DSC2作为肥厚性心肌病生物标志物的应用

dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物的应用。


背景技术：

2.压力超负荷导致的心肌肥厚发生在约7％-19％的普通成年人群和超过35％的高血压患者或67％的无症状严重主动脉瓣狭窄患者中，心肌肥厚若长期得不到有效控制，会导致心脏、肾脏、大血管等组织器官受到严重损害。心肌肥厚增加不良心血管后果的风险，包括心律失常、心力衰竭或死亡，表明进行性心肌肥厚可能是压力超负荷(如高血压或主动脉狭窄)患者适应不良过程的高频率生物标志物。现有技术中，虽然对心肌肥厚有深入的研究，但其发病机制尚未完全阐明，常用的心脏超声检查评估患者心肌肥厚的严重程度存在一定的设备限制。
3.因此，寻找心肌肥厚合适的生物标志物，通过血清学检查评估患者心肌肥厚和心功能，从而针对性的给予药物治疗来改善或逆转心肌肥厚具有重要的意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供桥粒胶蛋白2(dsc2)作为肥厚性心肌病生物标志物的应用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物在制备诊断肥厚性心肌病的产品的应用。
7.本发明还提供检测dsc2表达含量的试剂在制备诊断肥厚性心肌病的产品中的应用。
8.作为优选，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸条。
9.作为优选，通过所述产品检测受试者的血清样品中dsc2表达含量进行肥厚性心肌病的早期诊断或确定肥厚性心肌病的严重程度。
10.作为优选，所述受试者为由高血压或主动脉瓣狭窄引起的压力负荷性心肌病患者。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
12.本发明通过检测临床高血压和主动脉瓣狭窄病人血清中的dsc2表达，依据其表达变化情况评估患者心肌肥厚程度及预后，dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物特异性和灵敏度高，检测迅速，只需抽取病人的微量外周静脉血即可检测，对实验条件和检测方式要求也不高，具有重要的临床价值。
附图说明
13.图1为实施例中主动脉瓣狭窄患者和对照患者血清中dsc2水平；ctrl代表对照患者；as代表主动脉瓣狭窄患者。
14.图2为实施例中经导管主动脉瓣置入术和外科主动脉瓣置换术明显缓解主动脉瓣跨瓣压的患者术前术后血清的dsc2含量；before代表术前；after代表术后；tavr代表经导管主动脉瓣置入术；savr代表外科主动脉瓣置换术。
15.图3为实施例中高血压患者和对照患者血清中dsc2水平；ctrl代表对照患者；hy代表高血压患者；左图为高血压患者和对照患者血清中dsc2水平；右图受试者操作曲线(roc)，其中界值为6.867。
16.图4为实施例中高血压患者dsc2水平与超声心动图心肌肥厚相关指标的关系；ivs代表室间隔厚度(mm)；lvpw代表左室后壁厚度(mm)。
17.图5为实施例中原发性和继发性肥厚性心肌病患者心肌组织中dsc2表达升高；ctrl代表对照患者；primary hcm代表原发性肥厚性心肌病患者；secondary hcm代表继发性肥厚性心肌病患者。
18.图6为实施例中主动脉缩窄(tac)建立心肌肥厚模型后小鼠dsc2水平的结果。
具体实施方式
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
20.以下实施例中收集复旦大学附属中山医院的主动脉瓣狭窄患者和对照患者血清样本，所有纳入研究的志愿者在血清样本采集前均签署知情同意书。在相同条件下收集研究对象的血液标本，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃冰箱保存备用。
21.实施例1
22.抽取高血压和主动脉瓣狭窄等压力超负荷诱导心肌肥厚患者的外周静脉血，离心分离血清，通过elisa方式检测主动脉瓣狭窄患者和健康对照dsc2蛋白在血清中的表达情况，用酶标仪检测吸光度，测定每个病人的dsc2外周血表达，根据正常人的正态分布情况分析心肌肥厚病人dsc2表达升高的程度，步骤如下：
23.通过elisa检测主动脉瓣狭窄患者和健康对照血清外周血dsc2的表达水平(elisa试剂盒：英国biorbyt公司cat#：orb550508)，使用血清分离管获取病人外周血清，并对血清进行如下检测：
24.1、每孔加入100μl标准品或血清样品，37℃90min。
25.2、吸掉每个孔的液体，向每个孔中加入100μl detection reagent a的工作溶液，37℃45h。
26.3、洗板3次，每次3分钟。
27.4、向每个孔中加入100μl detection reagent b的工作溶液，37℃45h。
28.5、洗板5次，每次3分钟。
29.6、向每个孔中加入90μl的substrate solution，37℃15-25min，避光。
30.7、向每个孔加入50μl的stop solution，在450nm下测定的od值，结果如图1所示。
31.实施例2
32.本实施例对主动脉瓣狭窄患者进行经导管主动脉瓣置换术(tavr)或者外科主动
脉瓣置换术(savr)术前术后分别取血清，通过elisa测定dsc2含量，结果如图2所示。
33.实施例3
34.本实施例对高血压患者和健康对照血清样本进行elisa检测dsc2含量，结果如图3所示，其中界值为6.867，auc：0.814，95％ci：0.731-0.951。
35.实施例4
36.本实施例验证高血压患者和健康对照血清中dsc2水平与心超心肌肥厚指标的相关性，结果如图4所示。
37.实施例5
38.本实施例通过western blot检测肥厚性心脏病患者和健康对照的心脏组织的dsc2的表达水平，具体操作如下：
39.取适量心脏组织，加入ripa裂解液后使用组织研磨仪研磨组织，经过bca法测定血清蛋白并配平后，制备蛋白样品。将蛋白样品加入page凝胶中并加适当电压电泳，使用合适大小的pvdf膜，于甲醇中激活后，依次将海绵垫、厚滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵垫置于转膜液中，并在冰浴下200ma恒流转膜1h。结束后，将含有蛋白质的pvdf膜置于10％脱脂牛奶中，摇床上封闭60分钟。随后，使用biobyt公司的dsc2 antibody(货号：orb388035)，按照使用抗体说明书，1：1000稀释抗体，并在4℃摇床过夜。随后，tbst摇床室温漂洗3次，每次10分钟，二抗室温摇床孵育1h(上海康成生物，goat anti-rabbit igg(h&l)[hrp]，货号：kc-rb-035，tbst1：10000稀释)tbst漂洗三次，每次10分钟，加入适量的显影液，放在成像系统中显影，使用gapdh作为内参，sds凝胶电泳照片和dsc2蛋白含量如图5所示，表明原发性和继发性肥厚性心肌病患者心肌组织中dsc2表达升高。
[0040]
实施例6
[0041]
对小鼠进行主动脉缩窄tac术构建压力超负荷动物模型，实验步骤如下：
[0042]
选取雄性8-10周龄小鼠，术前用脱毛膏对前胸部进行脱毛，对小鼠进行麻醉完成后，取仰卧位固定在操作台上，用眼科剪剪开胸骨并用扩胸器撑开以充分暴露手术视野，显微镊小心钝性分离表明白色的胸腺组织，暴露在胸腺下方的主动脉及其分支，用弯钩将6号丝线小心穿过主动脉弓后然后将27g针头置于主动脉弓上，结扎线于针头上后小心抽出针头。检查没有出血点后，挤出胸部空气避免气胸，关胸，缝合皮肤，将小鼠置于发热灯下保暖至苏醒。
[0043]
随后在不同时间点取心脏组织进行western blot检测dsc2蛋白表达，sds凝胶电泳照片和dsc2蛋白含量如图6所示。
[0044]
上述实施例通过临床实验和动物实验验证dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物，结果如下：
[0045]
(1)在收集的主动脉瓣狭窄患者和对照患者血清样本中，通过elisa法发现主动脉瓣狭窄患者的dsc2蛋白表达升高，并与患者心脏超声的左室后壁厚度和室间隔厚度呈显著相关。
[0046]
(2)对经导管主动脉瓣置入术和外科主动脉瓣置换术明显缓解主动脉瓣跨瓣压的患者术前术后血清检测dsc2水平，发现经导管主动脉瓣置入术和外科主动脉瓣置换术后dsc2水平有明显降低。
[0047]
(3)检测高血压患者和对照病人血清的dsc2水平，发现高血压患者的dsc2蛋白表
达升高，并与患者心脏超声的左室后壁厚度和室间隔厚度呈显著相关。
[0048]
(4)通过对原发性肥厚性心脏病患者、继发性肥厚性心脏病患者和对照患者的心脏组织进行westernblot分析，发现其中dsc2蛋白表达升高。
[0049]
(5)对小鼠进行主动脉缩窄手术构建压力超负荷模型，取术后不同时间点的小鼠心脏组织进行westernblot分析，结果表明随着时间延长，dsc2表达水平在1周和2周显著升高，并在2周时达到最高，在4周时略有下降。
[0050]
(6)通过aav-dsc2对小鼠尾静脉注射诱导敲低心肌dsc2表达后进行主动脉缩窄手术构建压力超负荷模型，心超结果表明，敲低心肌dsc2表达后进行主动脉缩窄手术组的心功能明显差于对照组进行主动脉缩窄手术组，心重体重比、心中胫骨长比值也有类似的结果，与心肌肥厚相关生物标志物anp、bnp、p-erk/erk变化一致，说明来源于心肌细胞dsc2参与临床压力超负荷病人心肌肥厚的病理生理过程，并对病人的预后起到一定的提示作用。
[0051]
综上所述，本发明将dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物特异性和灵敏度高，检测迅速，通过检测临床高血压和主动脉瓣狭窄病人血清中的dsc2表达，依据其表达变化情况评估患者心肌肥厚程度及预后，具有重要的临床价值。
[0052]
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.dsc2作为肥厚性心肌病生物标志物在制备诊断肥厚性心肌病的产品的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过检测受试者的血清样品中dsc2表达含量进行肥厚性心肌病的早期诊断或确定肥厚性心肌病的严重程度。3.检测dsc2表达含量的试剂在制备诊断肥厚性心肌病的产品中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸条。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，包含dsc2蛋白的抗体，还包含预包被板、标准品、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶、洗脱液和显色剂。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过所述产品检测受试者的血清样品中dsc2表达含量进行肥厚性心肌病的早期诊断或确定肥厚性心肌病的严重程度。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述受试者为由高血压或主动脉瓣狭窄引起的压力负荷性心肌病患者。

技术总结
本发明公开了DSC2作为肥厚性心肌病生物标志物的应用，属于生物医学领域。特别地，DSC2作为肥厚性心肌病生物标志物在制备诊断肥厚性心肌病的产品的应用，产品包括试剂盒、芯片或试纸条，通过检测受试者的血清样品中DSC2表达含量进行肥厚性心肌病的早期诊断或确定肥厚性心肌病的严重程度。本发明依据高血压或主动脉瓣狭窄病人血清中的DSC2表达变化情况评估患者心肌肥厚程度及预后，DSC2作为肥厚性心肌病生物标志物特异性和灵敏度高，检测迅速，只需抽取病人的微量外周静脉血即可检测，对实验条件和检测方式要求也不高，具有重要的临床价值。价值。价值。


技术研发人员：龚惠 戴宇翔 葛均波 邹云增 潘乐 李军 金可嘉 李剑萱 邹妍 林金钟
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/8/6