发生纯合突变的株系，将其命名为app1。
119.与野生型小麦kronos序列相比，小麦突变体app-a1的差异仅在于：在小麦a基因组上编码app-a1基因序列(序列3)的第675位由g突变为a，造成氨基酸序列(序列1)第225位由w变成提前终止。
120.与野生型小麦kronos序列相比，小麦突变体app-b1的差异仅在于：在小麦b基因组上编码app-b1基因序列(序列6)的第836位由g突变为a，且在第836位和第837位之间插入了一段内含子序列，插入的内含子序列具体如下：tactgaacggttatcttgatgttaaaatcttaatgcggttaaatctgaattatcttacg tgtgttcacacctaagtcattctcagg，按照原来的读码框，转录在内含子序列终止密码子处停止，造成蛋白翻译提前终止。
121.与野生型小麦kronos序列相比，小麦突变体app1的差异仅在于：在小麦a基因组上编码app-a1基因序列(序列3)的第675位由g突变为a，且在小麦b基因组上编码app-b1基因序列(序列6)的第836位由g突变为a，且在小麦b基因组上编码app-b1基因序列(序列6)的第
836位和第837位之间插入了一段内含子序列，插入的内含子序列具体如下：tactgaacggttatcttgatgttaaaatcttaatgcggttaaatctgaattatcttacg tgtgttcacacctaagtcattctcagg。
122.2、app1蛋白表达量检测
123.检测野生型小麦kronos及突变体app-a1、app-b1、app1中app1蛋白表达量。具体步骤如下：在2ml离心管中提前放入钢珠，剪取适量小麦叶片放入离心管并迅速放入液氮中，用高通量组织研磨仪将样品打碎，60hz,60s，重复一次，至小麦叶片磨成粉末。加入样品相同体积的植物蛋白提取buffer，并加入蛋白酶抑制剂于冰上孵育40min。随后4℃，12,000rpm离心10min，取上清，重复一次。上清即植物活性总蛋白。然后进行蛋白翻译水平上的鉴定。结果发现：内源性app1蛋白的表达量在突变体app-a1、app-b1和app1中显著下降(图1b)。
124.二、app1突变体的表型分析
125.以野生型小麦kronos及小麦突变体app-a1、app-b1、app1为供试材料，于灌浆期观察叶片表型、检测叶片中的天冬氨酸蛋白酶活、利用近红外测量仪测量籽粒中蛋白质含量、利用手持spad叶绿素测量仪测量叶片中的总叶绿素含量、利用li6400光合仪测量光合速率、观察籽粒表型、测量籽粒重量、长度、宽度与厚度。
126.天冬氨酸蛋白酶活的检测步骤如下：选取n-acetyl-asp-glu-val-asp p-nitroanilide作为天冬氨酸蛋白酶的底物，用ph为3.5的naoac配置底物溶液，底物溶液终浓度为125mm。取96孔比色板，74μl植物蛋白提取缓冲液，再加入18μl(约25μg)植物活性蛋白，最后加入8μl底物溶液。37℃酶标仪，1min/1次动力学循环80min，在405nm处测量产物吸收峰。
127.结果发现：突变体app-a1、app-b1和app1在灌浆期表现为滞绿表型(图1a)。突变体app-a1、app-b1和app1中天冬氨酸蛋白酶活显著降低(图1c)。利用近红外测量仪测量籽粒中蛋白质含量发现：和野生型小麦籽粒相比，app-a1小麦籽粒中的总蛋白含量提高了0.045％，app-b1小麦籽粒总蛋白含量提高了0.8795％，app1小麦籽粒总蛋白含量提高了0.9918％(图1d)。利用手持spad叶绿素测量仪测量发现：突变体的总叶绿素含量明显高于wt(图1e)。利用li6400光合仪测量光合速率发现：光系统超复合体和叶绿素的积累导致各突变体的光合速率显著提高(13％～25％)(图1f)。各突变体中延长光合作用时间，提高光合效率增加了源的量，进而增加了汇的量，从而增加了籽粒尺寸(图1g)。app-b1和app1显著增加了粒重，与app-a1相似(图1h)。其中，在籽粒长度方面，与app-a1的籽粒不同，app-b1产生的籽粒更长，app1进一步增加(图1i)。在籽粒宽度和厚度方面，app-a1、app-b1和app1均显著增加(图1j-k)。以上数据表明，app1同源基因功能缺失也增强了光合作用，增加了籽粒重量，支持app-a1突变与app-a1表型之间的遗传相关性。
128.实施例3、转app-a1小麦的获得及其性状检测
129.一、转app-a1小麦的获得
130.1、重组载体pgwb18-ubi::app-a1的构建
131.利用gateway方法将序列3所示的app-a1 cdna序列连入pdonr207载体(invitrogen cat#:12535035)，得到重组载体pdonr207-app-a1，并对其进行测序验证。经过测序表明：app-a1基因没有任何点突。
132.将重组载体pdonr207-app-a1、pgwb18载体(ncbi:txid419562)和重组酶
(cat.no.11789100，thermofisher scientific)混匀，于25℃反应1h，使序列3所示的app-a1基因重组到pgwb18载体的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之间，得到重组载体pgwb18-ubi::app-a1。重组载体pgwb18-ubi::app-a1表达天冬氨酸蛋白酶1。
133.2、重组菌的获得
134.将重组载体pgwb18-ubi::app-a1转入农杆菌eha105(cat#:ac1010，唯地生物)中，得到重组菌pgwb18-ubi::app-a1/eha105。
135.3、转app-a1小麦的获得
136.选择生长状态良好的四倍体春小麦kronos作为受体，通过剥胚的方法进行遗传转化，使用农杆菌pgwb18-ubi::app-a1进行侵染、分化后进行筛选，得到转app-a1小麦株系。
137.4、pcr鉴定
138.采用引物app-a1-oe-f1：5
′‑
tggggtagtcagccaagagt-3
′
和app-a1-r1：5
′‑
gcatccacacaacagccatc-3
′
对转app-a1小麦株系进行鉴定。结果表明：野生型为单条带，转app-a1小麦株系1
#
和2
#
均为双条带，多了插入的cdna的条带(图2c)。
139.二、转app-a1小麦的表型分析
140.以野生型小麦kronos和转app-a1小麦株系app-a1 o.e(1
#
和2
#
)为供试材料，于灌浆期观察叶片表型、利用手持spad叶绿素测量仪测量叶片中的总叶绿素含量、利用li6400光合仪测量光合速率、观察籽粒表型、测量籽粒重量、长度、宽度与厚度。
141.灌浆期观察叶片表型发现，转app-a1小麦株系app-a1 o.e显示出早衰表型(图2a)。在转app-a1小麦株系app-a1 o.e中，app1蛋白质含量始终以较高水平积累(图2b)。由于app-a1负调控衰老，转app-a1小麦株系app-a1 o.e的叶绿素含量更低(图2d)，光合速率比wt低9-20％，显著降低(图2e)。光合特性的下降直接影响转app-a1小麦株系app-a1 o.e的籽粒。由于来源的限制，转app-a1小麦株系app-a1 o.e产生的籽粒更小(图2f)。转app-a1小麦株系app-a1 o.e的平均粒重较低(图2g)。转app-a1小麦株系app-a1 o.e的籽粒平均长度与wt没有差异(图2h)，平均籽粒宽度和厚度显著降低(图2i-j)。
142.三、回补株系app-a1/app-a1的建立及其性状分析
143.分别将转app-a1小麦株系app-a1 o.e 1
#
和转app-a1小麦株系app-a1 o.e 2
#
与app-a1突变体杂交，在杂交子代中筛选序列2中第2221位由g突变为a，且经引物app-a1-1806f：5
′‑
cactggtagctgcaaggaca-3
′
和app-a1-2615r：5
′‑
atcacaacataccgtgggac-3
′
进行pcr鉴定扩增得到大小为810bp的杂交子代，该杂交子代即为回补株系app-a1/app-a1，得到回补株系app-a1/app-a1 1
#
和回补株系app-a1/app-a1 2
#
。
144.以野生型小麦kronos、app-a1突变体以及回补株系app-a1/app-a1 1
#
、回补株系app-a1/app-a1 2
#
为供试材料，于灌浆期观察叶片表型、利用手持spad叶绿素测量仪测量叶片中的总叶绿素含量、利用li6400光合仪测量光合速率、观察籽粒表型、测量籽粒重量、长度、宽度与厚度。
145.结果表明：app-a1 o.e.事件恢复了app-a1突变体的滞绿表型(图2k)，这与app1蛋白含量的变化一致(图2l)。与wt相比，app1蛋白含量的提高增加了叶绿素含量和光合速率(图2m-n)。此外，app-a1 o.e.事件显示出app-a1突变体籽粒表型的完美遗传互补(图2o)，包括籽粒重量、长度、宽度和厚度(图2p-s)。以上遗传数据均证明app-a1与小麦光合速率和
粒重呈负相关。
146.实施例4、类似app-a1的天然变异能促进光合作用和籽粒重量
147.1、app-a1 hapi和app-a1 hapii单倍型的获得
148.通过调查小麦基因组联合数据库(http://wheat.cau.edu.cn/wheatunion/)查询app-a1的单倍型。结果显示：天然品种中app-a1基因存在一个snp位点(序列2第3960位)，根据snp位点的不同，可将app-a1基因分为两种单倍型：将app-a1基因(序列2)第3960位为a的基因型定义为单倍型app-a1 hapi，将app-a1基因(序列2)第3960位为g的基因型定义为单倍型app-a1 hapii。其中，单倍型app-a1 hapi的核苷酸序列如序列2所示，其编码的蛋白第442位为丝氨酸；单倍型app-a1 hapii的核苷酸序列为将序列2第3960位由a突变为g后得到的序列，该突变导致编码蛋白的氨基酸序列的第442位由丝氨酸突变为甘氨酸。利用蛋白结构预测网站预测蛋白结构，发现氨基酸位点的突变改变了app1蛋白结构中的一个螺旋(图3a)。
149.2、app-a1 hapi和app-a1 hapii单倍型与籽粒发育的相关性分析
150.以如下10个app-a1基因为单倍型app-a1 hapi的小麦品种：京411、京冬6号、周8425b、郑麦9023、衡观35、西农979、冀麦30、偃展1号、mexipak 66(墨巴66)、豫麦17，以及如下10个app-a1基因为单倍型app-a1 hapii的小麦品种：扬麦158、繁6、烟农19、平原50、扬麦5、中国春、水里站、郑麦366、晋麦8号、冀麦38为供试材料，分别用一粒进行繁殖，并在田间条件下采用完全随机分布设计单排种植，于成熟期收获籽粒，测量籽粒重量、长度、宽度与厚度。
151.结果表明：与单倍型app-a1 hapi的小麦品种相比，单倍型app-a1 hapii的小麦品种的籽粒重量、长度、宽度和厚度均显著增加(图3b-e)。在田间试验中，单倍型app-a1 hapii的小麦品种比单倍型app-a1 hapi的小麦品种的产量更多(图3f)。以上数据表明单倍型app-a1 hapii与籽粒发育存在潜在的正相关关系。
152.3、app-a1 hapi和app-a1 hapii单倍型的遗传分析
153.以单倍型app-a1 hapii的小麦品种(郑麦9023，zm9023)和一个单倍型app-a1 hapi的小麦品种(扬麦5号，ym5)为供试材料进行遗传分析，于灌浆期观察叶片表型、利用手持spad叶绿素测量仪测量叶片中的总叶绿素含量、利用li6400光合仪测量光合速率、观察籽粒表型、测量籽粒重量、长度、宽度与厚度。
154.结果表明：与ym相比，zm9023表现出整株滞绿的表型，ym5旗叶变黄时，zm9023旗叶依旧很绿(图3g)。zm9023旗叶积累的app1蛋白较少(图3h)，该结果与突变体中app1蛋白的减少一致。zm9023积累了更多的叶绿素(图3i)，并且具有比ym5更高的光合速率(图3j)。
155.以zm9023与ym5为亲本，制备得到重组自交群体(recombinant inbred lines population，rils)，选取两个重组自交群体分别记作1和2，通过引物app-a1-3048f：5
′‑
tttatcactggttctctcttctttgc-3
′
和app-a1-4328r：5
′‑
gtttatagcatgccggggatttca-3
′
进行pcr鉴定，分别得到重组自交群体1和2中单倍型为app-a1 hapii的纯合株系和单倍型为app-a1 hapi的纯合株系。
156.结果表明：在重组自交群体1和2中，单倍型为app-a1 hapii的纯合株系比单倍型为app-a1 hapi的纯合株系产生的籽粒更大(图3k)、粒重显著增加(图3l)。上述粒重的增加来自于籽粒宽度和厚度的增加，而不是籽粒长度的增加(图3m-o)。上述趋势与自然种群的
差异相似。因此，上述snp突变导致的单倍型app-a1 hapii模拟了ems诱变产生的app1功能障碍，单倍型app-a1 hapii在小麦育种中具有巨大的潜力。

技术特征：
1.天冬氨酸蛋白酶1或其相关生物材料在如下1)-6)任一种中的应用：1)调控植物产量；2)调控植物种子大小；3)调控植物光合作用；4)调控植物种子蛋白质含量；5)培育产量降低和/或光合效率降低和/或种子变小和/或种子蛋白质含量降低的转基因植物；6)植物育种；所述天冬氨酸蛋白酶1为app-a1蛋白质和/或app-b1蛋白质；所述app-a1蛋白质为如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白质：(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质；(a4)与(a1)具有98％以上同一性且与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质；所述app-b1蛋白质为如下(b1)-(b4)任一所述的蛋白质：(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；(b2)在(b1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质；(b4)与(b1)具有98％以上同一性且与植物产量和/或光合作用相关的蛋白质。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述相关生物材料为编码所述app-a1蛋白质或所述app-b1蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：编码所述app-a1蛋白质的核酸分子为如下(a1)或(a2)任一所述的dna分子：(a1)序列表中序列2或序列3所示的dna分子；(a2)与(a1)具有75％以上同一性且编码所述app-a1蛋白质的dna分子；编码所述app-b1蛋白质的核酸分子为如下(b1)或(b2)任一所述的dna分子：(b1)序列表中序列5或序列6所示的dna分子；(b2)与(b1)具有75％以上同一性且编码所述app-b1蛋白质的dna分子。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物产量体现为调控植物籽粒重量；所述调控植物种子大小体现为调控植物籽粒长度和/或宽度和/或厚度；所述调控植物光合作用体现为调控植物叶绿素含量和/或光合速率；所述调控植物种子蛋白质含量体现为提高植物籽粒蛋白质含量。5.抑制权利要求1中所述天冬氨酸蛋白酶1的物质在如下(d1)-(d6)任一种中的应用：(d1)提高植物产量；(d2)使植物种子变大；
(d3)促进植物光合作用；(d4)促进植物种子蛋白质积累；(d5)培育产量提高和/或光合效率提高和/或种子变大和/或种子蛋白质含量提高的转基因植物；(d6)植物育种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述提高植物产量体现为提高植物籽粒重量；所述使植物种子变大体现为增加植物籽粒长度和/或宽度和/或厚度；所述促进植物光合作用体现为提高植物叶绿素含量和/或光合速率。7.一种培育产量降低和/或光合效率降低和/或种子变小和/或种子蛋白质含量降低的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的产量和/或光合效率和/或种子大小和/或种子蛋白质含量小于受体植物。8.一种培育产量提高和/或光合效率提高和/或种子变大和/或种子蛋白质含量提高的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述天冬氨酸蛋白酶1的活性和/或含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的产量和/或光合效率和/或种子大小和/或种子蛋白质含量大于受体植物。9.检测待测小麦app-a1基因为hapi单倍型还是hapii单倍型的物质在鉴定小麦产量和/或籽粒大小和/或光合效率中的应用；所述hapi单倍型为app-a1基因第3960位为a的基因型；所述hapii单倍型为app-a1基因第3960位为g的基因型；所述app-a1基因序列如序列2所示。10.一种鉴定或辅助鉴定小麦产量或籽粒大小或光合效率的方法，包括如下步骤：检测待测小麦app-a1基因为hapi单倍型还是hapii单倍型：app-a1基因为hapii单倍型的小麦的产量或籽粒大小或光合效率高于app-a1基因为hapi单倍型的小麦；或，一种筛选或辅助筛选产量高和/或籽粒大和/或光合效率高的小麦品种的方法，包括选择app-a1基因为hapii单倍型的小麦品种的步骤。

技术总结
本发明公开了天冬氨酸蛋白酶1及其编码基因在调控小麦光合作用、产量及蛋白含量中的应用。本发明通过对APP1基因突变的小麦突变体进行分析发现，与野生型小麦相比，小麦突变体app1的光合作用增强，且籽粒变大、粒重增加和蛋白质含量提高。相反，在野生型小麦中过表达APP-A1加速了叶片衰老并回补了突变体表型。此外，本发明在小麦自然群体中还发现了APP-A1基因存在一个与光合作用和籽粒发育相关的SNP位点，APP-A1基因的天然变异能促进光合作用和籽粒发育。以上结果证明APP1在小麦光合作用、产量及蛋白质含量中发挥负调控作用。本发明对于光合作用增强、高产量、高蛋白质含量的小麦品种的培育与筛选具有重要意义。种的培育与筛选具有重要意义。


技术研发人员：缑金营 牛珂欣 王梦露 倪中福
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/8/4