胡蜂毒液多肽Protonectarina-MP及其抗病毒应用

胡蜂毒液多肽protonectarina-mp及其抗病毒应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体的，涉及一种胡蜂毒液多肽protonectarina-mp及其抗病毒应用。


背景技术：

2.2010年至今的二十多年间，世界卫生组织共宣布了28次突发卫生事件，其中有15次是病毒疫情，病毒严重危害人类健康[1,2]。然而，病毒疫苗的发现和开发通常既具有挑战性又耗时[3]，临床上最常用的病毒控制替代方法是用抗病毒药物治疗[4,5]。
[0003]
近几年，有报道发现多种防御素和抗菌肽均有广谱抗病毒活性，被称为抗病毒肽(avps)[6,7]。例如，抗菌肽ll-37既对i型单纯疱疹病毒(hsv-1)、丙型肝炎病毒(hcv)、登革热病毒2型(denv-2)和zikv等包膜病毒有抑制活性，又对腺病毒(adv)等无包膜病毒有体外抑制效应[8]。在avp数据库(http://crdd.osdd.net/servers/avpdb)中收录了2683条靶向60多种医学相关病毒的avps，其中天然avps有200种左右[8,9]。许多天然avps都有高效且广谱的抗病毒活性、安全性好，已显示出作为抗病毒药物的巨大潜能，是新型抗病毒药物研发的重要方向[8,10]。
[0004]
胡蜂是一类分布广泛、种类繁多的昆虫，其毒液有天然药用价值，包括抗炎镇痛、改善血液循环、改善心脏功能和免疫抑制，还能抗菌、抗肿瘤和抗辐射[11-14]。胡蜂毒液中含有大量天然毒液多肽，但是，胡蜂毒液多肽对病毒感染的作用基本未见报道。i型单纯疱疹病毒(hsv-1)的基因组为线性双链dna。人群中hsv-1感染极为普遍，全球超过60％的人感染了hsv-1，hsv-1感染后会引发单纯疱疹病毒性角膜炎、脑炎等疾病[15,16]，目前，没有用于防控的疫苗和特异性的治疗药物。本工作利用胡蜂毒液这一类天然动物资源和抗hsv-1药物筛选模型，挖掘具有抗病毒活性的新分子具有重要意义，将为胡蜂毒液资源的药用提供新途径。
[0005]
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技术实现要素：

[0022]
本发明首先涉及一条具有抗病毒活性的胡蜂毒液多肽protonectarina-mp，其氨基酸序列如seq id no.1所示：
[0023]
seq id no.1：inwkalldaakkvl；
[0024]
优选的，所述的多肽为c末端酰胺化形式的多肽。
[0025]
本发明还涉及所述多肽protonectarina-mp在制备抗病毒药物中的应用。
[0026]
具体的，所述的病毒为疱疹病毒，优选为ⅰ型疱疹病毒hsv-1。
[0027]
所述的抗病毒药物优选为，
[0028]
(1)抑制病毒粒子感染性的药物，和/或
[0029]
(2)对病毒复制周期的进入宿主以及进入宿主的后阶段进行抑制的药物。
[0030]
本发明的有益效果在于：
[0031]
(1)利用胡蜂毒液多肽资源库以及病毒感染细胞平台对胡蜂毒液多肽抗hsv-1活性进行筛选，发现了1条有抗hsv-1活性的多肽protonectarina-mp多肽。
[0032]
(2)protonectarina-mp多肽在不同温度下均能显著抑制hsv-1病毒粒子感染性，且对hsv-1复制周期的进入以及进入后阶段均有抑制作用，提示：胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的抗病毒活性好、抗病毒作用机制多样，是一个潜在的高效广谱抗病毒活性多肽，具有重要应用价值。
附图说明
[0033]
图1：胡蜂毒液多肽protonectarina-mp在vero细胞中浓度依赖地抑制hsv-1复制(图中，*：p《0.05，**：p《0.01，ns：无显著性差异)
[0034]
1a：胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的氨基酸序列；
[0035]
1b：qpcr检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp(mp)对hsv-1rna含量的抑制效应；
[0036]
1c：western blot检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp对hsv-1icp0蛋白表达的抑制效应；
[0037]
1d：噬斑法检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp对hsv-1感染后的胞外上清中的病毒含量的抑制效应。
[0038]
图2：胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的体外抗hsv-1效应无细胞依赖性(图中，*：p《0.05，**：p《0.01，ns：无显著性差异)
[0039]
2a-2c：qpcr检测不同moi的hsv-1感染a549细胞(a)、hcec细胞(b)、sk-n-mc(c)细胞后hsv-1rna的含量；
[0040]
2d-2f：qpcr检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp在a549细胞(d)、hcec细胞(e)、sk-n-mc(f)细胞。
[0041]
图3：胡蜂毒液多肽protonectarina-mp对hsv-1复制周期的多个阶段均有抑制作用(图中，*：p《0.05，**：p《0.01，ns：无显著性差异)
[0042]
3a：protonectarina-mp多肽对hsv-1感染细胞的复制周期不同阶段的作用示意图；
[0043]
3b：protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期吸附阶段的影响；
[0044]
3c：protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期进入阶段的抑制效应；
[0045]
3d：protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期进入后阶段的抑制效应；
[0046]
3e：protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期晚期的抑制效应。
[0047]
图4：胡蜂毒液多肽protonectarina-mp抑制hsv-1游离病毒粒子的感染性(图中，*：p《0.05，**：p《0.01，***：p《0.001)
[0048]
4a：protonectarina-mp多肽对hsv-1游离病毒粒子的作用示意图；
[0049]
4b：protonectarina-mp多肽在不同温度下对hsv-1游离病毒粒子感染性的抑制作用；
[0050]
4c：不同浓度的protonectarina-mp多肽对hsv-1游离病毒粒子感染性的抑制作用。
具体实施方式
[0051]
(一)材料和试剂
[0052]ⅰ型疱疹病毒hsv-1由武汉大学曹志贱教授惠赠，本实验室保存；
[0053]
a549细胞，hcec细胞和sk-n-mc细胞由本实验自行保存。
[0054]
胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的氨基酸序列如seq id no.1所示：
[0055]
seq id no.1：inwkalldaakkvl；
[0056]
胡蜂毒液多肽protonectarina-mp由上海强耀生物科技有限公司合成，为了增强稳定性，采用c末端酰胺化形式，经hplc与质谱法鉴定，纯度与均一度大于95％，为后续功能筛选和确认提供保证。
[0057]
dna凝胶回收试剂盒(omega)，高纯度质粒提取试剂盒(康为世纪公司)，bca蛋白定量试剂盒(thermofisher)。ribomax
tm
large scale rna production systems(p1300)t7体外转录试剂盒、ribo m7g cap analog(p171a)、双荧光检测试剂盒购自promega；cell linekit v(vca-1003)电转试剂盒购自lonza公司。
[0058]
(二)hsv-1的扩增
[0059]
hsv-1的扩增主要是病毒在vero细胞中进行反复感染得到滴度较高的病毒，具体步骤如下：
[0060]
(1)将状态良好的vero细胞传代转移至t25细胞培养瓶中；
[0061]
(2)第一次感染：待细胞密度长至90％左右，用不含血清的培养液洗细胞之后，用无血清的培养基稀释感染复数(moi)为0.1-1的病毒感染细胞，孵育1h后再补加4ml新鲜10％的dmem正常培养基，大约48h后细胞完全裂解，置于-80℃和37℃转换冻融3次，分装至1ml/管，4℃，4000rpm离心10min，去除细胞碎片，转至新的1.5ml的ep管中；
[0062]
(3)第二次感染：将(2)中分装好的病毒加入到另一个细胞密度大概为90％的t25细胞瓶中，后续操作步骤同(2)；
[0063]
(4)第三次感染(扩大感染)：将(3)中分装好的病毒加入到另一个细胞密度大概为90％的t75细胞瓶中，孵育1h后，用无血清的培养基洗三次，将未吸附的hsv-1洗去，使病毒周期同步，加入新鲜的正常培养基进行培养；
[0064]
(5)收病毒：6-12h后，vero细胞就会全部裂解，置-80℃和37℃反复冻融3次，4℃，4000rpm离心10min，去除细胞碎片，用0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储存在-80℃备用。
[0065]
实施例1、胡蜂毒液多肽protonectarina-mp对hsv-1复制的影响
[0066]
首先测试了hsv-1在a549、hcec以及sk-n-mc细胞中的感染能力，结果表明：hsv-1在a549细胞中的感染能力更高(图2a-c)，
[0067]
(1)胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的制备是通过化学合成得到，为了增强稳定性，采用c末端酰胺化多肽，通过反向高效液相色谱及圆二色谱处理得到纯化多肽；
[0068]
(2)采用mtt法分别检测不同浓度的胡蜂毒液多肽protonectarina-mp对不同细胞
的毒性；
[0069]
(3)采用qpcr和western blot技术分别检测在非细胞毒性浓度范围内胡蜂毒液多肽protonectarina-mp在rna水平和蛋白水平上对hsv-1的体外复制效应；
[0070]
(4)在hsv-1感染细胞的不同时间，用胡蜂毒液多肽protonectarina-mp处理，然后在rna水平上检测蝎毒其对病毒复制周期不同阶段的作用。
[0071]
细胞学评价结果显示，
[0072]
(1)protonectarina-mp多肽在rna水平和蛋白水平上均浓度依赖地抑制hsv-1的复制，并能抑制hsv-1感染vero细胞后的胞外上清中的病毒含量(图1b-d)。
[0073]
(2)检测protonectarina-mp多肽在a549(moi＝1)、hcec(moi＝10)以及sk-n-mc细胞(moi＝10)中对hsv-1复制的影响，结果表明：在a549、hcec、sk-n-mc细胞中，10μg/ml protonectarina-mp多肽对hsv-1rna含量的抑制率分别为67％、74％、66％(图2d-f)。
[0074]
综上：protonectarina-mp多肽对hsv-1有较好的体外抗病毒效应，且无细胞依赖性。
[0075]
实施例2、胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的抗病毒作用阶段研究
[0076]
(1)利用qpcr、western blot、免疫荧光技术、噬斑法检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp在4℃、22℃、37℃时对病毒的游离粒子感染性的抑制效应；
[0077]
(2)胡蜂毒液多肽protonectarina-mp预处理细胞后，再用病毒(hsv-1等)感染细胞，qpcr、western blot、免疫荧光技术、噬斑法检测protonectarina-mp多肽对胞内及胞外病毒含量的影响；
[0078]
(3)采取qpcr、western blot、免疫荧光技术、噬斑法检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp对病毒(hsv-1等)复制周期吸附、进入以及进入后阶段的作用；
[0079]
(4)利用qpcr、western blot、免疫荧光技术、噬斑法检测病毒(hsv-1等)感染细胞的一个复制周期中，分别在0-6h、6-12h、12-18h、18-24h时用pbs或胡蜂毒液多肽protonectarina-mp处理后的胞内病毒含量；
[0080]
(5)利用免疫荧光技术检测胡蜂毒液多肽protonectarina-mp多肽是否抑制病毒(hsv-1等)基因组质粒的表达，以分析其对病毒复制周期过程中基因组复制的影响；
[0081]
(6)病毒(hsv-1等)感染细胞过程中，在0-24h、6-24h和18-24h中分别用pbs或胡蜂毒液多肽protonectarina-mp处理，收集细胞以及细胞上清，分别二次感染细胞，24h后检测胞内和胞外病毒含量，以分析其对病毒复制周期装配过程的影响；
[0082]
(7)pbs或胡蜂毒液多肽protonectarina-mp与病毒(hsv-1等)共孵育细胞24h后，qpcr、western blot、免疫荧光技术、噬斑法检测胞内和胞外病毒含量，以分析其对病毒复制周期释放过程的影响。
[0083]
结果表明：
[0084]
(1)在vero细胞中，20μg/ml protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期的吸附阶段无显著性抑制效应，但是对hsv-1复制周期的进入以及进入后阶段的抑制率分别为40％和82％(图3a-d)。
[0085]
(2)在vero细胞中，20μg/ml protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期的晚期的抑制效应为45％(图3e)。
[0086]
这些结果显示protonectarina-mp多肽对hsv-1复制周期各个阶段均有抑制效应。
[0087]
实施例4、多肽protonectarina-mp对hsv-1游离病毒粒子感染性的抑制效应
[0088]
进一步分析了胡蜂毒液多肽protonectarina-mp在不同温度下对hsv-1游离病毒粒子感染性的影响，结果表明：
[0089]
(1)在4℃、22℃、37℃时，20μg/ml protonectarina-mp多肽对hsv-1游离病毒粒子感染性的抑制率均超过98％；
[0090]
(2)在37℃时，1μg/ml、10μg/ml protonectarina-mp多肽对hsv-1游离病毒粒子感染性的抑制率分别为34％、97％(图4)。
[0091]
这些结果显示胡蜂毒液多肽protonectarina-mp是一个高效的杀病毒剂。
[0092]
综上实施例可见，胡蜂毒液多肽protonectarina-mp的抗hsv-1活性好且无细胞依赖性，抗hsv-1作用机制多样：可以直接靶向病毒粒子，也可以在病毒复制周期的多个阶段发挥作用。
[0093]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

技术特征：
1.一条具有抗病毒活性的胡蜂毒液多肽protonectarina-mp，其氨基酸序列如seq id no.1所示：seq id no.1：inwkalldaakkvl；优选的，所述的多肽为c末端酰胺化形式的多肽。2.权利要求1所述的多肽protonectarina-mp在制备抗病毒药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的病毒为疱疹病毒，优选为ⅰ型疱疹病毒hsv-1。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物为，(1)抑制病毒粒子感染性的药物，和/或(2)对病毒复制周期的进入宿主以及进入宿主的后阶段进行抑制的药物。

技术总结
本发明涉及一种胡蜂毒液多肽Protonectarina-MP及其抗病毒应用，所述的胡蜂毒液多肽Protonectarina-MP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的病毒为疱疹病毒，优选为Ⅰ型疱疹病毒HSV-1。1。1。


技术研发人员：孙芳 陈宗运 罗旭东 叶祥东 丁莉 朱雯 覃陈虎
受保护的技术使用者：湖北医药学院
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/6