用于保存离体柑橘叶片的培养基及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于作物组织保存技术领域，尤其是涉及柑橘离体叶片活体保存，具体涉及用于保存离体柑橘叶片的培养基及其制备方法和应用。


背景技术：

2.柑橘(citrus reticulata blanco)属芸香科植物，是广泛种植的重要经济作物，有很高的经济价值。世界有很多个国家生产柑橘，年产量超过亿吨，面积超过一亿亩，种植面积及产品均居百果之首。柑橘病虫害发生较多，其中柑橘溃疡病、黄龙病、疮痂病、炭疽病为主要病害。特别是溃疡病作为国内外植物检疫对象，对苗木、幼树危害严重，造成落叶枯枝，树势衰弱。红蜘蛛和蚧壳虫是柑橘主要虫害。
3.离体叶片法是用于溃疡病的敏感品种鉴定、药物毒力测定、配方筛选及菌种活化的重要方法，也用于室内柑橘红蜘蛛的培养及毒力测定。离体叶片的长期保存，对以上室内活性研究工作的顺利开展具有十分重要意义。
4.专利cn201810955632《一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法》中离体叶片的保存方法为将叶片平铺于培养皿中覆盖一张灭菌滤纸，加盖保存。该种保存方法下柑橘叶片容易失绿、霉变，保存时间较短，会影响试验结果调查。本方法采用含有抑菌成分的固体培养基，在为叶片提供营养成分的同时，能够抑制培养环境中霉菌的生长，有效的延长了叶片的保存时间，为室内离体叶片试验创造了更多的可能性，具有广泛的应用前景和实用价值。


技术实现要素：

5.本发明所需要解决的技术问题是，针对现有技术中存在的上述不足，提供一种叶片离体长期保存的方法，所述叶片可以为柑橘叶片，也可以为黄瓜、草莓等其他植物的叶片。
6.本发明提供一种用于保护离体柑橘叶片的培养基，所述培养基包括水、琼脂、营养成分和抑菌成分。
7.其中，所述抑菌成分为噻霉酮、卡松、溴硝醇中的至少一种。
8.其中，所述抑菌成分重量百分数为0.001～0.1％
9.其中，所述培养基中琼脂含量为0.1～10％，优选为0.5～5％。
10.其中，所述营养成分为葡萄糖、马铃薯浸出液、蛋白胨中的至少一种。
11.本发明还提供一种上述的培养基的制备方法，包括将水、琼脂、营养成分和抑菌成分按比例混合，得到培养基的步骤。
12.作为本发明的一种制备方法，其步骤包括：分别称取100克葡萄糖、100克琼脂和5克20％噻霉酮悬浮剂，加入10升水中加热，充分搅拌后趁热纱布过滤。121℃高压灭菌20分钟后取出。其中水：葡萄糖：琼脂：20％噻霉酮悬浮剂的质量比为2000:20:20:1。
13.作为本发明的一种制备方法，其步骤包括：称取马铃薯，洗净去皮切碎。加水煮沸
半个小时，纱布过滤。分别加入葡萄糖、琼脂和20％噻霉酮悬浮剂，充分搅拌后趁热纱布过滤。121℃高压灭菌20分钟后取出。其中马铃薯：水：葡萄糖：琼脂：20％噻霉酮悬浮剂的质量比为400:2000:20:20:1。
14.作为本发明的一种制备方法，其步骤包括：称取蛋白胨100g、牛肉膏30g、氯化钠50g和5克20％噻霉酮悬浮剂于10升的蒸馏水内，加热，并加入100克琼脂，121℃高压灭菌20分钟后取出。其中蛋白胨：水：牛肉膏：氯化钠：琼脂：20％噻霉酮悬浮剂的质量比为20:2000:6:10:20:1。
15.上述的培养基或上述的制备方法在保存离体柑橘叶片中的应用也应在本发明的保护范围之内。
16.本发明还提供一种保存离体柑橘叶片的方法，包括：将也叶片从叶柄出修剪后插入所述的培养基中，培养保存。
17.其中，所述叶片的修剪方法为：选取叶稍部已完全展开但未完全转绿的新鲜叶片，无菌水清洗后备用；将准备好的叶片从叶柄处剪去1/4～1/5。
18.其中，所述培养温度范围为25～28℃；所述培养方式为在培养皿中加盖培养。
19.本发明柑橘离体叶片保存方法的优点和效果在于：所保存的离体叶片能够较长时间保存(2-3周)，接种或接虫后可长期观察，可以见到典型的溃疡病症状或红蜘蛛的世代交替；离体叶片按本方法保存后，整个试验期间无需再向体系中添加水分或其他营养物质，能显著减轻后续工作强度；恒温恒湿条件下可减少环境因素对发病的影响，更客观的反映药物对病虫害的毒力水平；所需空间小，操作性强，对于药物的高通量筛选具有积极意义。
附图说明
20.图1是本发明清水+滤纸片对照组柑橘叶片离体培养14天效果图；
21.图2是本发明实施例1用1#培养基柑橘叶片离体培养14天效果图；
22.图3是本发明实施例2用2#培养基柑橘叶片离体培养14天效果图；
23.图4是本发明实施例3用3#培养基柑橘叶片离体培养14天效果图；
24.图5是本发明用1#培养基离体培养接菌10天是溃疡病发病效果图。
具体实施方式
25.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
26.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1
28.1.培养基的制备：
29.分别称取100克葡萄糖、100克琼脂和5克20％噻霉酮悬浮剂，加入10升水中加热，充分搅拌后趁热纱布过滤。121℃高压灭菌20分钟后取出，得到1#培养基。
30.2.室内离体保存实验
31.选取叶稍部已完全展开但未完全转绿的新鲜柑橘叶片，用无菌水清洗2遍，沥干后剪去叶柄处1/4～1/5，将叶片倾斜插入含有1#培养基的培养皿中，盖上盖子，置于28℃培养箱中培养，14天后观察叶片保存情况。设清水+滤纸片覆盖对照组，对照组叶柄保留并用棉花包裹，保存条件与处理组保持一致。
32.14天后观察结果：图1清水+滤纸片覆盖方法保存的叶片已部分发黄变色，而图2用1#培养基中的叶片鲜绿，保存完好。
33.实施例2
34.1.培养基的制备：
35.称取2000克马铃薯，洗净去皮切碎。加水10000毫升煮沸半个小时，纱布过滤。分别加入100克葡萄糖、100克琼脂和5克20％噻霉酮悬浮剂，充分搅拌后趁热纱布过滤。121℃高压灭菌20分钟后取出，得到2#培养基。
36.2.室内离体保存实验
37.将实施例1中的1#培养基培养替换为2#培养基培养，其他步骤不变。
38.14天后观察结果：图3用2#培养基中的叶片鲜绿，保存完好。
39.实施例3
40.1.培养基的制备：
41.称取蛋白胨100g、牛肉膏30g、氯化钠50g和5克20％噻霉酮悬浮剂于10升的蒸馏水内，加热，并加入100克琼脂，121℃高压灭菌20分钟后取出，得到3#培养基培养。
42.2.室内离体保存实验
43.用消毒的接种针在需要保存的柑橘叶片的叶脉两侧3个不同的位置分别针刺5个点，其余步骤同生物测定实施例1，用3#培养基培养。
44.14天后观察结果：图4用3#培养基中的叶片表面显示有清晰的针刺点，叶片其他部分保持鲜绿，无变色、萎缩等症状。
45.实施例4
46.接柑橘溃疡病后保存，培养。用消毒的接种针在需要保存的柑橘叶片的叶脉两侧3个不同的位置分别针刺5个点，用细毛刷沾取适量摇培好的柑橘溃疡病菌液均匀涂抹在针刺点上面，多余的菌液用吸水纸擦干。其余步骤同生物测定实施例1，用1#培养基培养。
47.10天后观察结果：图5接柑橘溃疡病菌后用1#培养基保存中的叶片中针刺位置呈现菜花状，发病率接近100％，主叶脉稍变黄，其他部位保持鲜绿。
48.通过以上室内离体保存及生物测定实施例实施例1～4可以得到以下结果：1#、2#、3#培养基在给定的条件下均能够很好的保存柑橘离体叶片，14天时叶片均保持完好；针刺不接菌的情况下，针刺位置不会腐烂，也不影响叶片的其他部位；针刺接柑橘溃疡病的情况下，针刺部位发病特征清晰、完整，发病率接近100％，同时叶片保持完好。
49.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种用于保护离体叶片的培养基，其特征在于，所述培养基包括水、琼脂、营养成分和抑菌成分。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抑菌成分为噻霉酮、卡松、溴硝醇中的至少一种。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述抑菌成分在培养基中的质量百分比为0.01～0.3％。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中琼脂含量为0.1～10％，优选为0.5～5％。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述营养成分为葡萄糖、马铃薯浸出液、蛋白胨中的至少一种。6.一种权利要求1-5任一所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括将水、琼脂、营养成分和抑菌成分按比例混合，得到培养基的步骤。7.权利要求1-5任一所述的培养基或权利要求6所述的制备方法在保存离体柑橘叶片中的应用。8.一种保存离体叶片的方法，其特征在于，包括：将也叶片从叶柄出修剪后插入权利要求1-5任一所述的培养基中，培养保存。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述叶片的修剪方法为：选取叶稍部已完全展开但未完全转绿的新鲜叶片，无菌水清洗后备用；将准备好的叶片从叶柄处剪去1/4～1/5。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养温度为25～28℃；所述培养方式为在培养皿中加盖培养。

技术总结
本发明公开了一种用于保存离体柑橘叶片的培养基及其制备方法和应用，所述培养基所述培养基包括水、琼脂、营养成分和抑菌成分；所述抑菌成分为噻霉酮、卡松、溴硝醇中的一种或几种。使用本发明的培养基所保存的离体叶片能够较长时间保存(2-3周)，接种或接虫后可长期观察，可以见到典型的溃疡病症状或红蜘蛛的世代交替；离体叶片按本方法保存后，整个试验期间无需再向体系中添加水分或其他营养物质，能显著减轻后续工作强度；恒温恒湿条件下可减少环境因素对发病的影响，更客观的反映药物对病虫害的毒力水平；所需空间小，操作性强，对于药物的高通量筛选具有积极意义。的高通量筛选具有积极意义。


技术研发人员：徐宗余 陈俊鹏 杨婷婷 黄小威 桑松 苏文谨 陈润丽 干华磊 李东阳 陈峰 刘军
受保护的技术使用者：宁波三江益农化学有限公司
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/8/6