通过LC-MS检测DNA中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法

通过lc-ms检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种通过lc-ms检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法。


背景技术：

2.基因(gene)的表达调控主要分为转录水平调控和表观水平调控，表观遗传是指生物体在不改变核dna序列的前提下影响个体发育并且是可遗传的，主要涉及dna甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码rna和rna甲基化等。不同于孟德尔的经典遗传学，基因功能的变化并不是由于基因序列的改变引起的。表观遗传调控作物重要农艺性状及提高抗逆性有着重要的意义，鉴定新的表观修饰可望为提高作物产量和抗逆性提供基因资源和理论基础。
3.表观遗传学是在研究与经典的孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的，是对经典遗传学的补充和进一步发展。基因组dna序列所提供的遗传信息和基因组dna上的修饰信息，这两种信息相互作用、保持平衡。细胞核个体的表现型受到自身基因转录的影响，因此可遗传的转录能提高表观遗传效应。染色质是dna和组蛋白结合的复合体，dna缠绕着组蛋白球体，若dna缠绕组蛋白的方式发生改变，基因表达也将改变。
4.dna甲基化是一种基因转录的重要的调节器，许多证据已经证实，异常的dna甲基化与不定期的基因沉默有关，若在启动子区域具有高水平的5-甲基胞嘧啶，将发生基因沉默。细菌广泛利用dna甲基化的表观遗传，控制dna-蛋白的相互作用。dna甲基化在基因组功能的表观遗传调控上发挥重要作用。
5.dna甲基化5mc修饰被广泛研究，其多为沉默相关基因表达，多分布在异染色质区域和转座子区域。随着检测手段和测序技术的发展，除5mc修饰之外，人们陆续在dna水平上检测到6ma修饰，5hmc修饰、4mc修饰以及5-甲酰基-2
’‑
脱氧胞嘧啶核苷修饰，这些修饰参与基因的表达调控并影响生长发育过程。5-氟脱氧胞苷(5-fluoro-2'-deoxycytidine，fdcyd)是一种氟嘧啶核苷类似物(cas no:10356-76-0)，是dna甲基转移酶(dnmt1)抑制剂，可以有效的抑制dna甲基化5mc修饰，目前已作为肿瘤选择性前药。在体内fdcyd可以被胞苷脱氨酶迅速转化为5-氟脱氧尿苷(fdurd)，随后代谢为5-氟尿嘧啶(fu)。通过lc-ms/ms可以在人类血浆中检测到fdcyd，但在dna水平上还未被检测到该修饰的存在。
6.本研究目的是开发和验证一种定量测定玉米dna中fdcyd的分析方法。我们使用dna消化成单核苷酸完成提取步骤，然后通过质谱对fdcyd进行定性，并通过色谱对玉米亚热带和热带自交系品种dna fdcyd进行定量分析。我们的检测方法使用了两种离子峰对fdcyd进行了准确的定性，进一步提高了对fdcyd检测的准确性。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的一个技术问题是如何检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：
9.s1、提取生物样本的dna，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；
10.s2、进行液相色谱-质谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5-氟脱氧胞苷含量和脱氧胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5-氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度；
11.所述5-氟脱氧胞苷含量根据在碰撞能量为5v,m/z为246.0-129.9的离子峰和碰撞能量为35v,m/z为246.0-112.9的离子峰对应的色谱峰进行定量；
12.所述脱氧胞嘧啶核苷含量根据在碰撞能量为6v,m/z为228.2-112.1的离子峰对应的色谱峰进行定量。
13.上述方法中，所述液相色谱-质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液(溶剂为水，溶质为甲酸)，b相为甲酸体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液(溶剂为乙腈，溶质为甲酸)；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到15.3min，流动相中的a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于15.3min到20min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于20min到30min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于30到41min，流动相中的a相占流动相的体积份数由大于0％线性上升至100％。
14.上述方法中，所述液相色谱采用的色谱柱为thermo scientific hypersil gold aq reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述5-氟脱氧胞苷的色谱峰的保留时间为4.2
±
1min分钟；所述脱氧胞嘧啶核苷的色谱峰的保留时间为2.2
±
1min分钟。
15.上述方法中，所述单核苷酸制备在如下反应体系中进行：所述dna的含量为500ng/300μl、腺苷脱氨酶抑制的含量为0.005μg/μl、四氢尿苷的含量为0.05μg/μl、抗氧化剂的含量为0.1mm、2，6-二叔丁基对甲基苯酚的含量为0.1mm、核酸酶p1的含量为1u、磷酸二酯酶i的含量为0.01u、乙酸钠的含量为0.1mm、zncl2的含量为0.0067mm，余量为水。
16.上述方法中，所述单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。
17.上述方法中，所述去磷酸化利用碱性磷酸酶进行。
18.上述方法中，所述去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
19.上述方法中，所述纯化单核苷酸采用截留分子量为10kda的超滤管进行。
20.本发明还提供液相色谱法检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：
21.s1、提取生物样本的dna，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；
22.s2、进行液相色谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5-氟脱氧胞苷含量和脱氧胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5-氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度；液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，b相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到15.3min，流动相中的a相占流动相的体积比
由100％线性下降至99％；从大于15.3min到20min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于20min到30min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于30到41min，流动相中的a相占流动相的体积份数由大于0％线性上升至100％。
23.上述方法中，所述液相色谱采用的色谱柱为thermo scientific hypersil gold aq reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述5-氟脱氧胞苷的色谱峰的保留时间为4.2
±
1min分钟；所述脱氧胞嘧啶核苷的色谱峰的保留时间为2.2
±
1min分钟。
24.本发明首次公开的通过lc-ms检测到dna中新的化学修饰5-氟脱氧胞苷修饰丰度，5-氟脱氧胞苷被报道作为肿瘤选择性前药，在dna水平上检测到该修饰不仅为该药物的开发提供了新的途径，对于核酸表观遗传修饰的研究领域也有着重要的价值。
附图说明
25.图1为实施例1中检测fdcyd输出的峰形图。图1中，横坐标为保留时间(min)，即fdcyd的出峰时间为4.26min。图1采用mrm：mrm质谱多反应监测(mrm，multiple reaction monitoring,mrm)技术是一种基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据，进行质谱信号采集的技术；具有灵敏、准确和特异等优点。
26.图2为实例1中检测fdcyd的m/z比，包含二个明显的分子量分别为129.9m/z和112.9m/z的碎片，且主要为129.9m/z，这与已报道的fdcyd的m/z一致。
27.图3为实施例1中检测dc输出的峰形图。横坐标为保留时间(min)，即dc的出峰时间为2.2min。
28.图4为实例1中检测dc的m/z比，包含一个明显的分子量分别为112.1m/z的碎片，这与已报道的fdcyd的m/z一致。
29.图5为实施例1建立的fdcyd标准曲线，在0.1ng/ml到1000ng/ml成线性分布，其中相关系数r2在0.99以上。
30.图6为实施例1建立的dc标准曲线，在0.04ng/ml到25ng/ml成线性分布，其中相关系数r2在0.99以上。
31.图7为实施例2检测玉米自交系chang3品种和dh29品种中fdcyd的峰形图。
32.图8为实施例2检测玉米自交系chang3品种和dh29品种中dc的峰形图。
33.图9为实施例3中热带和温带玉米自交系品种的fdcyd/dc的相对丰度结果图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
36.下述实施例中的5-氟脱氧胞苷(fdcyd)为5-氟脱氧胞苷，为上海源叶生物科技有限公司，货号为s40359。胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dc)为上海源叶生物科技有限公司，货号为b27360。
37.下述实施例中，玉米自交系chang3记载于非专利文献“genome-wide association study dissects the genetic architecture of oil biosynthesis in maize kernels”，公众可以从申请人处获得，以重复本技术实验。
38.实施例1制备标准曲线
39.1.制备浓度梯度5-氟脱氧胞苷(fdcyd)，浓度分别为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml。制备浓度梯度脱氧胞嘧啶核苷(dc)，浓度分别为0.04ng/ml、0.2ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml。
40.2、上机检测
41.采用液相色谱-质谱联用仪，以步骤1浓度梯度5-氟脱氧胞苷作为上机样本进行检测，获得5-氟脱氧胞苷修饰的丰度。本实施例具体采用安捷伦1260液相色谱-g6400系列三级四极杆质谱联用仪。
42.质谱中，检测5-氟脱氧胞苷m/z参数设置为246.0-129.9和246.0-112.9，collision energy参数设置分别为5和35；检测脱氧胞嘧啶核苷含量(dc)m/z参数设置为228.2-112.1，collision energy参数设置为6；具体按照表1设置质谱中“m/z”参数和“cid”参数。
43.表1质谱参数
[0044][0045]
表1中，fdcyd代表5-氟脱氧胞苷，dc代表脱氧胞嘧啶核苷。
[0046]
液相色谱的检测柱为thermo scientific hypersil gold aq reverse phase column(100x2.1mm,1.9um)。液相色谱的柱温为25℃。液相色谱的流动相中，a相为0.1％(体积比)甲酸水溶液，b相为乙腈(甲酸0.1％)。液相色谱的流动相流速为0.3ml/min。液相色谱的洗脱过程见表2：从0min到15.3min，a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从15.3min到20min，a相占流动相的体积比由99％线性下降至94％；从20min到30min，a相占流动相的体积比由94％线性下降至0％；从30min到41min，a相占流动相的体积份数由0％线性上升至100％。
[0047]
表2
[0048][0049][0050]
在阳离子模式下运行。喷射流技术esi源的参数设置：干燥器温度50℃，干燥器流量11l/min，雾化器压力为20psi，鞘气温度300℃，鞘气流量12l/min，毛细管电压1800v。
[0051]
fdcyd标准品的峰值对应的保留时间为4.2
±
1min，如果样本中具有4.2
±
1min的峰值，可以判断该峰值对应的化合物为fdcyd。采用dc标准品的峰值对应的保留时间为2.2min，如果样本中具有2.2
±
1min的峰值，可以判断该峰值对应的化合物为dc。
[0052]
fdcyd的相对丰度＝峰形图中fdcyd相应的峰面积/峰型图中dc相应的峰面积。
[0053]
检测fdcyd输出的峰形图见图1。图1中，横坐标为保留时间(min)，即fdcyd的出峰时间为4.26min。fdcyd输出的质谱图见图2。图2中包含二个明显的分子量分别为129.9m/z和112.9m/z的碎片，且主要为129.9m/z。
[0054]
检测dc输出的峰形图见图3。图3中，横坐标为保留时间(min)，即dc的出峰时间为2.2min。dc输出的质谱图见图4。图4中包含一个明显的分子量分别为112.1m/z的碎片。
[0055]
图5为建立的fdcyd标准曲线，在0.1ng/ml到1000ng/ml成线性分布，其中相关系数r2在0.99以上，表明制备的标准曲线具有很强的可行度和线性关系。
[0056]
图6为建立的dc标准曲线，在0.04ng/ml到25ng/ml成线性分布，其中相关系数r2在0.99以上，表明制备的标准曲线具有很强的可行度和线性关系。
[0057]
实施例2、5-氟脱氧胞苷的优化检测
[0058]
一、制备上机样本
[0059]
1、制备核酸样本
[0060]
核酸样本为玉米自交系chang3和dh29样本dna。
[0061]
制备dna样本的方法：提取dna，然后95℃变性5min，得到dna样本。
[0062]
2、取步骤1得到的核酸样本，进行单核苷酸制备。
[0063]
反应体系为300ul。反应体系中，核酸含量为500ng(由核酸样本提供)、腺苷脱氨酶抑制剂浓度为0.005μg/μl、四氢尿苷浓度为0.05μg/μl、抗氧化剂浓度为0.1mm、2，6-二叔丁基对甲基苯酚浓度为0.1mm、核酸酶p1含量为1u、磷酸二酯酶i含量为0.01u、乙酸钠浓度为0.1mm、zncl2浓度为0.0067mm，余量为水。
[0064]
本实施例中采用的具体腺苷脱氨酶抑制剂为erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine(ehma)hydrochloride,sigma公司，货号e114。
[0065]
本实施例中采用的具体抗氧化剂为去铁胺(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,y0001937)。
[0066]
本实施例中采用的具体磷酸二酯酶i为蛇毒磷酸二酯酶i(上海源叶生物科技有限
公司，s10225。
[0067]
核酸样本为dna样本时的反应条件：37℃、5小时。
[0068]
3、步骤2后，在体系中加入10u碱性磷酸酶进行反应。
[0069]
本实施例中采用的具体碱性磷酸酶为小牛肠碱性磷酸酶(cip)，neb公司，货号mo290s。
[0070]
反应条件：37℃、1小时。
[0071]
4、取步骤3的产物，纯化单核苷酸，具体如下：
[0072]
完成步骤3后，将体系加至10kd超滤管，13000rpm离心10min，收集滤液，即为上机样本。
[0073]
按照实施例1描述的方法对玉米dna样本进行检测，核酸样本为dna样本，目标检测对象为fdcyd和dc，“cid”参数为表1中参数值，洗脱过程为表2中的优化洗脱过程。结果见图4。
[0074]
fdcyd的丰度＝峰型图中fdcyd相应的峰面积/峰型图中dc相应的峰面积。
[0075]
图7为检测玉米自交系chang3品种和dh29品种中fdcyd的出峰时间及面积，图8为检测玉米自交系chang3品种和dh29品种中dc的出峰时间及面积。根据图5和图6中fdcyd和dc的标准曲线判断出chang3品种和dh29品种所含有的fdcyd绝对含量分别为0.02039ng/ml和0.0086ng/ml。
[0076]
实施例3、效果验证
[0077]
生物样本为：玉米热带品种gems32、chang3、jy01、mo17、b73、dh29和亚热带玉米品种cimbl47 dan599、cimbl146。这些玉米材料均记载于“genome-wide selection and genetic improvement during modern maize breeding”。
[0078]
设置三个生物学重复，结果取平均值。
[0079]
按照实施例2描述的方法对生物样本进行处理，核酸样本为dna样本，目标检测对象为fdcyd和dc，“cid”参数为表1中的优化后参数，洗脱过程采用表2中的洗脱过程。
[0080]
fdcyd标准品的峰值对应的保留时间为4.2
±
1min，如果样本中具有4.2
±
1min的峰值，可以判断该峰值对应的化合物为fdcyd。采用dc标准品的峰值对应的保留时间为2.2min，如果样本中具有2.2
±
1min的峰值，可以判断该峰值对应的化合物为dc。
[0081]
fdcyd的相对丰度＝峰形图中fdcyd相应的峰面积/峰型图中dc相应的峰面积。
[0082]
图9显示不同生长环境(热带和温带)下玉米自交系品种的fdcyd的修饰丰度，在不同玉米自交系中fdcyd的丰度差异较大，但都有一定的丰度，这表明fdcyd在玉米自交系中的普遍性。
[0083]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.液相色谱-质谱法检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：s1、提取生物样本的dna，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；s2、进行液相色谱-质谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5-氟脱氧胞苷含量和脱氧胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5-氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度；所述5-氟脱氧胞苷含量根据在碰撞能量为5v，m/z为246.0-129.9的离子峰和碰撞能量为35v，m/z为246.0-112.9的离子峰对应的色谱峰进行定量；所述脱氧胞嘧啶核苷含量根据在碰撞能量为6v，m/z为228.2-112.1的离子峰对应的色谱峰进行定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，b相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到15.3min，流动相中的a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于15.3min到20min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于20min到30min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于30到41min，流动相中的a相占流动相的体积份数由大于0％线性上升至100％。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱采用的色谱柱为thermo scientific hypersil gold aq reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述5-氟脱氧胞苷的色谱峰的保留时间为4.2
±
1min分钟；所述脱氧胞嘧啶核苷的色谱峰的保留时间为2.2
±
1min分钟。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述单核苷酸制备在如下反应体系中进行：所述dna的含量为500ng/300μl、腺苷脱氨酶抑制的含量为0.005μg/μl、四氢尿苷的含量为0.05μg/μl、抗氧化剂的含量为0.1mm、2，6-二叔丁基对甲基苯酚的含量为0.1mm、核酸酶p1的含量为1u、磷酸二酯酶i的含量为0.01u、乙酸钠的含量为0.1mm、zncl2的含量为0.0067mm，余量为水。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述去磷酸化利用碱性磷酸酶进行。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述纯化单核苷酸采用截留分子量为10kda的超滤管进行。9.液相色谱法检测dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：s1、提取生物样本的dna，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；s2、进行液相色谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5-氟脱氧胞苷含量和脱氧
胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5-氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的dna中5-氟脱氧胞苷修饰丰度；液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，b相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到15.3min，流动相中的a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于15.3min到20min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于20min到30min，流动相中的a相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于30到41min，流动相中的a相占流动相的体积份数由大于0％线性上升至100％。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述液相色谱采用的色谱柱为thermo scientific hypersil gold aq reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述5-氟脱氧胞苷的色谱峰的保留时间为4.2
±
1min分钟；所述脱氧胞嘧啶核苷的色谱峰的保留时间为2.2
±
1min分钟。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，涉及通过LC-MS检测DNA中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：S1、提取生物样本的DNA，进行单核苷酸制备，再去磷酸化，纯化单核苷酸，得到上机样本；S2、进行液相色谱-质谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5-氟脱氧胞苷含量和脱氧胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5-氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的DNA中5-氟脱氧胞苷修饰丰度。本发明首次在DNA上准确检测出了5-氟脱氧胞苷，并且准确定量了玉米中5-氟脱氧胞苷修饰丰度。氟脱氧胞苷修饰丰度。氟脱氧胞苷修饰丰度。


技术研发人员：普莉 张道磊 乐亮
受保护的技术使用者：中国农业科学院生物技术研究所
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/8/5