检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒的制作方法

eu-r在检测时的终浓度为0.2-0.4μm、prrsv-eu-p在检测时的终浓度为0.1-0.2μm；
14.prrsv-na-f在检测时的终浓度为0.4-0.6μm、prrsv-na-r在检测时的终浓度为0.4-0.6μm、prrsv-na-p在检测时的终浓度为0.2-0.3μm；
15.prrsv-nl-f在检测时的终浓度为0.5-0.7μm、prrsv-nl-r在检测时的终浓度为0.5-0.7μm、prrsv-nl-p在检测时的终浓度为0.3-0.4μm。
16.作为本发明的一个优选方案，prrsv-eu-f在检测时的终浓度为0.3μm、pr rsv-eu-r在检测时的终浓度为0.3μm、prrsv-eu-p在检测时的终浓度为0.1μm；
17.prrsv-na-f在检测时的终浓度为0.5μm、prrsv-na-r在检测时的终浓度为0.5μm、prrsv-na-p在检测时的终浓度为0.3μm；
18.prrsv-nl-f在检测时的终浓度为0.6μm、prrsv-nl-r在检测时的终浓度为0.6μm、prrsv-nl-p在检测时的终浓度为0.4μm。
19.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
20.本发明实施例提供的检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，能够实现同时快速鉴别检测prrsv欧洲型(i型)、美洲型(ii型)、nadc30like毒株，操作简单，敏感性和特异性好，可以提高临床检测效率和准确性，能够满足猪繁殖与呼吸综合征的预防与分型检测诊断的要求。
附图说明
21.图1为实施例1得到的扩增曲线图。
22.图2为实施例3得到的prrsv-na扩增曲线图。
23.图3为实施例3得到的prrsv-eu扩增曲线图。
24.图4为实施例3得到的prrsv-nl扩增曲线图。
25.图5为实施例3得到的prrsv-na，prrsv-eu，prrsv-nl三重扩增曲线图。
26.图6为实施例4得到的三重荧光定量pcr方法的特异性试验扩增曲线图。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂、原材料和设备仪器均可通过市售获得。
29.实施例1
30.该实施例提供了一种检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组及其应用，具体如下：
31.1、根据genbank数据库获得了200个prrsv毒株全基因组，包括prrsv欧洲型(i型)、美洲型(ii型)，使用序列比对软件mega进行序列比对分析，基于orf5、orf6、orf7保守序列的特异性位点分别设计鉴别美洲型(prrsv-na)、nadc30like毒株(prrsv-nl)、prrsv欧洲型(prrsv-eu)的3条特异性引物和mgb探针，探针5
′
端和3
′
端分别标记不同的荧光基团(fam、
mgb)。具体的，上述引物探针的序列如下表1所示：
32.表1
33.名称序列prrsv-eu-fyacttccagatgcagattgtgt如序列表seqidno.1所示prrsv-eu-rgccgttcactgatgttagtcc如序列表seqidno.2所示prrsv-eu-pfam-tacattctggcccctgccca-mgb如序列表seqidno.3所示prrsv-na-fttgtgcttgctaggccgc如序列表seqidno.4所示prrsv-na-racgacaaatgcgtggttatca如序列表seqidno.5所示prrsv-na-pfam-tctggcccctgccca-mgb如序列表seqidno.6所示prrsv-nl-fggacgacaaatgcgtggtt如序列表seqidno.7所示prrsv-nl-rccaccacgttgaaagtgcc如序列表seqidno.8所示prrsv-nl-pfam-cttgccgttatcggatga-mgb如序列表seqidno.9所示
34.其中，序列中的碱基y指代c或t。
35.2、重组质粒标准品的构建
36.根据上述3种prrsv毒株荧光定量rt-pcr引物(表1所示)获得prrs v-na、prrsv-nl、prrsv-eu的克隆产物，将其分别插入puc57克隆载体，得到3条标准质粒，标准质粒合成均由安徽通用生物完成，测序验证后经微量分光光度计测定浓度保存至-20℃，并计算拷贝数均为1.44
×
106拷贝/μl。
37.3、核酸扩增与提取试剂盒
38.用于建立实时定量pcr方法的扩增试剂盒购于天罗诊断科技江苏有限公司：(qpr-304ud)probe 1-step rt-qpcr 5g kit；核酸提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司：magabio plus病毒dna/rna纯化试剂盒。具体的扩增和提取步骤按照上述试剂盒的操作说明进行实施即可。
39.4、荧光定量pcr的特异性试验
40.猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)美洲型核酸质控品、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)欧洲型核酸质控品、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)na dc30like毒株核酸质控品均购自普道(北京)标准技术有限公司，疫苗prrsv r98株、vr2332株、jxar-1株均购自南农高科生物科技有限公司，猪瘟活疫苗(文易康)购自天津瑞普生物科技有限公司，伪狂犬病活疫苗(prv)购自武汉科前生物科技有限公司，圆环病毒2型疫苗(pcv2)、流行性腹泻-传染性胃肠炎活疫苗(复捷)均购自齐鲁动物保健品有限公司，均采用博日核酸提取纯化试剂盒(bsc11s1e)提取病毒总rna/dna，采用已建立的单重prrsv-na、prrsv-nl、prrsv-eu检测方法检测3对引物探针的特异性。检测的反应体系如下表2所示：
41.表2
[0042][0043]
扩增条件：52℃5min，95℃1min，然后是循环程序为95℃10s，60℃30s，共45个循环，fam通道采集荧光。具体的扩增曲线如图1所示。
[0044]
上述荧光定量pcr方法的特异性试验的结果如下表3所示：
[0045]
表3
[0046][0047]
实施例2
[0048]
该实施例的目的是通过正交优化和正交迭代优化的方式筛选最佳引物探针浓度，具体包括以下步骤：
[0049]
根据taq酶/tth酶同时具有聚合酶活性和外切酶活性的基本性质，采用正交优化的方法筛选引物探针浓度，提高反应体系的灵敏度。
[0050]
prrsv美洲型(prrsv-na)、nadc30like毒株(prrsv-nl)、prrsv欧洲型(prrsv-eu)探针5
′
端和3
′
端分别标记不同的荧光基团(fam、hex、cy5)用于三重反应试剂盒。引物探针的序列如下表4所示：
[0051]
表4
[0052]
prrsv-na-fttgtgcttgctaggccgcprrsv-na-racgacaaatgcgtggttatca
prrsv-na-pfam-tctggcccctgccca-mgbprrsv-eu-fyacttccagatgcagattgtgtprrsv-eu-rgccgttcactgatgttagtccprrsv-eu-phex-tacattctggcccctgccca-mgbprrsv-nl-fggacgacaaatgcgtggttprrsv-nl-rccaccacgttgaaagtgccprrsv-nl-pcy5-cttgccgttatcggatga-mgb
[0053]
引物探针优化操作步骤：引物的浓度范围0.2-0.8μm；探针浓度的浓度范围0.1-0.4μm；初始引物探针浓度均为100μm，需优化项目引物探针浓度按以下步骤进行稀释：
[0054]
稀释到10μm的探针共需要74μl(7.4μl的100μm探针+66.6μl的水)；稀释到10μm的上下游引物mix共需要145μl(14.5μl的100μm上游引物+14.5μl的100μm下游引物+116μl的水)；具体稀释情况如表5-7所示。
[0055]
表5
[0056]
加水0.1μm探针0.2μm探针0.3μm探针0.4μm探针0.2μm引物17μl16μl15μl14μl0.3μm引物16μl15μl14μl13μl0.4μm引物15μl14μl13μl12μl0.5μm引物14μl13μl12μl11μl0.6μm引物13μl12μl11μl10μl0.7μm引物12μl11μl10μl9μl0.8μm引物11μl10μl9μl8μl
[0057]
表6
[0058]
加引物mix0.1μm探针0.2μm探针0.3μm探针0.4μm探针0.2μm引物2μl2μl2μl2μl0.3μm引物3μl3μl3μl3μl0.4μm引物4μl4μl4μl4μl0.5μm引物5μl5μl5μl5μl0.6μm引物6μl6μl6μl6μl0.7μm引物7μl7μl7μl7μl0.8μm引物8μl8μl8μl8μl
[0059]
表7
[0060]
[0061][0062]
扩增步骤如下：
[0063]
1、按照上表5-7制备不同浓度的引物探针mix组合；
[0064]
2、制备qpr304ud+水+模板的mix；
[0065]
模板：核酸模板采用质控品提取好的核酸；
[0066]
配液表如下表8所示：
[0067]
表8
[0068][0069]
3、qpr303u+水+模板mix，分到4列8连管中，每个孔分40μl(2.5个孔的量)；
[0070]
4、分别向对应的孔中加入对应的引物探针mix 10μl(2.5个孔的量)；
[0071]
5、4个8连管混匀后离心，每个孔分为2个复孔，每个复孔分20μl；
[0072]
反应程序如表9所示(仪器采用朗基q2000b)：
[0073]
表9
[0074][0075]
其中，prrsv-na单重引物探针(prrsv-na-f、prrsv-na-r、prrsv-na-p)优化结果如表10所示：
[0076]
表10
[0077][0078]
根据表10的优化测试结果，可以知道，引物prrsv-na-f和prrsv-na-r的最佳终浓度为0.5μm，探针prrsv-na-p的最佳终浓度为0.3μm。
[0079]
prrsv-na，prrsv-eu双重引物探针(prrsv-na-f、prrsv-na-r、pr rsv-na-p、prrsv-eu-f、prrsv-eu-r、prrsv-eu-p)优化过程如下：
[0080]
根据上一步优化的到的prrsv-na引物探针浓度，固定prrsv-na引物探针浓度，替换反应体系中补充的水，测试prrsv-eu引物探针浓度，具体如表11所示；另外，配液表如表12所示。
[0081]
表11
[0082][0083]
表12
[0084][0085]
上述prrsv-na，prrsv-eu双重引物探针优化结果如表13所示：
[0086]
表13
[0087]
[0088][0089]
根据表13的优化测试结果，可以知道，引物prrsv-eu-f和prrsv-eu-r的最佳终浓度为0.3μm，探针prrsv-eu-p的最佳终浓度为0.1μm。
[0090]
prrsv-na，prrsv-eu，prrsv-nl三重引物探针(prrsv-na-f、prr sv-na-r、prrsv-na-p、prrsv-eu-f、prrsv-eu-r、prrsv-eu-p、prrs v-nl-f、prrsv-nl-r、prrsv-nl-p)优化过程如下：
[0091]
上一步优化的到的prrsv-na+prrsv-eu引物探针浓度，固定prrsv-na+prrsv-eu引物探针浓度，替换反应体系中补充的水，测试prrsv-nl引物探针浓度，具体如表14所示；另外，配液表如表15所示。
[0092]
表14
[0093][0094]
表15
[0095][0096]
上述prrsv-na，prrsv-eu，prrsv-nl三重引物探针优化结果如表16所示：
[0097]
表16
[0098]
[0099][0100]
根据表16的优化测试结果，可以知道，引物prrsv-nl-f和prrsv-nl-r的最佳终浓度为0.6μm，探针prrsv-nl-p的最佳终浓度为0.4μm。
[0101]
综合上述优化结果得到优选的三重试剂盒引物探针浓度如表17所示：
[0102]
表17
[0103][0104][0105]
实施例3
[0106]
该实施例采用质粒验证上述引物探针的灵敏度，具体如下：
[0107]
分别以10倍倍比稀释(1.44
×
106拷贝/μl～1.44
×
10拷贝/μl)的重组质粒标准品为模板，利用上表17中的优化后的引物浓度，进行扩增，每个稀释度设2-3个重复。
[0108]
其中，prrsv-na扩增曲线图如图2所示；prrsv-eu扩增曲线图如图3所示；prrsv-nl扩增曲线图如图4所示；prrsv-na，prrsv-eu，prrsv-nl三重扩增曲线图如图5所示，其检测ct值如表18所示。
[0109]
表18
[0110][0111]
实施例4
[0112]
该实施例进行了多重rt-pcr特异性实验，具体如下：
[0113]
以prrsv r98株、vr2332株、jxa1-r株、prrsv-na核酸质控品、pr rsv-nl核酸质控品和prrsv-eu核酸质控品为模板，用上述已优化的多重rt-pcr方法检测样本核酸，以评价多重rt-pcr方法的特异性。
[0114]
其中，三重荧光定量pcr方法的特异性试验的扩增曲线图如图6所示，其检测ct值如表19所示。
[0115]
表19
[0116][0117]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，其特征在于，多种猪繁殖与呼吸综合征病毒至少包括猪繁殖与呼吸综合征病毒的欧洲型毒株、美洲型毒株和nadc30like毒株；所述引物探针组包括：欧洲型毒株的特异性引物prrsv-eu-f、prrsv-eu-r以及探针prrsv-eu-p；prrsv-eu-f、prrsv-eu-r以及prrsv-eu-p的核苷酸序列分别如序列表seq id no.1-3所示；美洲型毒株的特异性引物prrsv-na-f、prrsv-na-r以及探针prrsv-na-p；prrsv-na-f、prrsv-na-r以及prrsv-na-p的核苷酸序列分别如序列表seq id no.4-6所示；nadc30like毒株的特异性引物prrsv-nl-f、prrsv-nl-r以及探针prrsv-nl-p；prrsv-nl-f、prrsv-nl-r以及prrsv-nl-p的核苷酸序列分别如序列表seq id no.7-9所示。2.根据权利要求1所述的检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，其特征在于，探针prrsv-eu-p、prrsv-na-p以及prrsv-nl-p的5
´
端和3
´
端均分别标记有不同的荧光基团。3.根据权利要求2所述的检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括fam、hex、cy5和mgb。4.如权利要求1-3中任一项所述引物探针组在制备用于同时检测并鉴别多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的应用。5.检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为一步法多重rt-pcr检测试剂盒，其包括权利要求1-3中任一项所述引物探针组。6.根据权利要求5所述的检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，prrsv-eu-f在检测时的终浓度为0.2-0.4μm、prrsv-eu-r在检测时的终浓度为0.2-0.4μm、prrsv-eu-p在检测时的终浓度为0.1-0.2μm；prrsv-na-f在检测时的终浓度为0.4-0.6μm、prrsv-na-r在检测时的终浓度为0.4-0.6μm、prrsv-na-p在检测时的终浓度为0.2-0.3μm；prrsv-nl-f在检测时的终浓度为0.5-0.7μm、prrsv-nl-r在检测时的终浓度为0.5-0.7μm、prrsv-nl-p在检测时的终浓度为0.3-0.4μm。7.根据权利要求6所述的检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，prrsv-eu-f在检测时的终浓度为0.3μm、prrsv-eu-r在检测时的终浓度为0.3μm、prrsv-eu-p在检测时的终浓度为0.1μm；prrsv-na-f在检测时的终浓度为0.5μm、prrsv-na-r在检测时的终浓度为0.5μm、prrsv-na-p在检测时的终浓度为0.3μm；prrsv-nl-f在检测时的终浓度为0.6μm、prrsv-nl-r在检测时的终浓度为0.6μm、prrsv-nl-p在检测时的终浓度为0.4μm。

技术总结
本发明适用于病毒检测技术领域，提供了一种检测多种猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒，其中，引物探针组包括：欧洲型毒株的特异性引物PRRSV-EU-F、PRRSV-EU-R以及探针PRRSV-EU-P；美洲型毒株的特异性引物PRRSV-NA-F、PRRSV-NA-R以及探针PRRSV-NA-P；NADC30like毒株的特异性引物PRRSV-NL-F、PRRSV-NL-R以及探针PRRSV-NL-P。本发明提供的引物探针组，能够实现同时快速鉴别检测PRRSV欧洲型、美洲型、NADC30like毒株，操作简单，敏感性和特异性好，可以提高临床检测效率和准确性，能够满足猪繁殖与呼吸综合征的预防与分型检测诊断的要求。检测诊断的要求。检测诊断的要求。


技术研发人员：周闯 颜丽强 符舒欣 丰胜 陈园园 郭誉
受保护的技术使用者：江西硕卓科技有限公司
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/8/6