一种胸主动脉瘤和主动脉夹层早期诊断探针的开发及应用

1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种胸主动脉瘤和主动脉夹层(thoracic aortic aneurysm and dissection,taad)早期诊断探针的开发及应用。


背景技术：

2.胸主动脉瘤和主动脉夹层(thoracic aortic aneurysm and dissection,taad)是一类发病急、预后凶险、病死率高的心血管系统疾病。其中，胸主动脉瘤是指胸主动脉呈不可逆瘤样扩张，导致病变处血管直径超正常50％的一种血管疾病；而主动脉夹层是指主动脉内膜发生急性损伤，血流由内膜撕裂处进入主动脉壁，血管形成真假两腔。随着血液的不断流入，假腔会沿着主动脉纵轴快速延伸，严重可至腹主动脉及髂动脉，最终假腔内压力急剧增加，可导致主动脉壁破裂。taad病因多且复杂，发病机制不明，发病迅速，临床症状不典型，极易误诊、误治，从而导致较高的病死率。
3.根据研究显示，主动脉血管发生撕裂后，患者48小时内死亡率约为40％-50％。近年来，随着医疗技术的飞速发展，对于taad患者及时进行腔内修复术或主动脉置换术的手术治疗可显著提高夹层患者的生存率。然而由于taad发病隐匿，在发生撕裂前患者并无明显症状。因此，寻找可在出现症状前对taad进行早期诊断的方法显得尤为重要。
4.现有的taad临床诊断手段主要基于主动脉的管径扩张程度或撕裂程度对taad的发生进行诊断。但由于大多数taad患者发病急骤，血管发生撕裂前缺乏显著的临床症状，目前尚无taad早期诊断方法。


技术实现要素：

5.taad是一种由于内膜撕裂导致的血管危重症疾病，而血管内皮细胞作为血管的第一道屏障，内皮细胞的紧密连接在维持血管功能及稳态中起重要的作用。在我们之前的研究中发现，在taad发生早期，血管内皮细胞屏障功能破坏，紧密连接分子膜分布降低，通透性增加。基于taad发生早期屏障破坏的这一现象，发明人合成了可以对taad进行早期诊断的磁共振造影剂。
6.为此，在本发明的第一方面，提供了式i所示的化合物或其盐，
[0007][0008]
在本发明的第二方面，提供了制备式i所示的化合物或其盐的方法，其包括：
[0009]
1)使fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)发生缩合反应，获得中间体fitc-dextran-dota；
[0010]
2)使所述中间体与gdcl
3 6h2o发生络合反应，获得式i所示的化合物。
[0011]
在一些实施方案中，所述fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)的分子量为4kda。
[0012]
在一些实施方案中，步骤2)中，所述中间体与所述gdcl
3 6h2o发生络合反应前，预先使所述中间体进行质子化。
[0013]
在一些实施方案中，所述质子化是利用盐酸实现的。
[0014]
在一些实施方案中，所述盐酸的浓度为0.05-0.15mm，优选为0.1mm。
[0015]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述缩合反应是在缩合剂和碱存在的条件下进行的。
[0016]
在一些实施方案中，所述缩合剂为1,1-羰基二咪唑(cdi)。
[0017]
在一些实施方案中，所述碱为三乙胺(tea)。
[0018]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述缩合反应的溶剂为无水溶剂，优选为无水二甲亚砜。
[0019]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)与所述1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)的质量比为5:2-5:4，优选为5:3。
[0020]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)与所述缩合剂的质量比为25:8-5:2，优选为25:9。
[0021]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)与所述碱的质量比为10:1-10:3，优选为5:1。
[0022]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)质量与所述碱(如三乙胺)的体积的比为10mg:1μl-5mg:1μl，优选为50mg:7μl。
[0023]
在一些实施方案中，步骤1)中，所述缩合反应是在室温下进行的，例如，室温下进行10-15h，如12h。
[0024]
在一些实施方案中，步骤1)之后，进一步包括：将所述中间体fitc-dextran-dota进行纯化。在一些实施方案中，所述纯化是利用透析膜(例如mwco 1000)进行的。
[0025]
在一些实施方案中，步骤2)中，所述中间体与所述gdcl
3 6h2o的质量比为10:3-2:1，优选5:2。
[0026]
在一些实施方案中，步骤2)中，所述络合反应的溶剂为水，优选为去离子水。
[0027]
在一些实施方案中，步骤2)中，所述络合反应是在室温下进行的，例如，室温下进行10-15h，如12h。
[0028]
在一些实施方案中，步骤2)之后，进一步包括：将所述络合反应的反应产物进行纯化；任选地，还包括：将纯化产物进行干燥(如冷冻干燥)。在一些实施方案中，所述纯化是利用透析膜(例如mwco 1000)进行的。
[0029]
在本发明的第三方面，提供了一种造影剂，其包含前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐。
[0030]
在一些实施方案中，所述造影剂为前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐。
[0031]
在一些实施方案中，所述造影剂为磁共振造影剂。
[0032]
在一些实施方案中，所述造影剂为taad靶向磁共振造影剂。
[0033]
在本发明的第四方面，提供了前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐作为造影剂或者在制备造影剂中的用途。
[0034]
在一些实施方案中，所述造影剂为磁共振造影剂。
[0035]
在一些实施方案中，所述造影剂为taad靶向磁共振造影剂。
[0036]
在本发明的第五方面，提供了组合物，其包含前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂。
[0037]
在本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，其包含前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂。
[0038]
在本发明的第七方面，提供了一种对发生渗漏的血管或者发生taad的血管进行靶向造影的方法，其包括：
[0039]
1)向哺乳动物注射有效量的前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂；
[0040]
2)对所述哺乳动物进行磁共振检测。
[0041]
在一些实施方案中，所述方法用于非诊断或治疗目的(如用于科学研究)。
[0042]
在一些实施方案中，所述哺乳动物为小鼠或人。
[0043]
在本发明的第八方面，提供了前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂在制备试剂中的用途，所述试剂用于诊断(优选早期诊断)或预测taad。
[0044]
在本发明的第九方面，提供了诊断(优选早期诊断)或预测taad的方法，其包括：
[0045]
1)向受试者提供(如注射)有效量的前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂。
[0046]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：
[0047]
2)对所述受试者进行磁共振检测。
[0048]
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，如人或小鼠，优选人。
[0049]
在本发明的第十方面，提供了前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂用于诊断(优选早期诊断)或预测taad的用途。
[0050]
在本发明的第十一方面，提供了前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐或者前述的造影剂，其用于诊断(优选早期诊断)或预测taad。
[0051]
需要说明的是，前述的造影剂指的是前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐，任选地，还可以进一步包含一种或多种药学上可以接受的辅料，例如还包含溶剂，以便将前述的式i所示化合物或其盐或者前述的方法制备的化合物或其盐配置成溶液进行注射使用等。
[0052]
有益效果：
[0053]
1、本发明可通过磁共振检测，通过无创的方式对哺乳动物(如小鼠)发生渗漏的血管进行造影；
[0054]
2、本发明可通过磁共振检测对哺乳动物(如小鼠)是否发生taad进行预测，例如可在胡索酸-3-氨基丙腈(3-aminopropionitrile fumarate salt,bapn)诱导的小鼠taad模型中，对小鼠是否发生taad进行预测；
[0055]
3、本发明的磁共振造影剂对哺乳动物(如小鼠)无明显器官毒性，安全性高，合成简便快捷，成本较低且易获取。
[0056]
4、本发明可用于哺乳动物(优选人或小鼠)潜在的taad诊断(优选早期诊断)探针。
附图说明
[0057]
图1中a为对照小鼠与bapn饲喂小鼠5天和10天后经内眦静脉注射伊文思蓝后主动脉大体；b为对照小鼠与bapn饲喂小鼠5天和10天后经内眦静脉注射右旋糖酐后主动脉切片结果。
[0058]
图2中a为造影剂合成路线；b为核磁共振检测合成原料fitc-dextran氢谱；c为核磁共振检测fitc-dextran与dota反应产物氢谱；d为高效液相色谱中合成原料fitc-dextran色谱峰；e为高效液相色谱中fitc-dextran与dota反应产物色谱峰；f为热重分析后材料中的钆含量；g为检测合成的造影剂在pbs缓冲液中的线性回归拟合曲线。
[0059]
图3中a为注射造影剂后小鼠与对照小鼠各器官组织切片he染色；b为对照小鼠与bapn饲喂小鼠注射造影剂前后小鼠血管磁共振成像及血管切片染色。
[0060]
图4中a为对照小鼠与bapn饲喂小鼠5天和10天后注射造影剂后血管磁共振成像；b为bapn饲喂5天后小鼠相对于对照小鼠注射磁共振造影剂后相对于未注射造影剂血管壁处亮度的增强系数(improvement)；c为bapn饲喂10天后小鼠相对于对照小鼠注射磁共振造影剂相对于未注射造影剂血管壁处亮度的增强系数(improvement)；d为对照小鼠，bapn饲喂后发生taad及bapn饲喂后未发生taad组小鼠5天及10天血管壁处亮度的增强系数(improvement)折线图；e为与d图折线图相对应的主动脉大体图片；f为对照小鼠与bapn饲喂小鼠5天和10天后升主动脉直径测量结果；g为bapn饲喂5天后小鼠相对于对照小鼠的升主动脉直径；h为bapn饲喂10天后小鼠相对于对照小鼠的升主动脉直径。
具体实施方式
[0061]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0062]
本发明了公开了一种taad早期诊断探针的开发及应用。本发明公开一种磁共振造影剂的合成方法及安全性，可用性评价。本发明进一步公开了该磁共振造影剂可对taad发生进行预测，可应用于taad的早期诊断。
[0063]
本发明使用紧密连接示踪分子作为该造影剂的探针，连接络合分子dota，对分子进行钆修饰后合成造影剂fmri-1。为了探究该造影剂对taad的早期诊断作用，使用bapn诱导taad模型，在小鼠还未形成taad的早期阶段注射造影剂后进行磁共振检测，探究具有造影效果的小鼠是否后期发生taad。
[0064]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
[0065]
实施例1：taad早期内皮屏障受损现象确定
[0066]
在bapn诱导taad早期，即饲喂小鼠5天及10天时，通过内眦静脉注射只经旁细胞途径扩散的示踪分子，检测主动脉的屏障功能。由图1a中可看出在taad早期，小鼠伊文思蓝染
料渗出，可见taad早期内皮屏障功能受损。除此之外。通过内眦静脉注射罗丹明b标记的右旋糖酐，对血管切片后观察罗丹明b荧光，可评价血管屏障功能的完整性。由图1b可以看出，血管屏障受损，右旋糖酐渗漏。
[0067]
实施例2：磁共振造影剂的合成和鉴定
[0068]
1、合成
[0069]
根据如图2a的所示的方式对fmri-1进行合成。具体为：将100mg分子量为4kda的fitc标记的右旋糖酐(fitc-dextran)溶于3ml无水二甲基亚砜(dmso)中，反应物混合物在室温下搅拌10min，分别加入60mg的dota，36mg 1,1-羰基二咪唑(cdi)和14μl三乙胺(tea)，室温下络合12h。粗产品使用透析膜(mwco1000)纯化，此时产物为fitc-dextran-dota。为制备终产物fmri-1，将此步骤产物取20mg溶于3ml去离子水中，用0.1mm盐酸进行质子化，加入gdcl
3 6h2o(8mg)，反应混合物在室温下搅拌12h，并使用透析膜(mwco 1000)纯化粗产物，最终产物采用冷冻干燥法，获得目标化合物，最终命名为fmri-1。
[0070]
2、鉴定
[0071]
首先对合成原材料fitc-dextran及fitc-dextran与dota的反应产物分别进行核磁共振氢谱分析，发现氢谱中化学位移5-6ppm之间的波峰变宽(图2b，2c)。同时，通过高效液相色谱检测合成原材料fitc-dextran及fitc-dextran与dota的反应产物，发现由于反应产物相较于fitc-dextran极性增加，导致在色谱峰中滞留时间减少(1.98min)(图2d，2e)。以上两种方法均证明目标化合物合成成功。除此之外，还利用热重分析方法，即在氮气环境下，通过升温使有机物不断分解，最终遗留下无机物钆，从而确定每1mg的磁共振造影材料中含有21％的钆(图2f)。另外，通过配制含有不同浓度的钆离子浓度的造影剂于200μl的磷酸缓冲液中，将样品置于核磁共振成像仪器中扫描，成像后对样品1/t1进行定量。根据图2g可以看出，1/t1与钆离子浓度呈线性关系，且通过计算得到合成材料的线性回归系数，即r为0.9953，表示该化合物浓度越高，造影能力越强。
[0072]
实施例3：磁共振造影剂的应用
[0073]
1、小鼠taad模型造模及磁共振检测
[0074]
3周龄的c57bl/6j雄鼠饲喂正常饮食或含0.4％的bapn饲料14天。分别于造模5天及10天时，利用异氟烷对小鼠进行麻醉，内眦静脉注射8mg/ml的fmri-1(溶剂为生理盐水)100μl，5min后，使用小鼠磁共振扫描仪进行血管t1加权成像。14天时，分离小鼠主动脉，统计小鼠死亡率及taad发生率。
[0075]
2、磁共振造影剂的安全性及可用性
[0076]
小鼠注射fmri-1探针18天后，处死后进行解剖，分别取出小鼠心、肝、脾、肺和肾组织切片后进行he染色(图3a)。结果发现，注射磁共振探针(即制备的fmri-1)后小鼠各组织脏器与对照小鼠(即饲喂正常饮食的小鼠)无显著差异，说明fmri-1的安全性高。另外，由于该探针不仅具有可在核磁共振造影的金属原子钆(gd)，还含有可在共聚焦显微镜下成像的fitc基团。为了探究该磁共振探针的可用性，分别对对照小鼠与bapn饲喂14天后的小鼠在注射磁共振探针前后进行磁共振检测(图3b)。结果发现对照小鼠血管壁增量情况较弱，且切片无明显fitc荧光。而bapn饲喂小鼠在注射fmri-1后，t1图像中血管壁处造影信号增加，切片也显示fitc荧光相较于对照小鼠增强。说明fmri-1对taad具有靶向造影的效果。
[0077]
3、材料可对taad的发生进行预测
[0078]
基于上述对磁共振造影剂安全性及可用性评价，发明人对该造影剂是否可预测taad发生进行分析。分别在bapn诱导taad的5天及10天注射8mg/ml的fmri-1(溶剂为生理盐水)100μl，14天后小鼠取材，保留小鼠血管组织。图4a说明在bapn诱导小鼠taad早期(5天及10天)注射磁共振造影剂后，bapn组小鼠血管处的造影信号均显著高于对照小鼠组(图4b，4c)。进一步根据是否饲喂bapn及bapn饲喂14后小鼠是否发生taad对小鼠进行分组，即分为对照小鼠组、饲喂bapn 14天后未发生taad组及饲喂bapn 14天后发生taad三组。对每一只小鼠5天血管造影信号增量系数与10天血管造影信号增量系数绘制折线图发现(图4d，4e)，饲喂bapn 14天后发生taad的小鼠相对于对照小鼠组及饲喂bapn未发生taad组的血管造影强度增量系数的增加量显著增加(折线斜率)。由此可见，本发明的磁共振造影剂可对taad的发生进行预测。除此之外，发明人利用磁共振成像对主动脉进行直径测量，发现在bapn诱导的taad模型的5天及10天时，小鼠升主动脉直径相较于对照小鼠无显著差异(图4f-h)，这也与文献报道的发生taad患者大多在血管撕裂前无明显扩张一致。此结果说明，本发明的磁共振探针可在主动脉无明显扩张时，对是否发生taad进行预测。
[0079]
上述实验采用以下统计学方法进行分析：(1)正态分布的连续随机变量采用平均值
±
标准误表示(mean
±
sem)；(2)成对数据均采用配对t检验(双侧检验)；(3)非成对数据采用成组t检验(双侧检验)。
[0080]
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。

技术特征：
1.式i所示的化合物或其盐，2.制备式i所示的化合物或其盐的方法，其包括：1)使fitc标记的右旋糖酐(即fitc-dextran)与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)发生缩合反应，获得中间体fitc-dextran-dota；2)使所述中间体与gdcl
3 6h2o发生络合反应，获得式i所示的化合物。3.权利要求2所述的方法，其中，步骤2)中，所述中间体与所述gdcl
3 6h2o发生络合反应前，预先使所述中间体进行质子化；优选地，所述质子化是利用盐酸实现的。4.权利要求2-3任一项所述的方法，其中，步骤1)中，所述缩合反应是在缩合剂和碱存在的条件下进行的；优选地，所述缩合剂为1,1-羰基二咪唑(cdi)；优选地，所述碱为三乙胺(tea)。5.权利要求1所述的式i所示化合物或其盐或者权利要求2-4任一项所述的方法制备的化合物或其盐作为造影剂或者在制备造影剂中的用途；优选地，所述造影剂为磁共振造影剂；更优选地，所述造影剂为胸主动脉瘤和主动脉夹层(taad)靶向磁共振造影剂。6.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的式i所示化合物或其盐或者权利要求2-4任一项所述的方法制备的化合物或其盐。7.一种对发生渗漏的血管或者发生胸主动脉瘤和主动脉夹层(taad)的血管进行靶向造影的方法，其包括：1)向哺乳动物注射有效量的权利要求1所述的式i所示化合物或其盐或者权利要求2-4任一项所述的方法制备的化合物或其盐；2)对所述哺乳动物进行磁共振检测；优选地，所述方法用于非诊断或治疗目的(如用于科学研究)；优选地，所述哺乳动物为小鼠或人。8.权利要求1所述的式i所示化合物或其盐或者权利要求2-4任一项所述的方法制备的化合物或其盐在制备试剂中的用途，所述试剂用于诊断(优选早期诊断)或预测胸主动脉瘤和主动脉夹层(taad)。

技术总结
本发明涉及一种胸主动脉瘤和主动脉夹层早期诊断探针的开发及应用，具体提供了式I所示的化合物或其盐，以及式I所示化合物的制备方法和其作为胸主动脉瘤和主动脉夹层早期诊断探针的应用。断探针的应用。断探针的应用。断探针的应用。


技术研发人员：孔炜 丛馨 徐福建 杨雪媛 许晨
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/4