一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在生理状态下在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法。


背景技术：

2.开放性染色质(open chromatin)，又被称为可及性染色质(accessible chromatin)，是指染色质的物理压缩程度。在真核生物细胞核中，染色质一级结构主要是由dna与组蛋白八聚体以及其它功能蛋白如转录因子以及染色质重塑复合物等共同组成的一种串珠状线性结构(kumasaka n et al.,2019,nature genetics,51(1))。根据染色质的物理压缩程度，染色质可被区分为开放性染色质(open chromatin)与封闭性染色质(closed chromatin)两大类，可用于指示相应区域的dna与调控蛋白在物理上的“可及性”与“不可及性”，这两种染色质状态通常对相关基因表达起相关反作用(zhu b et al.,2015,plant cell,27(9):2415
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2426)。
3.核小体是真核生物染色质的基本结构单元，由于组蛋白的保护，通常缠绕在核小体八聚体上的双链dna，难以被脱氧核糖核酸内切酶i(dnaseⅰ)和微球菌核酸酶(mnase)等核酸酶所消化。相比之下，无核小体的区域，由于dna呈裸露状态，对核酸酶的消化高度敏感，因此基因组中对核酸酶消化高度敏感的区域被称为开放染色质位点。相关研究结果表明，动植物基因组中，开放染色质位点通常含有如基因启动子和增强子等顺式调控元件(thurman r e et al.,.2012,nature,489(7414)；yue f et al.,2014,nature,515(7527)；sheffield n c et al.,2012,genes,3(4))，因此，对基因表达调控具有十分重要的作用。
4.目前，在全基因组水平检测开放染色质位点的方法主要有：dnase i消化测序法(dnase-seq)、基于转座酶tn5的测序法(atac-seq)、mnase消化测序法(mh-seq)和甲醛辅助分离调控元件测序法(faire-seq)等。其中，dnase-seq是最早被用于鉴定全基因组开放染色质位点的实验方法之一。dnasei可优先切割开放染色质中暴露的双链dna，导致双链dna断裂(hesselberth j r et al.,2009,nature methods,6(4):283
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289；boyle ap et al.,2008,cell,132(2):311
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322)。dnase-seq的基本原理是：先使用一定酶浓度单位的dnasei消化纯化后的细胞核，对细胞核不同染色质状态下的双链dna产生差异性切割，优先切割开放染色质区的双链dna，最后收集并纯化经dnasei消化后的小片段或大片段dna，用于单端或双端建库测序，经生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定出酶切位点富集的基因组区域，被称为dnasei超敏感位点(dnaseihypersensitivesites,dhss)。dhss通常与基因表达的激活有关(wu c et al.,1979,cell,16(4)；wu c et al.,1980,nature,286(5776))，因此，dhs的鉴定具有重要的生物学意义。
5.目前，dnase-seq方法已成功应用于在全基因组水平鉴定多种植物的开放染色质位点(zhang et al.,2012,plant cell,24(7):2719-2731)。该方法的主要步骤为：提取和纯化细胞核，利用不同浓度dnaseⅰ酶切消化纯化后的细胞核，再利用脉冲场电泳或普通琼
脂糖胶电流检验不同浓度的dnaseⅰ的酶切效果，选择一种合适的酶切消化后的细胞核，提取小片段或大片段dna用于建库测序。但该方法需要较大的细胞初始量，且需要尝试多种酶切浓度。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的新方法；该方法可以在植物生理状态下鉴定全基因组开放染色质；目前已将该方法用于在全基因组水平鉴定水稻和小麦等植物正常生长以及胁迫条件下的开放性染色质位点。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
8.第一方面，本发明保护一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法(简称原位dh法)，利用适量的脱氧核糖核酸内切酶i(deoxyribonuclease i，dnaseⅰ)消化细胞核，同时结合dna聚合酶ⅰ(dna polymeraseⅰ)及时修复切割的原位dnase-seq方法。
9.具体的，利用非特异性脱氧核糖核酸内切酶i在无核小体区双链dna上产生单链切口，同时，在dna聚合酶i作用下，以另一种完整dna单链为模板以碱基配对方式修补单链切口，保证修补后的双dna中含有生物素标记的datp和dctp核苷酸，通过捕获并富集生物素标记的dna片段建库测序，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定开放性染色质位点。
10.本发明的方法将为在生理状态下原位鉴定植物全基因组开放染色质位点，并解析植物材料调控元件提供一种新的技术与方法。另外，该方法所鉴定的一些关键dh位点有望用于农作物分子育种。
11.作为本技术的优选技术方案，所述在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法，主要包括如下步骤：
12.(1)交联固定植物材料；
13.(2)提取并纯化植物材料的细胞核；
14.(3)将dnaseⅰ、dna polymeraseⅰ及biotin-datp和biotin-dctp加入细胞核中，酶切并原位标记开放性染色质位点；
15.(4)用rnase a消化rna，于65℃解交联过夜，回收dna片段；
16.(5)对回收的dna片段进行片段化处理并检测片段化效果，如采用琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果；
17.(6)用anti-streptavidin-beads结合生物素(biotin)标记的dna片段；
18.(7)将结合有biotin标记的目的dna片段的beads用于建库和illumina测序，经生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定开放性染色质位点。
19.作为一种优选技术方案，步骤(1)中交联固定植物材料的过程为：将新鲜植物材料剪碎(宽度约0.2cm)完全浸入交联液中，在真空条件于4℃交联10分钟，然后加入终浓度为125mm的甘氨酸，在4℃条件下继续真空处理5分钟，终止交联，用灭菌水清洗交联材料3次后，用吸水纸充分吸干叶片表面的水分，于液氮中速冻后置于-80℃保存待用。
20.优选的，所述交联液的配方为：400mm蔗糖，10mm tris-hclph8.0，1mm edta(ph8.0)、1％甲醛。
21.作为一种优选技术方案，步骤(2)中提取并纯化植物材料的细胞核的过程为：将植
物材料用液氮充分研磨成粉末，向粉末中加入等体积的核提取缓冲液，充分搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃上清，得到细胞核沉淀；再加入细胞核清洗液重悬细胞核沉淀，再次离心，弃上清液，重复细胞核清洗过程直至细胞核颜色为白色或淡黄色，用rsb缓冲液重悬纯化后细胞核，离心后弃尽上清；最后，保留沉淀，即纯化的细胞核，可直接用于下游实验。
22.优选的，所述核提取缓冲液(h1b)的配方为：20mmtris-hcl，50mm edta，5mmspermidine，0.15mmspermine，40％glycerol，0.1％ mercaptoethanol。
23.优选的，所述细胞核清洗液(h1bw)的配方为：20mmtris-hcl，50mm edta，5mmspermidine，0.15mmspermine，40％ glycerol，0.1％mercaptoethanol，0.5％triton x-100。
24.优选的，所述rsb缓冲液的配方为：10mmtris-hcl，10mmnacl，3mm mgcl2。
25.作为一种优选技术方案，步骤(3)中酶切并原位标记开放性染色质位点的过程为：将步骤(2)纯化后的细胞核充分重悬于1x nebuffer2中，分别加入dttp，dgtp，dctp，datp及生物素(biotin)标记的dctp(orb64049，biorbyt)，biotin标记的datp(orb533181，biorbyt)，再加入dna ploymeraseⅰ和dnaseⅰ，于25℃反应2小时，期间每半小时轻轻混匀一次；最后加入终浓度为50mm edta终止反应。
26.优选的，所述dttp，dgtp，dctp，datp及biotin标记的dctp和datp的终浓度为0.05mm，0.05mm，0.025mm，0.035mm，0.025mm，0.015mm。
27.作为一种优选技术方案，步骤(4)中所述回收dna片段方法为：向反应液中加入rnase a，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入proteinase k与20％ sds(w/v)，于65℃水浴中孵育过夜；第二天用等体积的酚仿(1:1)抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3m醋酸钠(ph 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收dna沉淀，回收的dna沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于50μleb缓冲液。
28.优选的，所述sds终浓度为2％；
29.优选的，所述eb缓冲液的配方为：10mm tris-hcl,ph 8.0。
30.作为一种优选技术方案，步骤(5)中片段化处理并检测片段化效果为：用非接触式超声波破碎仪(将经过4℃预冷的超声波破碎仪的参数设置为high能量，20s开启，40s停止为1个循环)处理溶于eb缓冲液的dna 3～15个循环，用琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果。
31.如果经过片段化处理的dna片段均匀分布在100～250bp，用等体积的酚仿(1:1)抽提，离心后保留上清液并加入1/10体积的3m醋酸钠(ph 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收dna沉淀，回收的dna沉淀，用75％酒精清洗干燥后，用20μleb缓冲液溶解。
32.作为一种优选技术方案，步骤(6)中用anti-streptavidin-beads回收biotin-标记的dna片段的过程为：充分重悬于4℃冰箱保存的anti-streptavidin-beads，分装beads到一个新的离心管中；用4℃预冷的1xtwb buffer重悬beads，静置1min后，用磁板回收beads，弃去上清；重复3次，最后1次尽量去除上清，加入1xtwb buffer重悬beads，将含有biotin-标记的dna复合物与等量的2xbb buffer混匀，再加入到清洗后的beads中，在混匀仪上于25～30℃，10rpm旋转0.5h；用磁板收集beads，弃去反应混合液，分离不能与biotin结合的dna片段。
33.优选的，所述1xtwb buffer的配方为：0.5mm edta，5mm tris-hcl,ph 7.5，1m nacl，0.05％ tween 20。
34.所述2xbb buffer的配方为：1mm edta，10mm tris-hcl,ph 7.5，2m nacl。
35.作为一种优选技术方案，步骤(7)的具体过程为：将步骤(6)中已结合有目的dna片段的beads直接用于构建illumina测序文库，分离纯化200-350bp dna片段用于illuminanovaseq测序平台进行2x150 pe测序。
36.进一步优选的步骤(7)的详细过程为：根据具体建库试剂盒说明书，加入相应体积的eb缓冲液重悬beads，再直接加入建库所用试剂。根据试剂盒说明书完成平末端修复和接头连接后，用磁板收集beads，弃去反应液。用1xtwb buffer重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，弃去上清；重复2次，最后1次尽量去除上清，再用eb缓冲液重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，尽量去除上清。加入适量eb缓冲液重悬beads，按照试剂盒说明书加入文库扩增所用试剂。文库扩增结束后，用磁板分离beads，保留上清，弃去beads。该上清经过纯化即为可用于测序的文库dna，于illuminanovaseq测序平台进行2x150 pe测序。
37.第二方面，本发明还保护前文所述的一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法在农作物分子育种中的应用
38.优选的，所述植物为水稻、小麦、玉米、拟南芥等等。
39.有益效果
40.与现有的方法相比，本发明具有以下优点：
41.(1)本发明的整个方法流程更加简单。本方法实验及建库只需三天时间即可。而已报道的dnase-seq方法需要跑胶回收dna，至少需要4天。
42.(2)本发明的方法所需初始量细胞少。所需植物材料总量只有已报道的dnase-seq的1/5-1/7。
附图说明
43.图1为本实验建立的原位dnase-seq体系流程图；
44.图2为经过酶切和biotin标记的dna；其中，ck为没有经过酶切及生物素标记的dna，处理为经过酶切及生物素标记的dna；
45.图3为经过超声波处理后的dna片段；
46.图4为用于构建illumina测序文库dna片段；
47.图5为开放性染色质位点的可视化的效果图。
48.图2-图5为针对水稻日本晴叶片材料在正常生长14天条件下做出来的图。
具体实施方式
49.下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限于本发明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
50.本发明一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法，主要步骤包括：交联固定植物材料，提取和纯化细胞核，加入适量的dnasei、dna polymerase i及biotin-datp和biotin-dctp，酶切并同时进行原位标记开放性染色质位点，提取生物素标记后的基因组dna，利用超声波将基因组dna片段化为100-250bp的片段，提取片段化后的基因组dna，
利用anti-streptavidin-beads(65001，life technologies)结合经过含有biotin标记的dna片段，用于建库测序，经生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定开放性染色质位点。
51.实施例1
52.(1)交联固定植物材料：
53.选取2-5g需要供试的实验材料(小麦、玉米、水稻或拟南芥叶片)，剪碎(宽度约0.2cm)浸入交联液中，在真空条件于4℃交联10分钟，然后加入终浓度为125mm的甘氨酸，在4℃条件下继续真空处理5分钟，终止交联，用灭菌水清洗3遍后，用吸水纸充分吸干叶片表面的水分，于液氮中速冻后置于-80℃保存待用。
54.所述交联液的配方为：400mm蔗糖，10mm tris-hcl，ph8.0，1mm edta，1％甲醛。
55.(2)提取纯化植物材料的细胞核：
56.将-80℃冰箱中保存的叶片用液氮充分研磨成粉末，取2ml的粉末用于提取细胞核。向粉末中加入等体积核提取缓冲液(h1b)，搅拌成匀浆后将离心管平放于冰上100rpm摇晃6min。
57.将匀浆液用2层microcloth纱布过滤到1个新的50ml离心管中，4℃，3,000rpm升降速为8离心12min。弃去上清得到细胞核沉淀，加入2ml h1b washing buffer(hibw))，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用3ml hibw冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同1个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀3至5次，3,000rpm升降速为8离心12min，弃上清，重复该步骤3次，直到细胞核颜色为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。
58.用5ml的rsb缓冲液重新悬浮纯化的细胞核，4℃，3,000rpm升降速为8离心12min，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。用400μl的rsb缓冲液重新悬浮细胞核，并将细胞核转移到1个新的1.5ml离心管中；4℃，3,000rpm升降速为8离心12min，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)，用于下游实验。
59.所述核提取缓冲液(h1b)的配方为：20mmtris-hcl(ph＝8.0)，50mm edta，5mmspermidine，0.15mmspermine，40％(v/v)glycerol，0.1％(v/v)mercaptoethanol。
60.所述细胞核清洗液(h1bw)的配方为：20mmtris-hcl(ph＝8.0)，50mm edta，5mmspermidine，0.15mmspermine，40％(v/v)glycerol，0.1％(v/v)mercaptoethanol，0.5％(v/v)triton x-100。
61.所述rsb缓冲液的配方为：10mmtris-hcl(ph＝7.4)，10mmnacl，3mm mgcl2。
62.(3)酶切并原位标记开放性染色质位点：
63.将纯化后的细胞核充分重悬于162.8μl h2o中，加入20μl10x nebuffer2，再分别加入1μl 10mm dttp，1μl 10mm dgtp，0.5μl 10mm dctp，0.7μl 10mm datp及5μl 1mm biotin-dctp、3μl 1mm biotin-datp，再加入1μl dna ploymeraseⅰ(10u/μl)和5μl dnaseⅰ(0.01u/μl)，于25℃反应2小时，期间每半小时轻轻混匀一次。最后加入20μl 0.5m edta终止反应。
64.(4)回收dna片段：
65.向反应液中加入5μl rnase a(10μg/μl)，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入20μlproteinase k(10μg/μl)和20μl20％ sds(w/v)，于65℃水浴中孵育过夜；第二天用等体积的酚仿(1:1)抽提，于12,000rpm，4℃，离心10min后，保留上清液于1个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3m醋酸钠(ph 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置
0.5～1.5h后，回收dna沉淀，回收的dna沉淀用75％酒精清洗2次，于空气中干燥5min，用50μl eb(10mmtris-hcl,ph8.0)缓冲液溶解dna并测量浓度；立即进行下步反应或者将dna放置在-20℃冰箱中保存待用。
66.(5)对回收的dna片段进行片段化处理并检测片段化效果：
67.用非接触式超声波破碎仪(将经过4℃预冷的超声波破碎仪的参数设置为high能量，20s开启，40s停止为1个循环)处理溶于eb缓冲液的dna 3～15个循环，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果。最终获得片段化的dna片段均匀分布在100～250bp，加入等体积的酚仿(1:1)，剧烈混匀后于12,000rpm，4℃，离心10min后，保留上清液于1个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3m醋酸钠(ph 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，回收dna沉淀，用75％酒精清洗回收的dna沉淀2次，于空气中干燥5min，用20μl eb缓冲液溶解dna并测量浓度；立即进行下一步反应或者将dna放置在-20℃冰箱中保存待用。
68.(6)用anti-streptavidin-beads回收biotin-标记的dna复合物：
69.充分重悬于4℃冰箱保存的anti-streptavidin-beads，分装beads到一个新的离心管中；用4℃预冷的1xtwb buffer重悬beads，静置1min后，用磁板回收beads，弃去上清；重复3次，最后1次尽量去除上清，加入1xtwb buffer重悬beads，将含有biotin-标记的dna复合物与等量的2xbb buffer混匀，再加入到清洗后的beads中，在混匀仪上于25～30℃，10rpm旋转0.5h；用磁板收集beads，弃去反应混合液，分离不能与biotin结合的dna片段。
70.所述1xtwb buffer的配方为：0.5mm edta，5mm tris-hcl,ph 7.5，1m nacl，0.05％ tween 20。
71.所述2xbb buffer的配方为：1mm edta，10mm tris-hcl,ph 7.5，2m nacl。
72.(7)将有biotin标记的dna用于构建illumina测序文库并进行测序：
73.根据具体建库试剂盒说明书，加入相应体积的eb缓冲液重悬beads，再直接加入建库所用试剂。根据试剂盒说明书完成平末端修复和接头连接后，用磁板收集beads，弃去反应液。用200μl 1xtwb buffer重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，弃去上清；重复2次，最后1次尽量去除上清，再用50μl eb缓冲液重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，尽量去除上清。加入适量eb缓冲液重悬beads，按照试剂盒说明书加入文库扩增所用试剂等。文库扩增结束后，用磁板分离beads，保留上清，弃去beads。该上清经过纯化即为测序文库dna，用于illuminanovaseq测序平台进行2x150 pe测序。
74.实验结果显示：
75.(1)本实验所建立的原位dnase-seq体系流程如图1所示；
76.(2)经过酶切和biotin标记的dna如图2所示；
77.(3)经过超声波处理后的dna片段均匀分布在100～250bp范围内，如图3所示。
78.(4)取适量的dna用于构建illumina测序文库，回收并纯化200-350bp大小dna片段，用于测序，文库构建检测如图4所示。
79.(5)通过生物信息学分析，鉴定开放性染色质位点，其可视化的效果图如图5所示。
80.图2-图5为针对水稻日本晴叶片材料在正常生长14天条件下做出来的图，申请人还将本发明的方法用在小麦、玉米或拟南芥等植物材料在正常生长以及胁迫条件下的原位鉴定全基因组开放性染色质位点，均可施行。
81.相关技术术语的名词解释
82.交联固定液：用于固定染色质上蛋白质和dna的一种缓冲溶液。
83.核提取缓冲液(hib)：用于提取细胞核的缓冲溶液。
84.核清洗液(h1bw)：用于纯化细胞核的缓冲溶液。
85.dna polymerase i：dna聚合酶i，以亲代dna为模板，催化底物dntp分子聚合形成子代dna的酶。
86.biotin：生物素
87.dnasei：脱氧核糖核酸酶i，可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
88.rnasea：一种降解rna的核糖核酸酶。
89.proteinase k：蛋白酶k，主要降解蛋白质。
90.twb：用于清洗beads的缓冲液。
91.bb：用于稀释dna的缓冲液。
92.tris-hcl：三羟甲基氨基甲烷。。
93.edta：乙二胺四乙酸。
94.illumina测序文库：基于第二代dna测序技术而建立的dna文库。
95.本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

技术特征：
1.一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法，其特征在于，利用脱氧核糖核酸内切酶i在无核小体区双链dna上产生单链切口，同时，在dna聚合酶i作用下，以另一种完整dna单链为模板以碱基配对方式修补单链切口，保证修补后的双链dna中含有生物素标记的datp和dctp核苷酸，通过捕获并富集生物素标记的dna片段建库测序，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定开放性染色质位点。2.根据权利要求1所述的一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的新方法，其特征在于，该方法主要包括如下步骤：(1)交联固定植物材料；(2)提取并纯化植物材料的细胞核；(3)将dnase i，dna polymerasei及biotin-dntp加入细胞核中，酶切并原位标记开放性染色质位点；(4)用rnase a消化rna，解交联过夜，回收dna片段；(5)对回收的dna片段进行片段化处理并检测片段化效果；(6)用anti-streptavidin-beads结合biotin标记的dna片段；(7)将结合目的dna片段的beads用于建库和illumina测序；通过生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定开放性染色质位点。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中交联固定植物材料的过程为：将植物材料剪碎浸入交联液中，在真空条件下交联，然后加入终浓度为125mm的甘氨酸继续真空处理，终止交联，灭菌水清洗干净后，吸干材料表面的水分，于液氮中速冻后置于-80℃保存待用。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述交联液的配方为：400mm蔗糖，10mm tris-hcl ph8.0，1mm edta，1％甲醛。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中提取并纯化植物材料的细胞核的过程为：将步骤(1)交联后的植物材料用液氮充分研磨成粉末后，向粉末中加入等体积的核提取缓冲液，充分搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃上清，得到细胞核沉淀，再加入细胞核清洗液重悬细胞核沉淀，再次离心，弃上清液，重复细胞核清洗过程，直至细胞核颜色为白色或淡黄色；用rsb缓冲液重悬纯化后细胞核，离心后弃尽上清，最后，保留沉淀，即为纯化的细胞核。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述核提取缓冲液的配方为：20mmtris-hcl，50mm edta，5mmspermidine，0.15mmspermine，40％glycerol，0.1％mercaptoethanol。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述细胞核清洗液的配方为：20mmtris-hcl，50mm edta，5mmspermidine，0.15mmspermine，40％glycerol，0.1％mercaptoethanol，0.5％triton x-100。8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述rsb缓冲液的配方为：10mmtris-hcl，10mmnacl，3mm mgcl2。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中酶切并原位标记dna过程为：将步骤(2)纯化后的细胞核充分重悬于1x nebuffer2中，分别加入dttp，dgtp，dctp，datp及biotin标记的dctp和datp，再加入dna ploymeraseⅰ和dnaseⅰ，于25℃反应2小时；最后加入终浓度50mm edta终止反应。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述dttp，dgtp，dctp，datp及biotin标记的dctp和datp的终浓度分别为0.05mm，0.05mm，0.025mm，0.035mm，0.025mm，0.015mm。11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述回收dna片段方法为：向反应液中加入rnase a，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入proteinase k和20％sds(w/v)，于65℃水浴中孵育过夜；第二天用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3m醋酸钠(ph 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收dna沉淀，用75％酒精清洗回收的dna沉淀，干燥后用eb缓冲液溶解。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述eb缓冲液的配方为：10mm tris-hcl,ph8.0。13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中片段化处理并检测片段化效果为：用非接触式超声波破碎仪处理溶于eb缓冲液的dna 3～15个循环，用琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果；经过片段化处理的dna片段均匀分布在100～250bp，用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3m醋酸钠和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收dna沉淀，用75％酒精清洗回收的dna沉淀，干燥后用eb缓冲液溶解。14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中用anti-streptavidin-beads回收biotin-标记的dna片段的过程为：充分重悬于4℃冰箱保存的anti-streptavidin-beads，分装beads到一个新的离心管中；用4℃预冷的1xtwb buffer重悬beads，静置1min后，用磁板回收beads，弃去上清；重复3次，最后1次尽量去除上清，加入1xtwb buffer重悬beads，将含有biotin-标记的dna复合物与等量的2xbb buffer混匀，再加入到清洗后的beads中，在混匀仪上于25～30℃，10rpm旋转0.5h；用磁板收集beads，弃去反应混合液，分离不能与biotin结合的dna片段。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述1xtwb buffer的配方为：0.5mm edta，5mm tris-hcl,ph 7.5，1m nacl，0.05％tween 20。16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述2xbb buffer的配方为：1mm edta，10mm tris-hcl,ph 7.5，2m nacl。17.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(7)的具体过程为：将步骤(6)中已结合有目的dna片段的beads直接用于构建illumina测序文库，分离纯化200-350bp dna片段用于illuminanovaseq测序平台进行2x150 pe测序。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤(7)的详细过程为：根据具体建库试剂盒说明书，加入相应体积的eb缓冲液重悬步骤(6)中的beads，再直接加入建库所用试剂；根据试剂盒说明书完成平末端修复和接头连接后，用磁板收集beads，弃去反应液；用1xtwb buffer重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，弃去上清；重复2次，最后1次尽量去除上清，再用eb缓冲液重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，尽量去除上清；加入适量eb缓冲液重悬beads，按照试剂盒说明书加入文库扩增所用试剂；文库扩增结束后，用磁板分离beads，保留上清，弃去beads；该上清经过纯化即为用于测序的文库dna，用于illuminanovaseq测序平台进行2x150 pe测序。19.权利要求1-18任一所述的一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法在农作物分子育种中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、小麦、玉米或拟南芥中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种在全基因组水平鉴定植物开放性染色质位点的方法（原位DNase-seq）。该方法包括如下步骤：（1）交联固定植物材料；（2）提取并纯化植物材料的细胞核；（3）加入DNaseI，DNA polymerase I及biotin-dATP和biotin-dNTP，酶切并原位标记开放性染色质位点；（4）回收DNA；（5）片段化DNA；（6）用anti-streptavidin-beads结合biotin标记的DNA片段；（7）建库和Illumina测序，经过生物信息学分析，在全基因组水平鉴定开放性染色质位点。本发明的整个方法流程简单，耗时较短，DNA片段化可视化效果强，理论上该方法适应于多种植物。理论上该方法适应于多种植物。理论上该方法适应于多种植物。


技术研发人员：张文利 史依宁 李兆国 韩琪 杨滢 李梦琪 何泽学 高志成 程雪姣
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.01.16
技术公布日：2023/8/5