一株帕万氏寡养单胞菌及其在处理染料废水中的应用

1.本发明涉及染料废水处理技术领域，特别是涉及一株帕万氏寡养单胞菌及其在处理染料废水中的应用。


背景技术：

2.随着工业化进程的加快，水污染问题已成为各国政府和研究人员普遍关注的问题。含染料废水是主要的环境问题之一，大量的工业(纺织、造纸或纸浆、食品、皮革)会产生含染料和悬浮颗粒等的废水，且有些染料难以被微生物降解，对人类、水生生物和微生物有毒，其中许多具有致癌性、致畸性、诱变性。
3.絮凝是一种简单、低成本和环保的分离工艺，能去除工业和生活废物、废水中的悬浮颗粒、染料和重金属等。絮凝剂包括无机絮凝剂(如聚合氯化铝)、有机合成絮凝剂(如聚丙烯酰胺衍生物)和天然絮凝剂(如生物絮凝剂和壳聚糖)三类。无机絮凝剂和有机合成絮凝剂因其经济高效的优势而被广泛应用于工业领域，但其大量使用导致产生大量废物，难以降解，造成二次污染，导致一些环境和健康问题。
4.微生物絮凝剂作为主要的生物絮凝剂，是由微生物代谢产生或分泌的一类具有絮凝活性的物质，包括胞外多糖、糖醛酸、糖脂、蛋白质、脂类和核酸等，可以作为无机絮凝剂和有机絮凝剂的替代品用于废水处理，是可生物降解的无毒絮凝剂，在相关工业和废水处理中有更大的应用潜力，而且对人类和生态的危害更小。因此，发现具有较好絮凝作用的新菌株对于通过微生物处理工业废水具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株帕万氏寡养单胞菌及其在处理染料废水中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株絮凝和染料去除效果优良，絮凝率最高可达99.0％，脱色率最高可达95.6％。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一株帕万氏寡养单胞菌(stenotrophomonas pavanii)，已于2023年5月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.27475。
8.本发明还提供了所述的帕万氏寡养单胞菌或其发酵产物的应用，包括如下任一项所述的应用：
9.(1)在废水絮凝处理中的应用；
10.(2)在制备废水处理中生物絮凝剂的应用；
11.(3)在染料废水脱色处理中的应用；
12.(4)在制备染料废水脱色处理中脱色剂中的应用。
13.本发明还提供了一种所述的帕万氏寡养单胞菌的培养方法，包括将所述帕万氏寡养单胞菌接种于发酵培养基中培养的步骤；其中，所述培养的条件为：30℃，摇床转数为
180r/min；所述发酵培养基为：葡萄糖10g/l、酵母膏0.5g/l、尿素0.5g/l、k2hpo
4 5g/l、kh2po
4 2g/l、nacl 0.1g/l和mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。
14.本发明还提供了一种絮凝废水的方法，包括将所述的帕万氏寡养单胞菌经发酵培养后的发酵液接种于废水中进行絮凝处理的步骤；其中，所述发酵培养的条件为：30℃，摇床转数为180r/min；发酵培养基为：葡萄糖10g/l、酵母膏0.5g/l、尿素0.5g/l、k2hpo
4 5g/l、kh2po
4 2g/l、nacl 0.1g/l和mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。
15.本发明还提供了一种染料废水脱色的方法，包括将所述的帕万氏寡养单胞菌经发酵培养后的发酵液接种于染料废水中的步骤；其中，所述发酵培养的条件为：30℃，摇床转数为180r/min；发酵培养基为：葡萄糖10g/l、酵母膏0.5g/l、尿素0.5g/l、k2hpo
4 5g/l、kh2po
4 2g/l、nacl 0.1g/l和mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。
16.本发明还提供了一种生物絮凝剂，包含所述的帕万氏寡养单胞菌或其发酵产物。
17.本发明还提供了一种染料废水脱色剂，包含所述的帕万氏寡养单胞菌或其发酵产物。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明分离得到了一株帕万氏寡养单胞菌gxun74707，该菌株具有生物絮凝和去除染料的特性，用其发酵液分别处理高岭土溶液和含有刚果红的染料废水，絮凝率最高可达99.0％，脱色率最高可达95.6％。本发明提供的帕万氏寡养单胞菌在废水絮凝和染料废水脱色方面具有良好的应用前景，絮凝和去除染料效果优良，且不会产生有毒物质，不会对环境造成二次污染。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为菌株gxun74707的系统发育树；
22.图2为实验例2中不同静置时间对菌株gxun74707发酵液絮凝率的影响；
23.图3为实施例3中菌株gxun74707的发酵液对含有刚果红染料废水处理前后的效果图；
24.图4为实验例3中不同沉降时间对菌株gxun74707发酵液脱色率的影响；
25.图5为实施例4中菌株gxun74707所分泌絮凝剂的分布情况。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包
括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.以下实施例或实验例中所用的培养基配方：
32.(1)固体lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂10-15g/l，ph 7.0。
33.(2)液体lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。
34.(3)发酵培养基：葡萄糖10g/l，酵母膏0.5g/l，尿素0.5g/l，k2hpo
4 5g/l，kh2po42g/l，nacl 0.1g/l，mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。
35.实施例1菌株分离筛选
36.1、试验样品
37.试验样品采样地点为广西民族大学思源湖校区思源湖土壤。
38.2、实验方法
39.2.1分离筛选
40.(1)菌株分离纯化：取1g样品置于装有10ml无菌水的离心管中，180r/min振荡30min，将样品菌悬液稀释到10-2
，10-3
和10-4
，分别取200μl涂布在固体lb培养基上，30℃培养1-2d，挑取单菌落划线纯化菌株，获得纯菌落4℃保存。
41.(2)初筛：将分离纯化后的菌株接种至液体lb培养基中，培养至od
600
＝1.0时，按1％的接菌量转接至发酵培养基中，30℃、180r/min条件下发酵培养。测定发酵液的絮凝率，选出絮凝率大于70％的菌株。
42.(3)复筛：选取初筛中絮凝率大于70％的菌株，将菌株接种至装有30ml液体lb培养基的三角瓶中，30℃，180r/min的条件下培养至od
600
＝1.0作为种子液，按1％的接菌量转接至发酵培养基中，30℃、180r/min条件下发酵培养。测定发酵液的絮凝率，选出絮凝率最高的菌株。通过此方法，获得了一株菌，命名为gxun74707，其絮凝率为82.4％。
43.上述(2)和(3)中，测定絮凝率的方法如下：
44.s1：将菌株在液体lb培养基中培养活化，10h后，测其od
600
值，od
600
＝1.0时，再将其转接至发酵培养基中，培养36h；
45.s2：配置高岭土混悬液：高岭土0.25g，ddh2o 50ml，1％cacl
2 5ml，ph 7.0；
46.s3：向步骤s2中的高岭土混悬液中加入1.5ml s1培养得到的发酵液，充分搅拌2min，常温静置5min，得到处理后的高岭土混悬液，并小心吸取液面下约1cm处的液体，用紫外分光光度计测定550nm处的吸光度(od
550
)，以蒸馏水作空白对照，重复3次，计算絮凝率公
式如下：
[0047][0048]
上述公式中：m为对照组上清液的吸光度值od
550
；n为实验组上清液的吸光度值od
550
。
[0049]
2.2鉴定
[0050]
(1)生理生化鉴定
[0051]
参照《伯杰氏细菌鉴定手册第九版》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株gxun74707进行生理生化鉴定，结果见表1。
[0052]
如表1所示，结果显示，菌株gxun74707为革兰氏阴性细菌，可以产生过氧化氢酶和蛋白酶，不产生氧化酶，具有降解无机磷和有机磷的能力。
[0053]
表1菌株gxun74707生理生化鉴定结果
[0054][0055][0056]
注：“+”表示有，
“‑”
表示无，“g
‑”表示革兰氏阴性。
[0057]
(2)分子生物学鉴定
[0058]
提取菌株gxun74707的基因组dna，利用pcr技术扩增其16s rdna，扩增后的pcr产物经电泳检测后，在1500bp处有一条明显的条带，与16s rdna的大小一致，将此pcr产物送到上海生工测序。测序获得的序列在ezbiocloud网站进行16s-based id比对，发现其与帕万氏寡养单胞菌(stenotrophomonas pavanii)的同源性在99％以上，采用邻位相连法(n-j法)对该序列构建系统进化树(见图1)，结果表明gxun74707与帕万氏寡养单胞菌的亲缘关系最近，由此可判断，gxun74707的分类地位属于stenotrophomonas pavanii。
[0059]
上述菌株gxun74707于2023年5月29日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.27475。
[0060]
实施例2优化絮凝剂的絮凝条件
[0061]
在实施例1的发酵培养条件和絮凝测定方法的基础上，分别进行如下优化：
[0062]
(1)分别将发酵培养的时间值调整为12h、24h、36h、48h、60h和72h；结果培养的时间优选为36h。
[0063]
(2)培养时间为36h，将发酵培养基的ph值分别调整为4、5、6、7、8、9和10；结果ph值优选为7。
[0064]
(3)培养时间为36h，ph值为7，将絮凝剂(即发酵培养的发酵液)的投加量分别调整为0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml和3ml；结果絮凝剂的投加量优选为0.5ml。
[0065]
(4)培养时间为36h，ph值为7，絮凝剂投加量为0.5ml，将静置时间分别调整为1min、2.5min、5min、7.5min、10min和15min。分别测定gxun74707发酵液的絮凝率(絮凝率的测定方法同实施例1)，结果静置时间优选为5min，不同静置时间对絮凝率的影响结果见图2。
[0066]
上述结果显示，当gxun74707在30℃发酵培养36h，发酵培养基ph值为7，发酵液投加量为0.5ml，静置时间为5min时，絮凝效果最好，絮凝率为99.0％。
[0067]
实施例3菌株gxun74707处理含刚果红染料废水脱色率的测定
[0068]
在实施例1发酵培养条件的基础上，测定gxun74707的发酵液对含刚果红染料废水处理的脱色率：
[0069]
(1)将菌株gxun74707在液体lb培养基中培养活化，10h后，测其od
600
值，od
600
＝1.0时，再将其转接至发酵培养基中，培养36h，获得发酵液。
[0070]
(2)配制50mg/l的染料溶液，吸取100ml的染料，分别加入5mlcacl2溶液、2ml上述的帕万氏寡养单胞菌发酵液，500μl naoh，磁力搅拌器250rpm搅拌2min，将加有上述帕万氏寡养单胞菌发酵液的染料移至100ml的量筒中分别沉降5min、10min、15min、20min、25min、30min、60min和90min。分别吸取液面下约1cm处的液体，用紫外分光光度计测定550nm处的吸光度(od
550
)，以蒸馏水作空白对照，重复3次，计算脱色率公式如下：
[0071][0072]
上述公式中：m为对照组上清液的吸光度值od
550
；n为实验组上清液的吸光度值od
550
。
[0073]
结果显示，将菌株gxun74707在30℃发酵培养36h，获得的发酵液处理含刚果红的染料废水，沉降1.5h时脱色效果最好，脱色率为95.6％。菌株gxun74707发酵液对含刚果红染料废水处理前后的效果见图3；不同沉降时间对菌株gxun74707发酵液脱色率的影响见图4。
[0074]
实施例4
[0075]
(1)菌株gxun74707分泌絮凝剂的分布
[0076]
为了能够提高絮凝剂的产量和絮凝活性，本发明研究了菌株gxun74707分泌絮凝剂的分布，结果如图5所示，用菌株gxun74707的发酵液原液(包括上清液和菌体)处理高岭土混悬液的絮凝率为97.6％；菌体破胞处理后，处理高岭土混悬液的絮凝率只有55.3％；而上清液的絮凝率高达94.8％，由此推断，菌株gxun74707分泌絮凝剂主要分布在发酵原液的上清液里。
[0077]
(2)菌株gxun74707分泌絮凝剂的成分测定
[0078]
目前发现的微生物絮凝剂的成分主要是多糖类物质和蛋白质，因此，本发明检测了菌株gxun74707发酵液中是否存在这两种物质。
[0079]
多糖类物质采用molisch反应测定，糖类物质在浓硫酸的作用下脱水形成羟甲基糠醛，羟甲基糠醛与α-萘酚形成紫红色物质。试管中加入1mlα-萘酚乙醇溶液，滴加菌株gxun74707的发酵液，缓慢加入1ml浓硫酸，观察是否产生紫红色物质。
[0080]
蛋白类物质采用双缩脲反应测定，具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与铜离子反应，生成紫色络合物。向试管中加入菌株gxun74707的发酵液，分别加入双缩脲试剂a液(naoh)和双缩脲试剂b液(cuso4)，观察颜色变化。
[0081]
结果显示，molisch反应中产生紫红色物质，表明菌株gxun74707的发酵液中含有多糖类物质；双缩脲反应中，没有生成紫色络合物，仍保持cuso4本身的颜色(蓝色)，表明菌株gxun74707的发酵液中不含蛋白质(见表2)。由此推断，菌株gxun74707分泌絮凝剂的成分主要是多糖类物质。
[0082]
表2菌株gxun74707分泌絮凝剂成分测定结果
[0083][0084]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一株帕万氏寡养单胞菌(stenotrophomonas pavanii)，其特征在于，保藏编号为cgmcc no.27475。2.如权利要求1所述的帕万氏寡养单胞菌或其发酵产物的应用，其特征在于，包括如下任一项所述的应用：(1)在废水絮凝处理中的应用；(2)在制备废水处理中生物絮凝剂的应用；(3)在染料废水脱色处理中的应用；(4)在制备染料废水脱色处理中脱色剂的应用。3.一种如权利要求1所述的帕万氏寡养单胞菌的培养方法，其特征在于，包括将所述帕万氏寡养单胞菌接种于发酵培养基中培养的步骤；其中，所述培养的条件为：30℃，摇床转数为180r/min；所述发酵培养基为：葡萄糖10g/l、酵母膏0.5g/l、尿素0.5g/l、k2hpo
4 5g/l、kh2po
4 2g/l、nacl 0.1g/l和mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。4.一种絮凝废水的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的帕万氏寡养单胞菌经发酵培养后的发酵液接种于废水中进行絮凝处理的步骤；其中，所述发酵培养的条件为：30℃，摇床转数为180r/min；发酵培养基为：葡萄糖10g/l、酵母膏0.5g/l、尿素0.5g/l、k2hpo45g/l、kh2po
4 2g/l、nacl 0.1g/l和mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。5.一种染料废水脱色的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的帕万氏寡养单胞菌经发酵培养后的发酵液接种于染料废水中的步骤；其中，所述发酵培养的条件为：30℃，摇床转数为180r/min；发酵培养基为：葡萄糖10g/l、酵母膏0.5g/l、尿素0.5g/l、k2hpo
4 5g/l、kh2po
4 2g/l、nacl 0.1g/l和mgso4·
7h2o 2g/l，ph 7.0。6.一种生物絮凝剂，其特征在于，包含权利要求1所述的帕万氏寡养单胞菌或其发酵产物。7.一种染料废水脱色剂，其特征在于，包含权利要求1所述的帕万氏寡养单胞菌或其发酵产物。

技术总结
本发明公开了一株帕万氏寡养单胞菌及其在处理染料废水中的应用，属于染料废水处理技术领域。本发明分离得到了一株帕万氏寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)GXUN74707，该菌株保藏编号为CGMCC No.27475。经试验发现，该菌株发酵液处理高岭土溶液，絮凝率最高可达99.0％；用该菌株发酵液处理含有刚果红的染料废水，染料脱色率为95.6％。本发明提供的帕万氏寡养单胞菌在染料废水处理方面具有良好的应用前景，其不仅絮凝效果优良，且能有效地去除染料废水中的染料，绿色环保。绿色环保。绿色环保。


技术研发人员：刘国芳 姜明国 覃思绮 凌舒婷 梁光澜 陈静
受保护的技术使用者：广西民族大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/6