一种以CKLF1-CCR5相互作用为靶标的药物筛选方法

一种以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学和药物研发技术领域，具体涉及一种以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选的方法。


背景技术：

2.缺血性损伤是指组织的供血受阻，因而出现的组织缺血导致的组织损伤，常见的缺血性损伤包括脑缺血、心肌缺血、肝缺血等。引起缺血性损伤的常见病因包括血管内壁发生变化、血栓、以及其他物理性因素等。缺血性损伤疾病具有高致残率、高经济负担等特点，严重危害患者的生命健康，为社会带来沉重的负担。针对不同器官的缺血性损伤，有不同的治疗方式，常见的如脑缺血与心肌缺血等疾病中的溶栓治疗。但由于其适用范围不大，时间窗窄，以及存在其他出血性转化风险等，限制了其临床的应用，目前针对缺血性损伤疾病并无特效药。因此，开发新型有效的治疗缺血性损伤的药物对于缺血性损伤的防治具有重要的意义。
3.趋化素样因子1(cklf1)是我国科学家克隆发现的趋化因子，对中性粒细胞、单核细胞等免疫细胞具有趋化活性，且参与多种炎症和免疫系统疾病的病理过程，与多种器官缺血性损伤密切相关。研究表明，在生理状态下，cklf1的表达很低。然而在脑缺血、肝缺血、心肌缺血发生时，cklf1在脑、肝脏、心脏的表达显著上调，通过调节多种生理活动，参与缺血性损伤。而阻断cklf1对于脑、肝脏、心肌等器官具有显著的保护作用，提示cklf1在缺血性损伤中具有重要的作用。
4.c-c趋化因子受体5(ccr5)是cklf1的作用受体之一，已被证实与炎症反应、感染等多种病理生理过程密切相关，多项报道证明ccr5通过介导免疫细胞浸润而导致组织损伤。研究表明，在脑卒中发生后，cklf1通过作用于中性粒细胞的ccr5，趋化中性粒细胞向缺血区域的迁移，募集于缺血区域的中性粒细胞通过释放大量的蛋白酶从而导致神经细胞的死亡。中性粒细胞的浸润是引起急性脑缺血再灌注损伤的主要因素之一，与脑缺血损伤严重程度及预后紧密相关。在肝脏缺血再灌注后，cklf1参与引起肝功能损伤与炎性细胞浸润，而阻断cklf1可通过mapk通路抑制中性粒细胞的浸润与炎症反应。在心肌缺血后，cklf1与梗死区心肌细胞的死亡密切相关，影响心肌梗死损伤的发生与预后。因此，干预cklf1与ccr5的相互作用，拮抗cklf1在缺血性损伤中的作用，对开发新型治疗缺血性损伤药物具有重要意义。
5.现有的ccr5抑制剂筛选技术包括基于结构的虚拟筛选、ccr5过表达细胞介导的生物学功效变化等。虚拟筛选能够高通量地对化合物库进行筛选，筛选成本低，且无需反复实验操作。然而其存在评价方法不完善等问题，打分高的化合物未必在生物学上是良好的配体，假阳性及假阴性现象也较常见。ccr5过表达细胞能够在细胞水平高通量筛选ccr5抑制剂，但无法直接反映特定配体-受体相互作用的干预情况。常用于研究蛋白相互作用的方法主要有免疫共沉淀法，酵母双杂交技术，荧光能量共振转移(fret)等。免疫共沉淀通过抗原-抗体反应进行检测，可分离天然状态的相互作用复合物，但无法在活细胞水平检测蛋白
相互作用以及高通量筛选。酵母双杂交技术利用杂交基因激活报告基因的表达，具有高度敏感性，但缺点是可能产生自激活的假阳性现象。荧光能量共振转移通过检测激发的荧光基团与荧光配体间的fret信号从而检测蛋白互作，可进行高通量的筛选与检测，但其需要激发光，本底值较高，且分子内的激发过程可能产生淬灭效应。
6.生物发光能量共振转移(bioluminescence resonance energy transfer,bret)是一种检测活细胞内蛋白相互作用的技术。当两个蛋白发生相互作用时，一个蛋白融合表达的供体荧光素酶基团的发射光光谱与另一个蛋白融合表达的受体荧光基团的激发光光谱重叠，从而诱发受体荧光基团发光，优势是无需激发光、避免光漂白、可进行活细胞水平的高通量检测等。
7.传统的bret技术存在荧光分子较大可能产生空间位阻，bret信号不强以及背景值较高等缺点。promega公司对传统bret方法进行改良，推出的新型nanobret技术，将nanoluc荧光素酶作为供体，halotag蛋白标记的nanobret 618荧光基团作为受体，使bret分析信号更强，背景更低，可用于检测蛋白相互作用与药物筛选。
8.利用nanobret技术，可在体外进行快速高效的活细胞水平蛋白相互作用检测与药物筛选，可直接在细胞水平观察药物分子对于cklf1-ccr5相互作用的干预，具有不引入激发光，背景值低，无淬灭和光漂白效应等优势。然而，在目前的国内外关于cklf1-ccr5与缺血性损伤治疗药物研究的相关报道中，均没有建立以cklf1-ccr5相互作用为靶标的检测体系与药物筛选体系。通过分子克隆技术将nanoluc/halotag与cklf1/ccr5基因片段融合连接并共转染表达于活细胞内，添加相应的halotag荧光基团、待测化合物孵育，最后添加荧光素酶底物进行反应，测定化学发光能量转移比可在活细胞水平观察药物分子对于cklf1-ccr5相互作用的影响。
9.因此基于以上内容，提出本发明。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选的方法，为抗缺血性损伤药物的靶点确证，以及cklf1-ccr5轴在缺血性损伤的作用机制研究与治疗缺血性损伤的药物开发提供基础。
11.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
12.基于nanobret的以cklf1和ccr5受体相互作用为靶点构建的体外药物筛选与评价模型
13.进一步的，利用分子克隆技术，将人cklf1基因与人ccr5基因与nanoluc或halotag连接构建融合蛋白质粒，得到8种不同组合的cklf1和ccr5融合蛋白质粒，分别为halotag融合连接至cklf1的c端(cklf1-ht)；halotag融合连接至cklf1的n端(ht-cklf1)；nanoluc融合连接至cklf1的c端(cklf1-nl)；nanoluc融合连接至cklf1的n端(nl-cklf1)；halotag融合连接至ccr5的c端(ccr5-ht)；halotag融合连接至ccr5的n端(ht-ccr5)；nanoluc融合连接至ccr5的c端(ccr5-nl)；nanoluc融合连接至ccr5的n端(nl-ccr5)。
14.所述构建方法包括以下步骤：
15.(1)人cklf1/ccr5基因片段的合成
16.(2)线性化表达载体的制备
17.(3)目的基因片段构建入线性化表达载体
18.(4)转化dh5α感受态细胞与菌落pcr鉴定阳性转化子
19.(5)阳性克隆测序与质粒提取
20.进一步的，对8种融合蛋白质粒构成的8种组合，即nl-cklf1+ht-ccr5；nl-cklf1+ccr5-ht；cklf1-nl+ht-ccr5；cklf1-nl+ccr5-ht；ht-cklf1+nl-ccr5；ht-cklf1+ccr5-nl；cklf1-ht+nl-ccr5；cklf1-ht+ccr5-nl进行实验选优。
21.所述实验选优方法包括以下步骤：
22.(1)hek293t细胞培养与接种于六孔板
23.(2)使用脂质体转染法进行不同质粒载体组合共转染
24.(3)收集转染完毕的细胞，接种于白底96孔板，进行nanobret
tm 618ligand(promega)孵育
25.(4)添加经培养基稀释后的nanobret
tm
substrate(promega)，并通过酶标仪进行460nm和615nm处的化学发光强度终点检测
26.(5)通过化学发光强度值计算bret比值，选择具有较好发光强度与bret比值且背景值低的质粒组合
27.优选的，最佳质粒组合为ht-cklf1+ccr5-nl，转染比例为1：1。
28.进一步的，利用优选的质粒组合与转染比例进行实验。使用脂质体转染法，将优选的两种融合蛋白质粒按照优选的转染比例共转染入hek293t细胞；
29.进一步的，在转染结束后，将细胞悬液分为对照组，无荧光基团对照组，阳性药tak-220组，待测药物组，分别加入nanobret
tm 618ligand(promega)、dmso、tak-220(购于mce，目录号hy-19974)nanobret
tm 618ligand(promega)、待测化合物nanobret
tm 618ligand(promega)进行孵育；
30.进一步的，过夜孵育后，加入nanobret
tm
substrate(promega)后，利用酶标仪进行615nm和460nm下的化学发光值的检测，并计算相应的bret比值。以对照组和阳性药tak-220组为参照，分析待测药物分子对于cklf1与ccr5的相互作用是否存在干预。
31.有益技术效果：本发明提供了基于nanobret技术的cklf1-ccr5相互作用的检测方法与药物筛选系统，将体外检测蛋白互作技术nanobret用于cklf1-ccr5的研究，筛选得到了最优的转染质粒组合与转染条件，构建了基于nanobret的以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选系统。与现有发明相比主要有以下有益效果：(1)本发明能够在体外对于cklf1-ccr5相互作用进行检测，且通过发光能量转移比进行量化，能够高通量筛选化合物，以及对于化合物的量效关系进行测定，无需提取细胞蛋白，可直接在活细胞水平进行直观测定。(2)本检测方法将nanoluc与halotag与ccr5/cklf1相融合，蛋白互作检测的光谱叠加强，背景值低，不使用外加激发光而不易发生淬灭及光漂白，具有灵敏、广泛、操作简便的特点。(3)本发明可用于在体外水平进行抗缺血性疾病药物的靶点确证，为研究缺血性疾病的病理机制以及治疗缺血性疾病的新药研发提供研究基础。
附图说明
32.图1为pfn21a-halotag-cklf载体物理图谱
33.图2为pfc14k-cklf-halotag载体物理图谱
34.图3为pfc32k-cklf-nluc载体物理图谱
35.图4为pfn31k-nluc-cklf载体物理图谱
36.图5为pfn21a-halotag-ccr5载体物理图谱
37.图6为pfc14k-ccr5-halotag载体物理图谱
38.图7为pfc32k-ccr5-nluc载体物理图谱
39.图8为pfn31k-nluc-ccr5载体物理图谱
40.图9为8种质粒组合在460nm处供体荧光基团发光强度值
41.图10为8种质粒组合在615nm处受体荧光基团发光强度值
42.图11为8种质粒组合的bret比值
43.图12为ht-cklf1和ccr5-nl在不同转染比例下在460nm处供体荧光基团发光强度值
44.图13为ht-cklf1和ccr5-nl在不同转染比例下在615nm处受体荧光基团发光强度值
45.图14为ht-cklf1和ccr5-nl在不同转染比例下的bret比值
46.图15为不同浓度阳性化合物tak-220的bret实验结果图
具体实施方式
47.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
48.实施例1人cklf1/人ccr5融合蛋白质粒载体的构建
49.分别使用pfn21acmvvector(promega)，pfc14kcmvvector(promega)，pfc32k nluc cmv-neovector(promega)，pfn31k nluc cmv-neovector(promega)作为质粒载体，将nanoluc或halotag连接至人cklf1或人ccr5的n端/c端，共构建8种融合蛋白载体，包括：pfn21a-halotag-cklf(ht-cklf1，将halotag连接至cklf1的n端，物理图谱见图1)；pfc14k-cklf-halotag(cklf1-ht，将halotag连接至cklf1的c端，物理图谱见图2)；pfc32k-cklf-nluc(cklf1-nl，将nanoluc连接至cklf1的c端，物理图谱见图3)；pfn31k-nluc-cklf(nl-cklf1，将nanoluc连接至cklf1的n端，物理图谱见图4)；pfn21a-halotag-ccr5(ht-ccr5，将halotag连接至ccr5的n端，物理图谱见图5)；pfc14k-ccr5-halotag(ccr5-ht，将halotag连接至ccr5的c端，物理图谱见图6)；pfc32k-ccr5-nluc(ccr5-nl，将nanoluc连接至ccr5的c端，物理图谱见图7)；pfn31k-nluc-ccr5(nl-ccr5，将nanoluc连接至ccr5的n端，物理图谱见图8)。
50.一、人cklf1/人ccr5基因片段的合成
51.从genbank中查询目的基因以及上下游的序列，用vectornti软件进行引物设计。
52.pcr扩增目的基因：使用高保真的primestar酶扩增目的基因，反应体系和条件见表1和表2。
[0053][0054]
二、线性化表达载体的制备
[0055]
用限制性内切酶对含有目的基因的质粒进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，用水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用takara minibest agarose gel dnaextraction kit ver.3.0做胶回收。
[0056]
三、目的基因片段构建入线性化表达载体
[0057]
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应buffer5μl，限制性内切酶各1μl，用水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用takara minibest agarose gel dna extraction kit ver.3.0做胶回收。
[0058]
将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应见表3：
[0059]
表3：
[0060][0061]
最适插入片段使用量＝[0.04x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)
[0062]
最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)
[0063]
混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化。
[0064]
四、转化dh5α感受态细胞与菌落pcr鉴定阳性转化子
[0065]
制备dh5α感受态细胞并进行转化，挑取平板上长出的转化子重悬于10μl lb培养液中，取1μl作为模板进行菌落pcr鉴定。反应体系和pcr循环条件见表4和表5：
207umbelliferone 460nm)和615nm处化学发光值(滤光片barcode 203europium 615nm)的检测，并计算bret比值，计算方法为bret比值(mbret ratio)＝受体(615nm)发光值
×
1000/供体(460nm)发光值。结果如图9-11所示，图9表示在460nm处供体发光信号值，图10表示在615nm处受体发光信号值，图11表示各组合的bret比值。ht-cklf1(halotag融合于cklf1的n端)与ccr5-nl组合(nanoluc融合于ccr5的c端)具有最显著的供体受体发光信号值，因此将ht-cklf1与ccr5-nl作为最佳质粒转染组合。
[0080]
二、最佳转染比例的优化
[0081]
1、细胞培养
[0082]
将hek293t细胞按照4
×
105个/ml的密度接种于6孔板，采用含10％的胎牛血清的dmem培养基，在含5％二氧化碳的37℃培养箱中培养。
[0083]
2、质粒载体共转染
[0084]
待细胞贴壁生长至75％左右时，使用viafect
tm
转染试剂(promega)，将ccr5-nl和ht-cklf1按照1：1、1：10、1：100、1：1000的不同转染比例共转染hek293t细胞，具体质粒用量见表6，转染时间1-2天。
[0085]
表6
[0086]
转染比例质粒用量1：1(ccr5-nl:ht-cklf1)1μg ht-cklf1+1μg ccr5-nl1：10(ccr5-nl:ht-cklf1)2μg ht-cklf1+0.2μg ccr5-nl1：100(ccr5-nl:ht-cklf1)2μg ht-cklf1+0.02μg ccr5-nl1：1000(ccr5-nl:ht-cklf1)2μg ht-cklf1+0.002μg ccr5-nl
[0087]
3、nanobret
tm 618ligand(promega)孵育
[0088]
转染完毕后，吸去6孔板上清培养基，分别用1ml pbs洗涤，加入0.5ml 0.25％胰酶-edta，消化，加入2ml含4％fbs的opti-mem无酚红培养基(gibco)中和胰酶，混合收集细胞悬液至15ml离心管。离心去掉上清培养基，重新悬浮细胞至等体积的含4％fbs的opti-mem培养基(gibco)中。细胞计数，调整密度为2
×
105个/ml。将每种转染组合的细胞悬液分为两个组实验组(加ligand)：每毫升细胞中避光加入1μl的0.1mmnanobret
tm 618ligand(promega)(终浓度100nm)；对照组(不加ligand)：每毫升细胞中加入1μl的dmso(终浓度0.1％dmso)。将制备好的细胞悬液按每孔100μl加入白底96孔板，在培养箱中避光孵育培养过夜(18-24h)
[0089]
4、nanobret
tm
substrate(promega)添加与终点检测过夜孵育后，准备添加荧光素酶底物。稀释底物：将nanobret
tm
substrate(promega)溶于不含血清的opti-mem培养基(gibco)(按照底物：培养基＝1：100的比例配制)，加入后涡旋混匀。每孔加入25μl稀释后的底物，加完底物后立刻放入酶标仪(perkin elmer envision 2104)振荡30s后，进行460nm处化学发光值(滤光片barcode 207umbelliferone 460nm)和615nm处化学发光值(滤光片barcode 203europium 615nm)的检测，并计算bret比值，计算方法为bret比值(mbret ratio)＝受体(615nm)发光值
×
1000/供体(460nm)发光值。结果如图12-14所示，图12表示在460nm处供体发光信号值，图13表示在615nm处受体发光信号值，图14表示各组合的bret比值。ht-cklf1(halotag融合于cklf1的n端)与ccr5-nl(nanoluc融合于ccr5的
c端)在1：1的转染比例下具有最显著的供体受体发光信号值，因此将最佳转染比例确定为1：1。
[0090]
通过实施例2的结果分析，确定本筛选方法最佳转染质粒组合为ht-cklf1与ccr5-nl，且最佳转染比例为1：1。
[0091]
实施例3基于nanobret的影响cklf1-ccr5相互作用的药物筛选方法
[0092]
1、细胞培养
[0093]
将hek293t细胞按照4
×
105个/ml的密度接种于六孔板，采用含10％的胎牛血清的dmem培养基，在含5％二氧化碳的37℃培养箱中培养。
[0094]
2、质粒载体共转染
[0095]
待细胞贴壁生长至75％左右时，使用viafect
tm
转染试剂(promega)，将1μg ccr5-nl融合蛋白质粒和1μg ht-cklf1融合蛋白质粒共转染六孔板每孔的hek293t细胞，转染时间1-2天。
[0096]
3、nanobret
tm 618ligand(promega)与化合物共孵育转染完毕后，吸去6孔板上清培养基，分别用1ml pbs洗涤，加入0.5ml 0.25％胰酶-edta，消化，加入2ml含4％fbs的opti-mem无酚红培养基(gibco)中和胰酶，混合收集细胞悬液至15ml离心管。离心去掉上清培养基，重新悬浮细胞至等体积的含4％fbs的opti-mem培养基(gibco)中。细胞计数，调整密度为2
×
105个/ml。细胞悬液分为四个组：对照组，无荧光基团对照组，阳性药tak-220组，实验药物组。对照组每毫升悬液加入1μlnanobret
tm 618ligand(promega)，无荧光基团对照组每毫升悬液加入1μl dmso，阳性药组每毫升加入1μlnanobret
tm 618ligand(promega)与不同浓度(10-9
mol/l、10-8
mol/l、10-7
mol/l、10-6
mol/l、10-5
mol/l)的tak-220(购于mce，目录号hy-19974)，实验药物组每毫升加入1μlnanobret
tm 618ligand(promega)与待测化合物。将制备好的细胞悬液按每孔100μl加入白底96孔板，在培养箱中避光孵育培养过夜(18-24h)
[0097]
4、nanobret
tm
substrate(promega)添加与终点检测过夜孵育后，准备添加荧光素酶底物。稀释底物：将nanobret
tm
substrate(promega)溶于不含血清的opti-mem培养基(gibco)(按照底物：培养基＝1：100的比例配制)，加入后涡旋混匀。每孔加入25μl稀释后的底物，加完底物后立刻放入酶标仪(perkin elmer envision 2104)振荡30s后，进行460nm处化学发光值(滤光片barcode 207umbelliferone 460nm)和615nm处化学发光值(滤光片barcode 203europium 615nm)的检测，并计算bret比值，计算方法为bret比值(mbret ratio)＝受体(615nm)发光值
×
1000/供体(460nm)发光值。经文献调研，使用ccr5拮抗剂tak-220(购于mce，目录号hy-19974)作为阳性药验证，结果如图15所示，tak-220在10nm到10μm浓度下均能显著降低bret比值，抑制cklf1-ccr5相互作用，因此tak-220作为该筛选体系的阳性对照药。
[0098]
通过实施例3验证了tak-220可作为筛选体系的阳性药，并且说明了在优选的质粒组合与转染比例的条件下可用于化合物筛选，该方法具有可行性与稳定性。
[0099]
综上所述，本发明将nanobret技术应用于cklf1-ccr5相互作用的研究，构建了相应的融合蛋白载体并进行了实验条件优化，建立了以cklf1-ccr5相互作用为靶标的检测方法与药物筛选系统，可进行药物分子对cklf1-ccr5相互作用影响的检测以及高通量的、灵
敏的、广泛的以cklf1-ccr5相互作用为靶点的新型抗缺血性损伤药物的筛选。
[0100]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行修改，改进或者等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法。2.根据权利要求1所述的一种以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法，其特征在于：基于nanobret技术。3.权利要求1所述的一种以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法的构建方法，其特征在于：利用分子克隆技术，将人cklf1/人ccr5基因与halotag/nanoluc融合连接，得到8种不同组合的融合蛋白质粒，分别为halotag融合连接至cklf1的c端；halotag融合连接至cklf1的n端；nanoluc融合连接至cklf1的c端；nanoluc融合连接至cklf1的n端；halotag融合连接至ccr5的c端；halotag融合连接至ccr5的n端；nanoluc融合连接至ccr5的c端；nanoluc融合连接至ccr5的n端。并对质粒组合和转染比例进行优选。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：优选得到的质粒组合为ht-cklf1即halotag融合连接至cklf1的n端，与ccr5-nl即nanoluc融合连接至ccr5的c端，优选转染比例为1：1。5.权利要求1所述的以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法在制备及筛选促进或抑制cklf1-ccr5相互作用的化合物中的应用。6.权利要求1所述的以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法在研究缺血性损伤发病机理中的应用。7.权利要求1所述的以cklf1-ccr5相互作用为靶标的药物筛选方法在筛选治疗缺血性损伤疾病药物中的应用。

技术总结
本发明属于分子生物学和药物研发技术领域，公开了一种以CKLF1-CCR5相互作用为靶标的药物筛选方法。通过融合蛋白载体构建与鉴定，条件优化筛选，构建了一种基于NanoBRET的以CKLF1-CCR5相互作用为靶标的药物筛选系统。本发明能直观、快速、高通量评价具有影响CKLF1-CCR5相互作用的潜在药物，为新型缺血性损伤治疗药物的开发提供研究基础。疗药物的开发提供研究基础。


技术研发人员：陈乃宏 叶君锐 楚世峰 张钊 闫旭
受保护的技术使用者：中国医学科学院药物研究所
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/5