芍药PlWRKY72基因及其在植物耐高温方面的应用

芍药plwrky72基因及其在植物耐高温方面的应用
技术领域
1.本发明属于芍药栽培技术领域，具体涉及芍药p1wrky72基因及其在植物耐高温方面的应用。


背景技术：

2.植物在生长发育过程中受多种非生物胁迫的影响，例如温度、干旱、盐渍、水淹、强光、紫外线辐射、矿质营养亏缺等，其中，温度对植物生长发育的影响尤为严重。随着气候变化引起全球气温持续升高，高温胁迫愈发成为影响植物生长发育的重要因素(goraya gk，kaur b，asthir b，et al.rapid injuries of high temperature in plants.journal of plant biology，2017，60：298-305)，会直接导致作物产量降低、果实品质和花卉观赏品质降低，造成严重的经济损失(fahad s，bajwa aa，nazir u，et al.crop production under drought and heat stress：plant responses and management options.frontiers in plant science，2017，8∶1147；grover a，mittal d，negi m，et al.generating high temperature tolerant transgenic plants：achievements and challenges[j].plant science，2013，205-206：38-47)。
[0003]
芍药(paeonia lactifora pall.)是我国的传统名花，性喜冷凉干燥，常在我国北方地区栽植。随着芍药在园林中的推广应用以及近些年切花产业的快速发展，我国长江中下游及以南地区大量引种芍药。这些地区夏季高温酷暑时间长、强度大，常导致芍药表现出茎叶灼伤、萎蔫，叶片黄化、边缘焦枯等现象，还会使其地下根系发育不良，严重影响植株观赏效果和来年开花，极大地限制了芍药在这些地区的栽培应用(赵大球，韩晨霞，陶俊.不同芍药品种耐热性鉴定.扬州大学学报(农业与生命科学版)，2015，36(4)：105-109张佳平，李丹青，李康，夏宜平.“芍药南移”的重新思考.中国园林，2016，32(4)：91-95)。
[0004]
wrky转录因子是植物中所特有的一类转录调控因子，结构非常保守，其中约60个氨基酸构成了核心结构域。这个结构域的n端具有一个非常保守的7肽wrkygqk基序，是核心区域；而c末端则包含一个锌指结构域，可以分为两种类型：c2h2(cx
4-5
cx
22-23hx
h)和c2hc(cx7cx
23
hxc)(chen f，hu y，vannozzi a，et al.the wrky transcription factor family in model plants and crops.critical reviews in plant sciences，2017，36：311-335；aha b，anc b，mika b，et al.molecular regulation of pepper innate immunity and stress tolerance：an overview of wrky tfs.microbial pathogenesis，135：103610)。根据wrky结构域的数量和锌指结构的类型，wrky转录因子可分为i类(两个wrky结构域和一个c2h2锌指结构域)；ii类(一个wrky结构域和一个c2h2锌指结构域)，多数wrky属于ii类，ii类又按氨基酸核心序列划分为iia、iib、iic、iid和iie；iii类(一个wrky结构域和一个c2hc型锌指结构域)(jiang y，zeng b，zhao h，et al.genome-wide transcription factor gene prediction and their expressional tissue-specificities in maize.journal of integrative plant biology，2012，54：616-630)。wrky转录因子广泛参与了植物的非生物胁迫响应。辣椒cawrky40可以参与植株对高温胁迫的响应，过量表达cawrky40基因可
增强其对高温耐受性，而该基因的缺失则降低了对高温耐受性(liu z，shi l，yang s，et al.a conserved double-w box in the promoter of cawrky40 mediates autoregulation during response to pathogen attack and heat stress in pepper.molecular plant pathology，22：3-18；chen l，song y，li s，et al.the role of wrky transcription factors in plant abiotic stresses.biochimica et biophysica acta，2012，1819：120-128)。过量表达小麦tawrky2和tawrky19基因可提高拟南芥植株的抗旱性和耐盐性(chen l，zhang l，yu d.wounding-induced wrky8 is involved in basal defense in arabidopsis.molecular plant-microbe interactions，2010，23：558-565)，而过量表达大豆gmwrky21基因可增强拟南芥植株对低温胁迫的耐受性(zhou q，tian a，zou h，et al.soybean wrky-type transcription factor genes，gmwrky13，gmwrky2 1，and gmwrky54，confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic arabidopsis plants.plant biotechnology journal，2008，6：486-503)。拟南芥atwrky75是首个报道与植物营养元素匮乏相关的wrky转录因子，在低磷胁迫下，atwrky75的表达被强烈诱导，而敲除atwrky75基因后会使植株对低磷胁迫更敏感，导致磷酸酶和磷转运蛋白等相关基因的表达下降进而阻碍磷的吸收(devaiah bn，karthikeyan as，raghothama kg.wrky75 transcription factor is a modulator of phosphate acquisition and root development in arabidopsis.plant physiology，2007，143：1789-1801)。在芍药上，仅有发明专利(专利号：zl202210395782.8)报道了plwrky47能够调控植株耐高温能力，尚未见到有关其他wrky转录因子应答芍药高温胁迫方面的报道。


技术实现要素：

[0005]
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种具备耐高温的芍药plwrky72蛋白以及编码所述蛋白的芍药plwrky72基因。
[0006]
本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或重组菌，其含有所述的芍药plwrky72基因。
[0007]
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的芍药plwrky72蛋白、所述的芍药plwrky72基因、所述的表达盒、重组载体或重组菌在植物耐高温方面的应用。
[0008]
本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有耐高温能力的植物的方法，
[0009]
本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定所述植物是否具有耐高温能力的方法。
[0010]
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种芍药plwrky72蛋白，所述芍药plwrky72蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0011]
本发明内容还包括一种芍药plwrky72基因，其编码所述的芍药plwrky72蛋白，所述芍药plwrky72基因的cdna序列如seq id no.1所示。
[0012]
本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞，其含有权利要求2所述的芍药plwrky72基因。
[0013]
本发明内容还包括一种重组表达载体，所述重组表达载体是将芍药plwrky72基因导入中间植物表达载体pcambia1301中得到。
[0014]
其中，构建所述重组表达载体中设计的上游引物如seq id no.7所示和下游引物
如seq id no.8所示。
[0015]
本发明内容还包括所述的芍药plwrky72蛋白、所述的芍药plwrky72基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在植物耐高温方面的应用。
[0016]
本发明内容还包括获得具有耐高温能力的植物的方法，包括以下步骤：
[0017]
1)使得所述植物包含所述的芍药plwrky72基因，
[0018]
2)使得所述植物表达所述的芍药plwrky72蛋白。
[0019]
其中，所述方法包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
[0020]
本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的具有耐高温能力的植物的方法，包括以下步骤：
[0021]
1)鉴定所述植物是否包含所述的芍药plwrky72基因，
[0022]
2)测定所述植物是否表达所述的芍药plwrky72蛋白。
[0023]
其中，所述植物包括但不仅限于为烟草。
[0024]
有益效果：本发明通过将构建的plwrky72基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，降低了高温胁迫下的植物，尤其是烟草的相对电导率和mda含量，减少了活性氧积累水平，提高了净光合速率和保护酶活性，创制了耐高温能力强的烟草新种质。
附图说明
[0025]
图1：芍药plwrky72基因序列pcr扩增结果检测；其中，m：dl2000 marker；1：pcr扩增产物。
[0026]
图2：芍药plwrky72基因序列分析；其中，a：芍药plwrky72与拟南芥wrky家族系统进化树分析；b：不同物种plwrky72进化树分析。
[0027]
图3：plwrky72在烟草叶片中的亚细胞定位观察。
[0028]
图4：转plwrky72基因烟草植株鉴定；其中，a：基pcr检测的转plwrky72基因烟草植株鉴定；b：基于qrt-pcr检测的转plwrky72基因烟草植株鉴定；m：dl2000marker；1：野生型烟草；2-4：转基因烟草株系1-3；wt：野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3；不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0029]
图5：野生型和转plwrky72基因烟草植株在高温胁迫下的表型比较；其中，wt：野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3。
[0030]
图6：野生型和转plwrky72基因烟草植株在高温胁迫下的叶片相对电导率和丙二醛(mda)含量比较；其中，wt：野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3；不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0031]
图7：野生型和转plwrky72基因烟草植株在高温胁迫下的净光合速率(pn)比较；其中，wt：野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3；不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0032]
图8：野生型和转plwrky72基因烟草植株在高温胁迫下的叶绿素荧光参数fv/fm比较；其中，wt：野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3；不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0033]
图9：野生型和转plwrky72基因烟草植株在高温胁迫下的叶片活性氧(ros)积累水平比较；其中，a：过氧化氢(h2o2)积累水平及含量；b：超氧阴离子(o
2-)积累水平及含量；wt：
野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3；不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0034]
图10：野生型和转plwrky72基因烟草植株在高温胁迫下的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)活性比较；其中，wt：野生型烟草；oe-l1、oe-l2、oe-l3：转基因烟草株系1-3；不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
[0035]
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0036]
实施例1芍药plwrky72基因cdna序列的克隆
[0037]
选用芍药
‘
紫凤羽’叶片作为材料，采用minibest plant rna extraction kit (takara)试剂盒提取总rna。采用full length kit(takara)试剂盒进行cdna反转录，反转录体系为：1μl rna(1000μg/ml)、1μl oligo dt 18、1μl dntp mixture(10mm each)、2μl 5
×
primscript buffer、0.25μl rnase inhibitor、0.25μl primescript rtase、4.5μl rnase free ddh2o；反转录程序为：42℃反应60min，70℃延伸15min。在此基础之上，进行pcr扩增，pcr扩增体系为：2μl cdna、12.5μl 2xphanta max master mix、2μl gene specific primer(10μm)(plwrky72-f1：5
′‑
acaggctcctccttaatta-3
′
(seq id no.3)；plwrky72-r1：5
′‑
gtcaagcatacaaacccgt-3
′
(seq id no.4))、8.5μl rnase free ddh2o；反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5min。将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。
[0038]
采用dna凝胶回收试剂盒(南京擎科生物科技有限公司，中国)进行胶回收，将胶回收产物与5
×
ta/blunt-zero cloning mix混匀获得构建好的载体，具体操作参照5minta/blunt-zero cloning kit试剂盒(vazyme，中国)说明书进行。将构建好的载体采用trelief
tm 5α chemically competent cell(南京擎科生物科技有限公司，中国)试剂盒进行大肠杆菌转化，而后采用高纯度质粒dna小量提取试剂盒(南京擎科生物科技有限公司，中国)提取质粒dna送南京擎科生物科技有限公司测序。
[0039]
实施例2芍药plwrky72基因氨基酸序列与拟南芥wrky家族比对
[0040]
从the arabidopsis information resource(tair)(https：//www.arabidopsis.org/)数据库中下载拟南芥wrky家族氨基酸序列，将它们和芍药p1wrky72氨基酸序列均用fasta格式表示，保存为txt文件，再利用mega 7.0软件构建进化树，算法为neighbor
·
joining，自检举1000次，可以观察到它们最同源的氨基酸序列，结果显示它与拟南芥atwrky72聚为一类(图2a)。通过与不同物种的wrky72进行系统进化分析发现，芍药p1wrky72与向日葵hawrky72(helianthus annuus，xp_022039348.1)、番茄s1wrky72(solanum lycopersicum，xp_004233924)、野生烟草nawrky72(nicotiana attenuata，nw_017670255.1)、拟南芥atwrky72(a.thaliana，at5g15130)和欧洲油菜bnwrky72(brassica napus，np_001302793.1)同源性较高(图2b)。对这些基因进行蛋白序列motif分析，发现芍药p1wrky72与其他同源物种的motif种类和数量一致。氨基酸多序列比对分析发现，p1wrky72具有一个典型的wrky结构域和一个c2h2锌指结构域，属于wrky iib家族蛋白。
[0041]
实施例3芍药p1wrky72亚细胞定位的观察
[0042]
设计含sal i酶切位点的基因特异性引物(p1wrky72-f2：5
′‑
cggggatcctctagagtcgacatgaaaggacacaaacttaaaaaagaa-3
′
(seq id no.5)；p1wrky72-r2：5
′‑
caccatggtactagtgtcgacactagtcacgtgatctctattttcacca-3
′
(seq id no.6))，以南京擎科生物科技有限公司返还的基因克隆测序成功的质粒为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系为：12.5μl 2
×
rapid taq master mix、2μl质粒、2μl引物、8.5μl rnase free h2o。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，对扩增产物进行胶回收。进一步将pcambia2300载体使用sal i进行单酶切线性化，酶切体系：0.4μl sal i、2μl cutsmart buffer、1μl pcambia2300、16.6μl rnase free h2o，37℃水浴1h，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，对酶切产物进行胶回收。在此基础之上，采用plus重组酶将两个胶回收产物进行构建载体pcambia2300-plwrky72，并进行农杆菌转化。接下来，挑取yeb固体培养基上的含有重组载体质粒pcambia2300-plwrky72和空载体质粒pcambia2300的阳性单克隆至yeb液体培养基中(50mg/l kana(卡拉霉素)和20mg/lrif(利福平))，28℃，200rpm过夜震荡培养至od
600
＝0.7，离心后收集菌体，使用无抗yeb液体培养基重悬菌体洗脱抗生素，加入等体积重悬液悬浮农杆菌至od
600
＝0.7，并于室温静置1h复壮菌体，由下表皮注射到35-40d的烟草叶片，弱光培养36-48h，利用超高分辨率激光共聚焦显微镜(tcs sp8 sted，徕卡公司，德国)观察叶背表皮细胞中的荧光信号以确定plwrky72蛋白的亚细胞定位情况。绿色荧光蛋白(gfp)激发光为488nm，发射光波长为510nm。从图3可以看出，融合表达plwrky72的绿色荧光蛋白与核表达的红色荧光蛋白在烟草叶片中定位在相同位置，表明p1wrky72定位在细胞核中。
[0043]
实施例4芍药piwrky72基因过量表达载体在烟草中的表达
[0044]
芍药piwrky72基因过量表达载体构建：设计含有酶切位点bsa i和ecor v用于扩增plwrky72序列的上游引物seq id no.7(plwrky72-f3：5
′‑
caggtcgactctagaggatccatgaaaggacacaaacttaaaaaagaa-3
′
)和下游引物为seq id no.8(plwrky72-r3：5
′‑
ttcgagctcagatctggtaccactagtcacgtgatctctattttcacca-3
′
)。
[0045]
pcr扩增体系：12.5μl 2
×
phanta flash master mix(vazyme)、1μl forward primer、1μl reverse primer、2μl质粒模板(南京擎科生物科技有限公司返还的基因克隆测序成功质粒)、8.5μl ddh2o。反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，52℃退火5s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸1min。反应结束后将pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析，并采用tsp601-dna凝胶回收试剂盒(tsingke)回收含酶切位点的plwrky72基因片段。取双元表达载体pcambia1301质粒用bsa i(biolabs)和ecor v(neb)进行双酶切，反应体系为：2.0μl 10xcutsmart buffer、7μl pcambia1301质粒、0.4μl bsa i(20000u/ml)、0.4μl ecor v(20000u/ml)、10.2μl ddh2o；37℃反应1h。双酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，采用tsp601-dna凝胶回收试剂盒(tsingke)回收纯化质粒pcambia1301大片段。用plus one step pcr cloning kit(novoprotein)试剂盒采用同源重组的方法连接两个回收的产物，反应体系为：2.0μl 5
×
反应缓冲液、0.5μlplus重组酶、6μl pcambia1301大片段、1.5μl plwrky72基因片段；在50℃金属浴连接15min后置于冰上冷却，取5μl连接产物转化trelief
tm
5α感受态细胞(tsingke)，而后在lb平板上(含有kan 50mg/l)37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pcambia1301-plwrky72，再进行双酶切
no.9)；下游引物ntactin-r：5
′‑
acctgcccatctggtaac-3
′
(seq id no.10))，同时设计plwrky72基因的特异性引物(上游引物plwrky72-f4：5
′‑
tgtgaagaaagcaagggtt-3
′
(seq id no.11)；下游引物p1wrky72-r4：5
′‑
cttactgggcatgatggt-3
′
(seq id no.12))进行qrt-pcr检测。反应体系：2μl cdna、12.5μl sybr qpcr supermix plus、1μl forward primer、1μl reverse primer、8.5μl ddh2o。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性5s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸10min。反应结束后采用2-δδct
方法进行基因相对表达水平的分析。qrt-pcr鉴定结果表明，plwrky72在转基因烟草中具有显著较高的表达水平(图4b)。
[0050]
实施例6转芍药plwrky72基因的烟草植株耐高温能力鉴定
[0051]
将移栽2个月后的转芍药plwrky72基因的烟草植株置于42℃、24h光照条件下进行高温胁迫72h。与野生型烟草相比，过量表达plwrky72基因烟草植株在42℃高温胁迫下能够保持良好的生长状态，而野生型烟草叶片则出现脱水、萎蔫下垂的现象，表明转plwrky72基因烟草具有较强的耐高温能力(图5)。
[0052]
实施例7高温胁迫下烟草植株的相对电导率和丙二醛(mda)含量测定
[0053]
使用直径1cm打孔器获得大小一致的叶片圆片，分别称取0.1g转芍药plwrky72基因的烟草植株和野生型烟草植株
‘
k326’的叶片圆片加入含有适量去离子水的注射器中，并抽真空直至叶片下沉。随后将叶片倒入玻璃试管中，用离子水定容至20ml。室温静置4h，摇匀后用电导率仪(dds-307a，上海雷磁仪器有限公司)测定溶液电导率c1。接下来将试管封口，沸水浴30min，冷却至室温后，再次测定溶液电导率c2。每个处理按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率(％)＝c1/c2
×
100％。采用mda含量试剂盒测定叶片丙二醛(mda)含量，具体操作步骤为：称取0.1g(w)叶片粉末，加入1ml试剂盒中提取液，冰浴匀浆；并在8000rpm 4℃条件下离心10min，收集上清液，置冰上备用；将0.6ml试剂一与0.2ml样本混匀，95℃水浴30min，置于冰上冷却，10000rpm，25℃离心10min；取1ml上清液于1ml玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，分别记为a532和a600，δa＝a532-a600。每个处理按下列公式计算叶片mda含量：mda含量(nmol/g鲜重)＝25.8
×
δa
÷
w。从图6可以看出，过量表达plwrky72基因烟草植株的相对电导率和mda含量均显著低于野生型烟草，表明野生型烟草植株细胞膜系统受到了严重损害。
[0054]
实施例8高温胁迫下烟草植株的净光合速率(pn)测定
[0055]
采用便携式光合仪(li-6400，美国li-cor公司)进行光合参数测定，系统自动记录净光合速率(pn)。从图7可以看出，与野生型烟草相比，转芍药plwrky72基因烟草植株的pn显著较高，表明转plwrky72基因烟草具有较高的光合能力。
[0056]
实施例9高温胁迫下烟草植株的叶绿素荧光参数测定
[0057]
采用叶绿素荧光仪(pam-2500，德国walz公司)测定植株叶绿素荧光参数。首先分别将转芍药plwrky72基因烟草和野生型烟草植株
‘
k326’黑暗处理2h，而后用叶夹夹住标记过的相同叶位的叶片，进行叶绿素荧光参数测定。利用仪器自带数据处理软件pam win，计算获得植株光化学效率(fv/fm)。从图8可以看出，与野生型烟草相比，转芍药plwrky72基因烟草具有显著较高的fv/fm。
[0058]
实施例10高温胁迫下烟草植株的活性氧(ros)积累水平观测
[0059]
采用二氨基联苯胺(dab)染色法观察过氧化氢(h2o2)的积累水平。分别将转芍药
plwrky72基因烟草和野生型烟草
‘
k326’叶片完全浸泡在0.1mg/ml、ph为5.0的dab染色液中，于黑暗中充分浸泡叶片24h，取出叶片放入95％(v/v)无水乙醇并于沸水浴作脱色处理，取出叶片，用超纯水清洗3-5次后，擦干叶片进行拍照。进一步采用h2o2含量检测试剂盒测定h2o2含量，具体操作步骤为：称取约0.1g(w)叶片粉末，加入1 ml丙酮进行冰浴匀浆，8000rpm，4℃离心10min，取全部上清液，以丙酮为对照，分别加入工作液，依次测定空白管、标准管和测定管的在415nm处的吸光度。每个处理按下列公式计算h2o2含量：h2o2含量(μmol/g质量)＝δa测定
÷
δa标准
÷
w。从图9a可以看出，与野生型烟草相比，过量表达plwrky72基因烟草植株的叶片颜色较浅，表明积累的h2o2较少，这与测定的h2o2含量结果相一致。
[0060]
采用荧光探针法观察超氧阴离子(o2·-)积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ros原位染色试剂盒(上海哈灵公司)说明书并稍作修改，具体步骤如下：
①
滴100μl清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片(转芍药plwrky72基因烟草和野生型烟草
‘
k326’)，避开主叶脉；
②
用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；
③
叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10μl荧光染色剂二氢溴化乙啶(dhe)，37℃孵育20min；
④
在荧光显微镜(axio imager d2，zeiss，德国)下观察并且拍照，激发波长为540nm，发射波长为590nm。进一步采用o2·-含量检测试剂盒测定叶片o2·-含量，具体步骤为：称取约0.1g(w)植物叶片粉末，加入1ml提取液，充分研磨；12000rpm 4℃离心20min，取上清，置冰上待测；随后依次加入工作液，混匀，8000rpm 25℃离心5min，吸取上层水相1ml，测定530nm处的吸光度a530。δa标准＝a标准管-a空白管，δa样本＝a测定管-a空白管。绘制标准曲线y＝kx+b，其中y表示δa标准，x表示标准溶液浓度。每个处理按下列公式计算o2·-含量：o2·-含量(μmol/g质量)＝2x
÷
w。从图9b可以看出，与野生型烟草相比，过量表达plwrky72基因烟草植株的叶片红色荧光信号较弱，表明积累的o2·-较少，这一结果也得到了o2·-含量的验证。
[0061]
实施例11高温胁迫下烟草植株的抗氧化酶活性测定
[0062]
超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)活性测定均采用试剂盒进行，具体操作步骤如下：
①
sod：称取约0.1g(w)植物(转芍药plwrky72基因烟草和野生型烟草)叶片粉末，加入1ml提取液，冰浴匀浆，8000rpm，4℃离心10min，取上清；设置对照管与测定管，依次加入测定液，充分混匀，室温静置30min后，加入1ml比色皿，于560nm处测定各管的吸光值a。抑制百分率＝(a对照管-a测定管)
÷
a对照管
×
100％。每个处理按下列公式计算sod活性：sod活性(u/g鲜重)＝11.4
×
抑制百分率
÷
(1-抑制百分率)
÷
w。
②
pod：称取约0.1g(w)植物(转芍药plwrky72基因烟草和野生型烟草
‘
k326’)叶片粉末，加入1ml提取液，冰浴匀浆，8000rpm，4℃离心10min，取上清；在1ml的玻璃比色皿中加入50μl样本和950μl工作液，混匀，记录470nm下1min时的吸光值a1和2min后的吸光值a2。计算δa＝a2-a1。每个处理按下列公式计算pod活性：pod活性(u/g鲜重)＝2000
×
δa
÷
w。
③
cat：称取约0.1g(w)植物(转芍药plwrky72基因烟草和野生型烟草
‘
k326’)叶片粉末，加入1ml提取液，冰浴匀浆，8000rpm，4℃离心10min，取上清；将工作液置于25℃水浴10min，在玻璃比色皿中加入35μl样本和1ml预热的工作液，立即混匀，记录240nm处初始吸光值a1和1min后的吸光值a2。计算δa＝a1-a2。每个处理按下列公式计算cat活性：cat活性(nmol/min/g鲜重)＝678
×
δa
÷
w。从图10可以看出，与野生型烟草相比，过量表达plwrky72基因烟草植株的抗氧化酶活
性显著较高，sod、pod和cat活性较野生型烟草分别增加了53.31％、118.48％和139.71％。

技术特征：
1.一种芍药plwrky72蛋白，其特征在于，所述芍药plwrky72蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.一种芍药plwrky72基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的芍药p1wrky72蛋白，所述芍药plwrky72基因的cdna序列如seq id no.1所示。3.表达盒、重组载体或重组菌，其特征在于，其含有权利要求2所述的芍药plwrky72基因。4.一种过表达载体，其特征在于，所述过表达载体是将芍药plwrky72基因导入中间植物表达载体pcambia1301中得到。5.根据权利要求4所述的过表达载体，其特征在于，构建所述过表达载体中设计的上游引物如seq id no.7所示和下游引物如seq id no.8所示。6.权利要求1所述的芍药plwrky72蛋白、权利要求2所述的芍药plwrky72基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组菌在植物耐高温方面的应用。7.获得具有耐高温能力的植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)使得所述植物包含权利要求2所述的芍药plwrky72基因，2)使得所述植物表达权利要求1所述的芍药plwrky72蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。9.鉴定植物是否具有耐高温能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)鉴定所述植物是否包含权利要求2所述的芍药plwrky72基因，2)测定所述植物是否表达权利要求1所述的芍药plwrky72蛋白。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为烟草。

技术总结
本发明公开了一种芍药P1WRKY72蛋白。本发明还公开了一种芍药PlWRKY72基因、表达盒、重组载体或重组菌及其在植物耐高温方面的应用。本发明还公开了获得或鉴定具有耐高温能力的植物的方法。本发明通过将构建的PlWRKY72基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，降低了高温胁迫下的植物，尤其是烟草的相对电导率和MDA含量，减少了活性氧积累水平，提高了净光合速率和保护酶活性，创制了耐高温能力强的烟草新种质。新种质。新种质。


技术研发人员：赵大球 陶俊 程卓雅 胡子傲 孟家松 汤寓涵
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/6