一种功能食品中活性成分的检测方法

1.本发明属于食品分析检测领域，具体涉及一种功能食品中活性成分的检测方法，尤其涉及一种操作简单的功能食品中活性成分的检测方法。


背景技术：

2.目前食品中的成分检测大多采用单独检测的方法，但是大多食品中含有植物成分等天然成分，从而导致食品中活性成分复杂。因此，如果采用传统方法，就需要建立多个检测方法，从而极大的增加产品的检测成本，也不利于产品质量控制。
3.cn103592449a公开了一种食品多功能检测系统，该检测系统包括：电源模块、系统设置单元、样品前处理单元、检测单元、信息输出单元，电源模块为样品前处理单元和检测主机单元提供电力，系统设置单元用于设置样品前处理单元和检测单元的参数，样品前处理单元用于对待测样品进行前处理，检测单元用于对样品进行检测处理，信息输出单元用于输出测试结果。该发明中的多功能检测系统能对食品的多种成分进行有效检测，实现了检测功能的多样化和测试过程的连续化，能较好的满足实际检测的需要，但是其需要采用特殊设备，提高了使用的成分
4.由于多数食品来源于天然植物，具有成分复杂的特征，如果对食品中相关成分单独检测，不仅要耗费较长时的时间，还要采购较多的标准品，费用消耗大。因此，如何提供一种能够有效减少成本、一次性同时检测多种成分的方法，成为了亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种功能食品中活性成分的检测方法，尤其提供一种操作简单的功能食品中活性成分的检测方法。本发明提供的检测方法能够一次同时测定包括腺苷在内的多种食品中活性成分的含量，具有实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的优点。
6.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，所述活性成分包括腺苷，还包括环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸中任意一种或至少两种的组合；
8.所述检测方法包括以下步骤：
9.(1)将待测样品与醇溶液混合超声，即得到供试品溶液；
10.(2)将腺苷与醇溶液混合，得到对照品溶液；
11.(3)将供试品溶液和对照品溶液进行液相检测，计算待测样品中腺苷的含量，之后通过相对校正因子计算其余活性成分的含量。
12.步骤(1)、(2)不区分先后顺序。
13.环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸含量的计算公式为：
14.含量(mg/g)＝(cs/w)
×
(ai/as)
×v×
f；
15.其中，cs为对照品溶液浓度(mg/ml)，w为待测样品质量(g)，ai为液相检测结果中环
磷酸腺苷、尿苷或绿原酸的峰面积，as为对照品溶液液相检测结果中腺苷的峰面积，v为步骤(1)醇溶液体积(ml)，f为相对校正因子。
16.上述方法通过采用相对校正因子，能够通过经检测样品中腺苷的含量一次同时完成其他活性成分的检测，大大简化了常规方法中的流程，具有实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的优点。
17.优选地，所述活性成分为腺苷、环磷酸腺苷、尿苷和绿原酸。
18.优选地，步骤(1)、(2)所述醇溶液包括甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的质量分数为50-90％，例如50％、60％、70％、80％或90％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
19.优选地，步骤(3)所述相对校正因子由包括以下步骤的方法得到：
20.将腺苷，和环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸中任意一种或至少两种的组合与醇溶液混合，得到混合标准品溶液，之后进行液相检测，根据检测结果，以腺苷为内参物质，计算得到其他活性成分相较于腺苷的相对校正因子。
21.相对校正因子的计算公式如下：
22.fs/i＝ai
×
cs/(as
×
ci)；
23.其中fs/i为环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸相较于腺苷的相对校正因子，as为液相检测结果中腺苷的峰面积，ai为液相检测结果中环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸的峰面积，cs为腺苷的质量浓度，ci为其他活性成分的质量浓度。
24.上述方法能够有效准确得到环磷酸腺苷、尿苷或绿原相对于腺苷的相对校正因子，进而使得在样品检测中仅检测腺苷含量即可计算得到环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸的含量，大大简化了常规方法中的流程，具有实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的优点。
25.优选地，所述液相检测的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为乙腈-甲醇混合溶液，所述流动相b为磷酸二氢钾-磷酸水溶液。
26.上述特定流动相选择能够有效提高检测的准确性。
27.优选地，所述液相检测的色谱柱为c18色谱柱。
28.优选地，所述流动相a中，乙腈和甲醇的体积比为(85-95):(5-15)，例如85:14、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6或95:5等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
29.优选地，所述流动相b中，磷酸二氢钾的浓度为0.3-0.5m，磷酸的质量分数为0.2-0.8％，其中，磷酸二氢钾的浓度可以是0.3m、0.35m、0.4m、0.45m或0.5m等，磷酸的质量分数可以是0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％或0.8％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
30.优选地，所述液相检测采用梯度洗脱程序，具体如下：
31.第0-4min，流动相a的体积分数由5％匀速变为8％，流动相b的体积分数由95％匀速变为92％；
32.第4-8min，流动相a的体积分数由8％匀速变为10％，流动相b的体积分数由92％匀速变为90％。
33.上述特定洗脱程序能够显著提高检测的准确性。
34.优选地，所述液相检测的流速为0.8-1.2ml/min。
35.优选地，所述液相检测的柱温为20-40℃。
36.其中，流速可以是0.8ml/min、0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min或1.2ml/min等，柱温可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
37.优选地，所述液相检测采用双波长检测。
38.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
39.本发明提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，通过采用相对校正因子，能够通过经检测样品中腺苷的含量一次同时完成其他活性成分的检测，大大简化了常规方法中的流程，具有实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的优点；并通过选择特定流动相和洗脱程序，有效提高了检测的准确性。
附图说明
40.图1是实施例1中混合对照品溶液260nm处的色谱图，其中1为尿苷，2为环磷酸腺苷，3为腺苷；
41.图2是实施例1中混合对照品溶液327nm处的色谱图，其中4为绿原酸；
42.图3是实施例1中批次1的供试品溶液260nm处的色谱图，其中1为尿苷，2为环磷酸腺苷，3为腺苷；
43.图4是实施例1中批次1的供试品溶液327nm处的色谱图，其中4为绿原酸。
具体实施方式
44.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
45.实施例1
46.本实施例提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，具体步骤如下：
47.供试品溶液的制备：取番茄粉、黑木耳粉和红枣粉各0.5g混合，置于容量瓶，加80wt％甲醇水溶液至5ml，摇匀，100hz超声处理30min，过微孔滤膜(0.45μm)，即得供试品溶液。
48.混合标准品溶液的制备：分别精确称取4种对照品10mg，用80wt％甲醇水溶液配置成100μg/ml的腺苷、尿苷、环磷酸腺苷、绿原酸的混合标准品溶液。
49.对照品溶液的制备：将腺苷用80wt％甲醇水溶液配制成100μg/ml的对照品溶液。
50.相对校正因子计算：
51.将混合标准品溶液进行液相检测，条件如下：
52.流动相a：乙腈-甲醇混合溶液(体积比90:10)；流动相b：磷酸二氢钾-磷酸水溶液(磷酸二氢钾浓度0.4m，磷酸质量分数0.55)；
53.梯度洗脱程序如下：
54.第0-4min，流动相a的体积分数由5％匀速变为8％，流动相b的体积分数由95％匀速变为92％；
55.第4-8min，流动相a的体积分数由8％匀速变为10％，流动相b的体积分数由92％匀速变为90％；
56.c18色谱柱(agilgent zorba
×
sb c18(4.6
×
250mm，5μm)，流速为1ml/min，柱温为30℃，采用双波长检测(260nm、327nm)。
57.将混合标准品溶液按不同的进样量进行进样(结果见图1-2，其中1为尿苷，2为环磷酸腺苷，3为腺苷，4为绿原酸)，根据结果计算不同进样量下的相对校正因子，取平均值，相对校正因子计算公式如下：
58.fs/i＝ai
×
cs/(as
×
ci)；
59.其中fs/i为环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸相较于腺苷的相对校正因子，as为液相检测结果中腺苷的峰面积，ai为液相检测结果中环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸的峰面积，cs为腺苷的质量浓度，ci为其他活性成分的质量浓度。
60.结果如下：
[0061][0062]
之后采用上述液相方法(进样量固定为10μl)对四个批次的样品进行检测(批次1的结果见图3-4，其中1为尿苷，2为环磷酸腺苷，3为腺苷，4为绿原酸)，结合相对校正因子计算尿苷、环磷酸腺苷和绿原酸含量，并与外标法(即将检测物峰面积带入对应标准曲线后计算获得检测物的含量)进行比对，结果如下：
[0063][0064]
可见结果中差异无统计学意义，表明本发明方法能够替代现有外标法，同时通过仅对腺苷含量进行测定，就可计算出其他活性成分的含量，相比外标法具有显著的优势。
[0065]
对比例1
[0066]
本对比例提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，具体步骤中除梯度洗脱程序如下外，其余与实施例1一致。
[0067]
第0-4min，流动相a的体积分数由5％匀速变为10％，流动相b的体积分数由95％匀速变为90％；
[0068]
第4-8min，流动相a的体积分数保持10％，流动相b的体积分数保持90％。
[0069]
对比例2
[0070]
本对比例提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，具体步骤中除梯度洗脱程
序如下外，其余与实施例1一致。
[0071]
第0-8min，流动相a的体积分数由5％匀速变为15％，流动相b的体积分数由95％匀速变为85％。
[0072]
对比例3
[0073]
本对比例提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，具体步骤中除流动相a为纯乙腈外，其余与实施例1一致。
[0074]
对比例4
[0075]
本对比例提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，具体步骤中除流动相a为纯甲醇外，其余与实施例1一致。
[0076]
对比例5
[0077]
本对比例提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，具体步骤中选择尿苷而非腺苷作为内标，进行分析检测，其检测结果如下表所示。用尿苷作为内标时，由于尿苷峰面积较小，含量低，使得计算其他物质含量时容易出现误差，与外标法检测检测的结果之间偏差也较大。因此，选择尿苷作为内标物不合适。
[0078][0079]
因此在本发明中，选择了峰面积较大，分离度好，含量较高的腺苷作为作为内标物，以减少其他色谱峰相对峰面积的误差，以提高检测的准确度。
[0080]
将实施例1和对比例1-4的测试结果汇总如下(实施例1取批次1)：
[0081][0082]
根据以上数据可以发现，本发明提供的方法通过选择特定流动相和洗脱程序有效提高了检测的准确性。
[0083]
方法学考察(以实施例1批次1为基础)：
[0084]
系统适应性及专属性考察：
[0085]
分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液，按照既定色谱条件进样测定，结果4种成分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，内参成分腺苷理论塔板数均在90000以上，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。
[0086]
线性考察：
[0087]
精密吸取对照品溶液，分别依次用80％甲醇溶液梯度稀释，制得6种不同浓度的标准混合溶液。按照色谱条件进样测定。以浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)进行回归，结果见下表，可知各成分在各自范围内线性关系良好。
[0088]
组分线性回归方程相关系数(r)线性范围(μg/ml)腺苷y＝32.27855x-1.659080.999980.396～198环磷酸腺苷y＝30.484x+5.38360.999980.99～99尿苷y＝25.05090x-0.262690.999990.396～198绿原酸y＝18.94810x-13.845550.999960.98～490
[0089]
精密度试验：
[0090]
取对照品溶液，按照色谱条件进样6次，记录各峰的保留时间和峰面积，计算各峰的峰面积rsd值分别为0.51％、0.63％、0.93％、1.09％。结果表明精密度良好。
[0091]
稳定性试验：
[0092]
精密称取含番茄粉、黑木耳粉和红枣粉的功能食品1.5g，按供试品溶液处理方法制备得供试品溶液，按色谱条件进样分析，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，记录峰面积，计算得各峰的峰面积rsd值分别为1.23％、1.08％、2.45％、1.18％，结果表明，样品溶液在24h内稳定，方法稳定性好。
[0093]
重复性试验：
[0094]
精密称取含番茄粉、黑木耳粉和红枣粉的功能食品6份，每份1.5g，制备得6份供试品溶液，按色谱条件进样测定分析，记录相应峰面积，计算得6份样品中腺苷、尿苷、环磷酸腺苷、绿原酸的平均含量分别为139.23μg/g、70.73μg/g、90.76μg/g、84.82μg/g，6份样品测得各成分含量的rsd值分别为0.79％、1.63％、1.04％、1.66％，结果表明本方法重复性良好。
[0095]
加样回收试验：
[0096]
精密称取同一批含有量已知的供试品6份，按已知方法制备供试品溶液，按1:1比例分别加入等量对照品溶液，按色谱条件进样测定，计算回收率，结果见下表。
[0097][0098][0099]
可以发现本发明提供的方法准确性高。
[0100]
耐用性考察(以实施例1批次1为基础)：
[0101]
对相对校正因子的耐用性进行了考察，考察了不同色谱柱、体积流量、柱温对各成分相对校正因子的重复性，用于验证本发明的方法在含番茄粉、黑木耳粉和红枣粉的功能食品质量控制中的可行性和技术适应性。结果表明，不同条件下相对校正因子的耐用性较好，rsd《5％，表明该方法稳定可行，可用于上述4种成分的含量测定。具体如下：
[0102]
色谱柱
[0103]
分别使用agilgent zorba
×
sb c18、angilent eclipse xdb c18色谱柱按既定色谱条件进样测定，考察不同色谱柱对相对校正因子的影响，结果见下表。由结果可知，不同色谱柱影响不明显，系统耐用性良好。
[0104]
不同色谱柱对相对校正因子的影响
[0105]
[0106]
流速
[0107]
精密吸取混合对照品溶液10μl，按色谱条件进样测定，考察0.8、1.0、1.2ml/min流速对相对校正因子的影响，结果见下表。由结果可知，不同体积流速对相对校正因子影响不明显，系统耐用性良好。
[0108]
不同流速对相对校正因子的影响
[0109][0110][0111]
柱温
[0112]
取混合对照品溶液10μl，按色谱条件下进样测定，考察20、30、40℃不同柱温对相对校正因子的影响，结果见下表。由结果可知，不同柱温对相对校正因子影响不明显，耐用性良好。
[0113]
不同柱温对相对校正因子的影响
[0114][0115]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的功能食品中活性成分的检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0116]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0117]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

技术特征：
1.一种功能食品中活性成分的检测方法，其特征在于，所述活性成分包括腺苷，还包括环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸中任意一种或至少两种的组合；所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品与醇溶液混合超声，即得到供试品溶液；(2)将腺苷与醇溶液混合，得到对照品溶液；(3)将供试品溶液和对照品溶液进行液相检测，计算待测样品中腺苷的含量，之后通过相对校正因子计算其余活性成分的含量；步骤(1)、(2)不区分先后顺序。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述活性成分为腺苷、环磷酸腺苷、尿苷和绿原酸。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)、(2)所述醇溶液包括甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的质量分数为50-90％。4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述相对校正因子由包括以下步骤的方法得到：将腺苷，和环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸中任意一种或至少两种的组合与醇溶液混合，得到混合标准品溶液，之后进行液相检测，根据检测结果，以腺苷为内参物质，计算得到其他活性成分相较于腺苷的相对校正因子。5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为乙腈-甲醇混合溶液，所述流动相b为磷酸二氢钾-磷酸水溶液。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述流动相a中，乙腈和甲醇的体积比为(85-95):(5-15)；优选地，所述流动相b中，磷酸二氢钾的浓度为0.3-0.5m，磷酸的质量分数为0.2-0.8％。7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测采用梯度洗脱程序，具体如下：第0-4min，流动相a的体积分数由5％匀速变为8％，流动相b的体积分数由95％匀速变为92％；第4-8min，流动相a的体积分数由8％匀速变为10％，流动相b的体积分数由92％匀速变为90％。8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测的流速为0.8-1.2ml/min。9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测的柱温为20-40℃。10.根据权利要求1-9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测采用双波长检测。

技术总结
本发明提供了一种功能食品中活性成分的检测方法，所述活性成分包括腺苷，以及环磷酸腺苷、尿苷或绿原酸中任意一种或至少两种的组合；所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品与醇溶液混合超声，即得到供试品溶液；(2)将腺苷与醇溶液混合，得到对照品溶液；(3)将供试品溶液和对照品溶液进行液相检测，计算待测样品中腺苷的含量，之后通过相对校正因子计算其余活性成分的含量。本发明提供的检测方法能够一次同时测定包括腺苷在内的多种食品中活性成分的含量，具有实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的优点。稳定可控的优点。稳定可控的优点。


技术研发人员：饶亮明 刘红彦 姜佳 张颖 刘国洪
受保护的技术使用者：中国科学院上海营养与健康研究所
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/8/6