一种固体的使用方法与流程

1.本发明属涉及一种固体的使用方法，属于医用制剂的使用方法领域。


背景技术：

2.皮肤的外在颜色，特别是暗沉和色斑，与黑色素的含量与分布有关；皮肤暗沉和色斑，导致个人外在比实际看上去衰老，影响了个人的外在形象，从而也影响着个人的心理生理健康状态。
3.目前，有多种多样的外用的着力于减少色素沉着和减少细纹等作用的产品，但这些产品或限于原材料本身的性能优劣或配方的差异，存在或多或少的缺陷，如产品的安全性、稳定性不够，产品的功效性不足以达到期望目的，产品原材料难以获得，产品的生产可操作性、可控性差等等；因此，研究功效性、安全性和稳定性等各方面都能够达到期望的消除、减少皮肤色素沉着，减少细纹或阻止细纹形成的外用产品，仍然是有必要的和困难的。而且，同一种产品，采用不同使用方法施用于有需求者，其使用效果难以预料，故在研究产品的同时，还需要研究产品的使用方法，适宜的使用方法，可能带来功效的超常发挥。


技术实现要素：

4.基于目前存在的问题和需求，本发明提供了一种可以消除、减轻和/或改善皮肤的衰老老化现象，如干燥，粗糙，色素沉着，细纹等现象的试剂盒，所述试剂盒包括固体和液体。
5.由此，本发明提供一种试剂盒，其包括：固体和液体；所述固体由羟基酪醇和烟酰胺的共晶和海藻糖组成，所述共晶中羟基酪醇和烟酰胺的摩尔比为1:1；所述液体包括：寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，精氨酸/赖氨酸多肽，乙酰基八肽-3，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷，燕麦β-葡聚糖，对羟基苯乙酮，1,3-丁二醇，1,2-己二醇和水；所述固体和液体在使用前是物理分离状态的。
6.本发明提供的试剂盒，在使用前，采用固体和液体物理分离状态的型式，有利于保持各物料的稳定。
7.羟基酪醇，化学名称为3,4-二羟基苯乙醇，具有较强的抗氧化作用，但因其结构中存在多个羟基等，其本身熔点低，吸湿性强，不利于制剂制备。烟酰胺能够抑制黑色素到角化细胞的转运，也能减少黑色素向表层细胞的转移，促进含黑色素的角质细胞脱落，常用于化妆品中，但其在较高含量时毒性较大，刺激性较大，在较低含量时美白作用又难以满足要求；并且，烟酰胺原料中经常会含有一定量的烟酸，且烟酰胺在光照、高温、酸性等条件下容易转变为盐酸，而烟酸用于皮肤时将导致红肿刺痛等不期望的作用。羟基酪醇和烟酰胺虽是常用的化工原料，但其本身性能方面存在稳定性差、刺激性大等缺点，混合羟基酪醇、烟酰胺和其他辅料制成液体或半固体等外用制剂，产品易不稳定，发生变色、分层和/或杂质增加；在此情况下，为了解决产品的稳定性差、刺激性大、难以有效吸收等问题，现有方法中常采用的方法是加入大量的助稳定性成分及降低刺激性的辅助成分，然而这些大量的辅助
成分的使用，容易导致配方复杂化，安全性降低，主功能性成分含量相对降低而产品功效减弱等缺点。
8.发明人研究后发现，采用的羟基酪醇和烟酰胺的共晶形式，能够高效地解决了原料的稳定性差的问题，并且可以提高其溶解性和生物利用度，更高效地发挥其功能作用；同时加入海藻糖，能够使共晶更稳定，并且使共晶使用后羟基酪醇、烟酰胺的吸收更可控，低刺激性有效降。
9.在固体中加入适宜量的海藻糖，可以进一步提升共晶的稳定性，并且降低羟基酪醇和烟酰胺的刺激性。适宜量的海藻糖的加入，不仅使共晶稳定性提升，也使试剂盒具有保湿舒缓作用，减少表皮细胞因外界刺激的损伤，刺激性显著降低，耐受性显著提升。海藻糖的含量高低对试剂盒的稳定性、刺激性和使用顺应性有重要影响，其含量过高，虽然有助于提升稳定性、降低刺激性，但会极大地降低使用顺应性，在使用时有较强的皮肤黏腻感和异物感，含量过低，则不能很好地起到提升稳定性和降低刺激性的作用。为了增强试剂盒的稳定性、功效作用和降低刺激性和提高使用顺应性，所述共晶与海藻糖的质量比例需控制在适宜的范围内。根据本发明的实施例，所述共晶与海藻糖的质量比可以为1:0.5-1:5。在一些实施方式中，所述共晶与海藻糖的质量比为1:1-1:5，有利于降低刺激性。在一些实施方式中，所述共晶与海藻糖的质量比为1:2-1:4，有利于增强试剂盒的功效作用和降低刺激性和提高使用顺应性。在一些实施方式中，所述共晶与海藻糖的质量比为1:3，有利于增强试剂盒的功效作用和降低刺激性和提高使用顺应性。
10.在使用海藻糖提升稳定性和功效，降低和控制试剂盒的刺激性的同时，为了进一步降低和控制刺激性，可以对共晶中的烟酸的含量进行控制，使用纯度越高的共晶，越有利于试剂盒的功效发挥和降低刺激性以及副作用等。发明人发现所述共晶或固体中，烟酸的含量控制在低于80ppm，更有利于降低刺激性和便利于生产和质量控制；烟酸含量高于80ppm，所述共晶或固体不仅功效、稳定性受到影响，并且试剂盒使用后刺激性、副反应发生率增加，且刺激性、副作用强度也增加。在一些实施方式中，所述共晶或固体中，烟酸的含量低于50ppm，更有利于降低刺激性和提高使用顺应性。
11.根据进一步研究，发明人发现，为了使试剂盒既提供高效的抗衰老作用，又能够保持高稳定性和低刺激性等不期望的作用，可将所述固体与所述液体的质量体积比控制为60mg/ml-200mg/ml，优选为80mg/ml-160mg/ml。在一些实施方式中，所述固体的质量(mg)与所述液体的体积(ml)之比为60mg/ml，80mg/ml，120mg/ml，或160mg/ml，有利于提供高效的抗衰老作用，保持高稳定性和低刺激性。
12.所述液体包括了多种肽和溶剂等，其可以溶解所述固体，使羟基酪醇和烟酰胺更好地被吸收；这些肽和溶剂等成分组合使用，有利于为皮肤提供营养成分，有助于保湿和皮肤吸收补充水分，刺激、促进弹性蛋白的形成，可以使皮肤弹性提升，减少皮肤细纹，并且，这些液体和所述固体组合后，可以发挥协同作用，相对单独的固体的水溶液或者单独使用所述液体，组合后的试剂，具有更低的刺激性和更强的改善色素沉着，改善细纹等改善衰老状态的作用，更有利于抗皮肤衰老。
13.根据本发明的实施例，所述液体中，基于液体的总质量，所述寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5或精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数不超过0.002％，所述乙酰基八肽-3的质量分数不超过0.04％，或者所述二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数不超过0.1％；这些组分
的含量过高，则安全风险和质量控制难度大幅提高，不适于本发明的试剂盒，过低，则难以发挥相应作用。
14.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体中寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，和二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％。
15.基于液体的总质量，所述液体中，所述甘油葡糖苷的质量分数可以为0.5％-5％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数可以为0.5％-5％。
16.基于液体的总质量，所述液体中，所述对羟基苯乙酮的质量分数可以为0.1％-1％，所述1,3-丁二醇的质量分数可以为1％-10％，和所述1,2-己二醇的质量分数可以为0.1％-2％。
17.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体中，所述甘油葡糖苷的质量分数为1％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％，所述1,3-丁二醇的质量分数为5％，所述1,2-己二醇的质量分数为0.6％，和所述对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％。
18.根据本发明的实施例，所述试剂盒的液体任选含有可溶性胶原交联聚合物，透明质酸钠或透明质酸锌，1,2-戊二醇，甘油，甘油磷酸肌醇胆碱盐，苯氧乙醇或乙基己基甘油；所述液体可以含有这些成分中的一种或多种，也可以不含这些成分中的一种或多种。
19.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体可以含有可溶性胶原交联聚合物，质量分数可以为0.01％-0.2％。在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体含有可溶性胶原交联聚合物，质量分数为0.15％。
20.透明质酸钠或透明质酸锌可以使试剂盒具有保湿作用，有利于保湿和改善干燥粗糙，同时可以作为增稠剂。在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体可以含有透明质酸钠或透明质酸锌，质量分数可以为0.01％-0.1％。在一些实施方式中，所述液体含有透明质酸钠，质量分数为0.05％。所述透明质酸钠或透明质酸锌分子量可以为100万道尔顿-150万道尔顿。
21.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体可以含有1,2-戊二醇，质量分数可以为0.01％-0.5％。在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体含有1,2-戊二醇，质量分数为0.1％。
22.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体可以含有甘油，质量分数可以为0.2％-5％。在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体含有甘油，质量分数为2.2％。
23.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体可以含有甘油磷酸肌醇胆碱盐，质量分数可以为0.01％-0.5％。在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体含有质量分数为0.2％的甘油磷酸肌醇胆碱盐。
24.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体可以含有苯氧乙醇或乙基己基甘油，质量分数可以为0.0001％-0.05％。在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体含有质量分数为0.002％的苯氧乙醇或乙基己基甘油。
25.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体中寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，二肽二氨基丁酰苄基
酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％；所述甘油葡糖苷的质量分数为1％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％；所述对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％，所述1,3-丁二醇的质量分数为5％，和所述1,2-己二醇的质量分数为0.6％。
26.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体中寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％；所述甘油葡糖苷的质量分数为1％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％，所述对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％，所述1,3-丁二醇的质量分数为5％，所述1,2-己二醇的质量分数为0.6％；任选含有质量分数为0.15％的可溶性胶原交联聚合物，质量分数为0.05％的透明质酸钠，质量分数为0.1％的1,2-戊二醇，质量分数为2.2％的甘油，和/或质量分数为0.2％的甘油磷酸肌醇胆碱盐。
27.在一些实施方式中，基于液体的总质量，所述液体中寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％；所述甘油葡糖苷的质量分数为1％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％，所述对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％，所述1,3-丁二醇的质量分数为5％，所述1,2-己二醇的质量分数为0.6％；任选含有质量分数为0.15％的可溶性胶原交联聚合物，质量分数为0.05％的透明质酸钠，质量分数为0.1％的1,2-戊二醇，质量分数为2.2％的甘油，质量分数为0.2％的甘油磷酸肌醇胆碱盐，和/或质量分数为0.002％的苯氧乙醇或乙基己基甘油。
28.本发明提供的试剂盒，在使用前所述固体和液体处于物理分离状态，临用时，将所述固体和所述液体混合溶解，然后所得的混合溶液可涂抹于有需要的皮肤表面。所述固体和液体混合后，所得的混合溶液需在不超过48小时内使用完全，或者需将所得的混合溶液存放于0℃-15℃避光环境。
29.本发明的试剂盒，具有较好的消除、减轻和/或改善皮肤的色素沉着、细纹的作用，对促进皮肤的胶原蛋白和弹性蛋白的形成，减少细纹，抗衰老作用有协同作用，同时具有较好的稳定性和较低的刺激性，能够较好地改善皮肤的衰老现象。
30.发明人进一步研究后发现，虽然所述固体和所述液体混合后涂抹于面部皮肤或其他有需要的皮肤表面，可以较好地发挥共晶的消除、减轻和/或改善皮肤的色素沉着、细纹等改善皮肤衰老状态的作用，但长时间天天使用的使用方法，对希望有更快的更省时(如无需天天使用)的而又保证效果或提升效果的使用方法的需求者来说，前述的试剂盒的直接涂抹的使用方法有待改进。为了满足更高的需求，根据进一步研究，发明人开发了一种前述的固体和液体的使用方法。
31.一种前述固体和液体的使用方法，包括：将所述的固体与所述的液体混合，配制成浓度为60mg/ml-200mg/ml的混合液，再将混合液涂抹于有需要的皮肤处并使用仪器导入至皮下，或者将混合液在有需要的皮肤处通过仪器导入至皮下。
32.根据本发明的研究，所述混合液的用量为每平方厘米皮肤使用混合液0.001ml-0.1ml，或者混合液的用量为至少1ml/次。通过一定时间内将一定量的所述浓度的混合液导入至皮下，能够使混合液更高效地被吸收和利用，无需天天使用，极大地降低使用频次，省
时省力，既保证各种成分的功效得到利用发挥，又使需求者能够耐受，且极大地提升效率和使用顺应性。
33.在一些实施方式中，混合液的用量为每平方厘米皮肤使用混合液0.003ml-0.1ml。在一些实施方式中，混合液的用量为每平方厘米皮肤使用混合液0.003ml-0.07ml。在一些实施方式中，混合液的用量为每平方厘米皮肤使用混合液0.01ml-0.07ml。在一些实施方式中，混合液的用量为每平方厘米皮肤使用混合液0.01ml-0.05ml。
34.在一些实施方式中，将所述固体与所述液体混合配制成60mg/ml的混合液，然后取混合液至少4ml/次或至少8ml/次，涂抹于有需要的皮肤表面/部位并使用仪器导入至皮下，或者在有需要的皮肤表面/部位通过仪器导入至皮下。在一些实施方式中，将固体与液体混合配制成80mg/ml的混合液，然后取所混合液至少3ml/次或至少6ml/次，涂抹于有需要的面部并使用仪器导入至皮下，或者在有需要的面部通过仪器导入至皮下。在一些实施方式中，将固体与液体混合配制成120mg/ml的混合液，然后取混合液至少2ml/次或至少4ml/次，涂抹于有需要的面部并使用仪器导入至皮下，或者在有需要的面部通过仪器导入至皮下。在一些实施方式中，将固体与液体混合配制成160mg/ml的混合液，然后取混合液至少1.5ml/次或至少3ml/次，涂抹于有需要的面部并使用仪器导入至皮下，或者在有需要的面部通过仪器导入至皮下。
35.前述使用方法中，将混合液使用仪器导入至皮下时，需控制导入的深度，根据本发明的研究，仪器导入至皮下的深度控制为0-1mm(毫米)，优选0.1mm-0.6mm。在一些实施方式中，仪器导入至皮下的深度控制为0.2mm或0.5mm，有利于混合液被吸收和使用安全性和舒适性。
36.前述使用方法中，混合液至少连续3，5，6，7，9或10次导入施用于有需要的皮肤处，和/或每次间隔至少7，10或15天，有助于既发挥各组分的功效，又提升安全性和舒适性。在一些实施方式中，每隔10天导入一次。在一些实施方式中，每隔15天导入一次。在一些实施方式中，每次导入间隔至少10天。在一些实施方式中，每次导入间隔至少15天。
37.在一些实施方式中，每隔10天导入一次，至少连续导入3次，6次，或9次。在一些实施方式中，每隔10天导入一次，至少连续导入3次，再每隔15天导入一次，至少连续导入4次，或6次。
38.为进一步提升功效和舒适性，所述使用方法中，可以在两次导入的间隔期内的每一天，将所述液体施用于有需要的皮肤处，每天2次，每次至少1ml或1.5ml或2ml。
39.本发明中，可以使用适宜的仪器进行导入，如可以使用微针导入仪，滚针或超声导入仪导入。
40.基于所述固体和所述液体混合后的混合液的稳定性和使用安全性，所述混合液在混合后24小时内被使用，优选在混合后12小时内使用，进一步优选在混合后2小时内使用，更进一步优选在混合后1小时内使用。
41.为了提升安全性，在使用混合液之前，可对有需求的皮肤处进行清洁和/或消毒，如清洁后使用医用酒精或医用碘伏消毒。
42.根据本发明的研究，将所述固体按照所述使用方法使用，既可以减少使用的频次，又可以保证及提升各组分的活性作用，快速提升抗衰老的效果，还提升使用的舒适性和便捷性。
43.另一方面，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法。
44.一种制备前述试剂盒的方法，包括：得到所述固体；和
45.在加热条件和搅拌条件下，混合部分水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇，加入对羟基苯乙酮，任选加入透明质酸钠或透明质酸锌；然后控温，搅拌条件下，加入剩余的水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇，寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，乙酰基八肽-3，精氨酸/赖氨酸多肽，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷和燕麦β-葡聚糖，任选加入1,2-戊二醇，甘油，可溶性胶原交联聚合物，甘油磷酸肌醇胆碱盐，苯氧乙醇和/或乙基己基甘油；混合均匀，得到所述液体；任选地，所得液体和固体分别灌装入容器，得到试剂盒。
46.所述加热条件为温度控制为35℃-95℃。在一些实施方式中，所述加热条件为温度控制为40℃-85℃，或者60℃-85℃；或者40℃-65℃，或者45℃-65℃。在一些实施方式中，所述加热条件为温度控制为85℃，或者65℃，或者45℃或者35℃。
47.所述控温为将混合体系温度控制为15℃-50℃。在一些实施方式中，所述控温为将混合体系温度控制为15℃-45℃，或15℃-35℃，或20℃-40℃，或20℃-45℃，或30℃-50℃。
48.在一些实施方式中，一种制备前述试剂盒的方法，包括：在40℃-85℃条件和搅拌条件下，混合部分水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇，再加入对羟基苯乙酮，任选加入透明质酸钠或透明质酸锌；然后控温15℃-50℃，搅拌条件下，加入剩余的水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇，再加入寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，乙酰基八肽-3，精氨酸/赖氨酸多肽，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷和燕麦β-葡聚糖，任选加入1,2-戊二醇，甘油，可溶性胶原交联聚合物，甘油磷酸肌醇胆碱盐，苯氧乙醇和/或乙基己基甘油；混合均匀，得到所述液体。
49.在一些实施方式中，一种制备前述试剂盒的方法，包括：在60℃-85℃条件和搅拌条件下，混合部分水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇，再加入对羟基苯乙酮，任选加入透明质酸钠或透明质酸锌；然后控温20℃-45℃，搅拌条件下，加入剩余的水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇，再加入寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，乙酰基八肽-3，精氨酸/赖氨酸多肽，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷和燕麦β-葡聚糖，任选加入1,2-戊二醇，甘油，可溶性胶原交联聚合物，甘油磷酸肌醇胆碱盐，苯氧乙醇和/或乙基己基甘油；混合均匀，得到所述液体。
50.所述制备试剂盒的方法，简便、可控，易于操作，可以简便地获得试剂盒，并且使其中的成分不会发生降解、变性等不符合质量要求的现象。
具体实施方式
51.术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
52.本发明中，“由
······
组成”表示还可以含有不可避免的杂质和/或水。
53.本发明中，ppm表示百万分之一，基于质量计算。
54.本发明中，任选表示可以有也可以没有。
55.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一些实施方式”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领
域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
56.本发明中，室温为环境温度，在20℃-30℃，或者22℃-28℃，或者25℃。
57.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
58.以下实施例中，共晶为羟基酪醇和烟酰胺的共晶，可从市场购买获得或采用中国专利cn113004198公开的方法制备，羟基酪醇与烟酰胺的摩尔比为1:1，其中烟酸低于50ppm。
59.人参根提取物提取方法：使用洗净后的鲜人参根1kg，切片，用50％的乙醇(体积比)100kg浸泡8小时-12小时，过滤，所得液体20℃-30℃真空浓缩除去大部分溶剂，再冷冻干燥，收集固体，得到人参根提取物。
60.实施例i-1：试剂盒配方的筛选
61.1)不同的液体配方：
[0062][0063][0064]
液体制备方法：在加热60℃-70℃条件下，搅拌，混合水(约总量的60％)，1,3-丁二醇(约总量的60％)，1,2-己二醇(约总量的60％)，对羟基苯乙酮，加入透明质酸钠(如有)；然后控温40℃-50℃，加入剩余的水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇；再加入寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，精氨酸/赖氨酸多肽，乙酰基八肽-3，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷，燕麦(avena sativa)β-葡聚糖，及其他组分：可溶性胶原交联聚合物，甘油磷酸肌醇胆
碱盐，1,2-戊二醇或甘油；混合均匀，得到所述液体。
[0065]
液体与共晶的混合及使用情况：配方1：共晶与配方1所得物的溶解性较差，手背局部使用时吸收较慢，肤感粘腻；配方2：共晶与配方2所得物的溶解性良好，手背局部使用时吸收较快，但质地较薄、不够滋润；配方3：共晶与配方3所得物的溶解性良好，手背局部使用时轻盈顺滑，滋润；根据与共晶的混合和使用感受(包括而不限于刺痛感、黏腻感、渗透快慢)等，认为液体配方3相对更适用于共晶。
[0066]
2)不同比例的共晶与海藻糖的配方：
[0067][0068]
按照配方4-配方10，分别称取共晶和海藻糖，然后混合，得到固体。将所得固体溶于1ml的基于配方3的液体，得到固液混合物，观察所得混合物的性状，手背局部试用所得混合物；结果：不加海藻糖的配方，刺痛感相对较为明显；海藻糖过多的配方，黏腻感相对较大。综合考虑固体(共晶与海藻糖的混合物)的稳定性，固体和液体溶解后的使用皮肤感受(包括而不限于刺痛感、黏腻感、渗透快慢)等，认为配方8更适宜。
[0069]
3)不同固液比例的配方
[0070][0071]
将根据配方8制备得到的固体和根据配方3制备得到的液体按照配方比混合溶解，得到各配方。配方11溶解较快，配方14和15溶解较慢，较为粘稠；综合考虑溶解情况、粘稠度，使用时皮肤感受(包括而不限于刺痛感、黏腻感、渗透快慢)及功效等，认为配方11-配方15可以接受，且配方11-配方13相对配方14-配方15更适宜。
[0072]
实施例i-2：试剂盒的制备
[0073]
配方：固体：共晶1.8g，海藻糖5.4g；液体：90ml；
[0074]
液体的组成：基于液体的总质量，寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％；对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％，1,3-丁二醇的质量分数为5％，1,2-己二醇的质量分数为0.6％，甘油葡糖苷的质量分数为1％，燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％，透明质酸钠质量分数0.05％，可溶性胶原交联聚合物的质量分数为0.15％，1,2-戊二醇的质量分数为0.1％，甘油的质量分数为2.2％，甘油磷酸肌醇胆碱盐质量分数0.2％，苯氧乙醇质量分数0.01％，乙基己基甘油质量分数0.01％，余量为水。
[0075]
制备过程：
[0076]
1)制备固体：按照配方用量，称取共晶和海藻糖，混合，得到固体；
[0077]
2)制备液体：按照配方用量，在加热60℃-70℃条件下，搅拌混合：水(约总量的60％)，1,3-丁二醇(约总量的60％)，1,2-己二醇(约总量的60％)，透明质酸钠和对羟基苯
乙酮；然后控温40℃-45℃，加入剩余的水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇；加入寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，精氨酸/赖氨酸多肽，乙酰基八肽-3，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷，燕麦(avena sativa)β-葡聚糖，可溶性胶原交联聚合物，甘油磷酸肌醇胆碱盐，苯氧乙醇，乙基己基甘油，1,2-戊二醇和甘油；混合均匀，得到所述液体；
[0078]
3)分别灌装制得的固体和液体，得到试剂盒。所得试剂盒具有较好的使用体验感。
[0079]
实施例i-3：试剂盒的制备
[0080]
配方：固体：共晶1.8g，海藻糖5.4g；液体：90ml；
[0081]
液体的组成：基于液体的总质量，寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％；对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％，1,3-丁二醇的质量分数为5％，1,2-己二醇的质量分数为0.6％，甘油葡糖苷的质量分数为1％，燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％，余量为水。
[0082]
制备过程：
[0083]
1)制备固体：按照配方用量，称取共晶和海藻糖，混合，得到固体；
[0084]
2)制备液体：按照配方用量，在加热60℃-70℃条件下，搅拌混合：水(约总量的60％)，1,3-丁二醇(约总量的60％)，1,2-己二醇(约总量的60％)和对羟基苯乙酮；然后控温40℃-45℃，加入剩余的水，1,3-丁二醇和1,2-己二醇；加入寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，精氨酸/赖氨酸多肽，乙酰基八肽-3，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷和燕麦(avena sativa)β-葡聚糖；混合均匀，得到所述液体；
[0085]
3)分别灌装制得的固体和液体，得到试剂盒。所得试剂盒具有较好的使用体验感。
[0086]
实施例ii-1：共晶的酪氨酸激酶活性抑制率测试
[0087]
采用斑马鱼试验方法，先测试共晶的最大检测浓度(mtc)，在此基础上，使用斑马鱼测试共晶的抑制酪氨酸激酶活性，确认共晶是否可以抑制酪氨酸激酶活性及抑制率情况；使用野生型ab品系斑马鱼，鱼龄：受精后6小时(6hpf)；按照实验室标准饲养和繁殖方法，符合国际aaalac认证的要求，饲养和繁殖成鱼。
[0088]
1)随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔15尾；按照设定浓度(质量分数)，将共晶用水溶解，同时设置正常对照组(水，不加共晶)，每孔容量为3ml；28℃条件下避光孵育45h；根据斑马鱼死亡情况和毒性情况，确定共晶对正常斑马鱼的mtc。mtc实验结果见下表。
[0089]
浓度(％)死亡数(尾)死亡率(％)表型正常对照组00未见明显异常共晶：0.06200与正常对照组状态相似共晶：0.1200与正常对照组状态相似共晶：0.2500与正常对照组状态相似共晶：0.5427/
[0090]
根据实验结果，测得共晶对正常斑马鱼的mtc为0.25％。
[0091]
2)随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔30尾；按照设定浓度(质量分数)，将测试样品用水溶解，同时设置正常对照组(不加测试样品)，每孔容量为3ml，并且三次生物学重复；28℃条件下避光孵育45h；收样后使用研磨仪研磨匀浆，离心取上清，用bca蛋白浓度测定试剂
盒，测定各实验组蛋白质浓度；取250μg斑马鱼样品总蛋白质，按体积比1:1加入1mmol/l的左旋多巴溶液，混匀；将液体转移至96孔板中，200μl/孔，利用酶标仪在475nm波长处测定吸光度值(od475)；根据公式计算样品的抑制酪氨酸激酶活性的抑制率，抑制率(％)＝(正常对照组的od475-样品组的od475)/正常对照组的od475*100％；统计学分析p《0.05，判定为有显著性差异；结果见下表。
[0092][0093]
备注：symwhite-377指苯乙基间苯二酚。
[0094]
根据实验结果可知，所述共晶可以明显抑制酪氨酸激酶活性。
[0095]
以下实施例中，液体(精华)采用按照实施例i-2所制得的液体。
[0096]
实施例ii-2：刺激性测试
[0097]
1)鸡胚绒毛尿囊膜眼刺激性试验：
[0098]
阴性对照组：0.9％nacl水溶液；阳性对照组：1％sds(十二烷基硫酸钠)水溶液；分别取0.3ml；
[0099]
样品组：临用前，用100mg共晶溶于3ml液体(精华)，取0.3ml；
[0100]
人参根提取物：临用前，用人参根提取物100mg溶于3ml液体(精华)，取0.3ml；
[0101]
白莱杭鸡spf级受精鸡胚，孵化鸡胚至第8日用照蛋器照蛋检查，弃未受精、无活性的鸡胚，选取血管发育良好的鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置；第9日开始试验。用牙科弯镊小心剥去气室蛋壳部分，在蛋壳膜表面滴几滴生理盐水使充分润湿，倾出后，用镊子小心除去蛋壳膜，保证暴露的尿囊膜完整不受任何损伤。取0.3ml受试物直接作用于绒毛尿囊膜(cam)，尽量涂布开，确保覆盖面积达到至少50％，作用3min后，用生理盐水轻轻冲洗cam表面，在30s内冲洗完成，倾出液体，立即在体视显微镜下观察每种毒性效应变化程度，给予评分(es)。评分标准见下表。
[0102]
[0103][0104]
评分计算公式：es＝6只鸡胚观察到出血、凝血、血管融解的程度总和/3；结论判定标准：es≤4为温和无刺激，4《es≤12为轻度刺激，12《es《16为中度刺激，es≥16为严重刺激；实验结果见下表。
[0105]
实验分组评分es结论阴性对照组0无刺激性阳性对照组18严重刺激性样品组1.33温和无刺激性人参根提取物5.33轻度刺激性
[0106]
根据实验结果可知，本发明的试剂盒在此模型下温和无刺激。
[0107]
2)受试者使用试验：
[0108]
样品处理：每天早上临用前，用100mg共晶溶于3ml液体(精华)，然后取适量涂抹于测试区域，其余于避光0℃-15℃环境存放。
[0109]
选择30名健康受试者(不区分是否为易过敏皮肤)，年龄20岁-40岁，平均年龄28岁，选取额头区域(面积相同)，洁面后每天早晚各使用1次测试样品，连续涂抹7天，每天观察是否有红肿、瘙痒、刺痛、皮疹等过敏现象或其他异常，并进行分析记录(如果出现严重过敏或异常情况，立即停用，清水清洁面部，需要时采取治疗措施)。测试结果如下：有1人在第一次使用时有轻微刺痛感，不久即消失，后续使用中无异常；有1人在前3天使用时皮肤出现轻微发红现象，不久即消失，后续使用中无异常；其他使用者整个过程中无异常。
[0110]
实施例ii-3：弹性蛋白酶抑制测试
[0111]
样品：临用前，用240mg固体(含有60mg共晶和180mg海藻糖)溶于3ml液体(精华)，取0.3ml。
[0112]
弹性蛋白酶抑制实验原理是弹性蛋白酶与酶底物发生反应，添加活性物质后吸光度发生变化，通过测定吸光度变化的大小可以反映弹性蛋白酶抑制剂抑制率的大小。
[0113]
参照《化妆品抗皱紧致功效体外测试方法(弹性蛋白酶抑制法)》设计、进行实验：在96孔板中加入适量的缓冲溶液、待测样品溶液或对照溶液、底物，振荡混匀后孵育20分钟，随后加入弹性蛋白酶溶液，立即振荡孵育10分钟，用酶标仪在410nm处测定吸光度，分析处理数据计算待测样品对弹性蛋白酶的抑制率；弹性蛋白酶抑制率(％)＝[1-(a-b)/(c-d)]*100％，式中：
[0114]
a为实验组吸光度(含底物、缓冲溶液、弹性蛋白酶溶液，含待测样品溶液)；
[0115]
b为实验空白组吸光度(含底物、缓冲溶液，不含弹性蛋白酶溶液，含待测样品溶液)；
[0116]
c为对照组吸光度(含底物、缓冲溶液、弹性蛋白酶溶液，不含待测样品溶液)；
[0117]
d为空白组吸光度(含底物、缓冲溶液，不含弹性蛋白酶溶液，不含待测样品溶液)；
[0118]
实验结果见下表。
[0119]
实验分组实验浓度弹性蛋白酶抑制率(％)p值差异性分析样品组80mg/ml18.84《0.05有统计学差异阳性对照组：槲皮素溶液200μg/ml94.57《0.05有统计学差异
阴性对照组：水/3.62//
[0120]
备注：p＜0.05说明与阴性对照组相比有统计学差异，p≥0.05说明与阴性对照组相比无统计学差异。
[0121]
根据实验结果可知，本发明的试剂盒可以有效抑制弹性蛋白酶，具有紧致抗皱作用。
[0122]
实施例ii-3：稳定性测试
[0123]
参照《中国药典》2020年版四部附录原料药与制剂稳定性试验指导原则设计进行试验，取共晶和配方8所得固体(共晶和海藻糖的混合物，质量比1:3)，考察各测试样品的稳定性情况，具体条件如下：高温试验(高温60℃)：样品置于棕色避光玻璃瓶中，密封，在60
±
2℃，75
±
5％rh下放置，于0天、7天分别取样，观察，检测。
[0124]
检测结果：7天时共晶样品中羟基酪醇的含量略有下降，配方8所得样品中羟基酪醇的含量不变，说明海藻糖的添加能有效的保护共晶中羟基酪醇稳定性。
[0125]
样品检测项0天7天共晶羟基酪醇含量52.0％48.9％配方8羟基酪醇含量9.9％10.3％
[0126]
实施例iii：不同使用方法测试
[0127]
样品处理：临用前，使用配方8所得固体和配方3所得液体，混合，配制成混合液，现用现配。
[0128]
测试准备：取适量样品混合液涂抹于受试者额头，确认受试者无过敏反应(红肿、瘙痒、刺痛、皮疹等过敏现象或其他异常)，则受试者可参加测试。
[0129]
对照组：选择2名健康的有色素沉着的受试者(不易过敏皮肤)，平均年龄32.5岁；洁面后，取配方8所得固体和配方3所得液体，混合配制成浓度为80mg/ml的混合液，所得混合液每天早晚各一次涂抹于面部，每次1.5ml；每位测试者在测试前和第10天，30天，60天使用visia皮肤检测仪检测记录皮肤状况。
[0130]
导入组：选择10名健康的有色素沉着的受试者(不易过敏皮肤)，年龄25岁-40岁，平均年龄33.5岁，测试前10天内未进行过相同操作，测试前3天未使用过样品或其他药品；洁面后使用医用碘伏消毒，并且用无菌纱布擦拭干净，然后取样品涂抹于面部，再使用电动微针导入仪导入，并且控制深度，每10天进行一次，测试期间采用物理方式防晒，并且在两次导入的间隔期内每天早晚2次使用配方3所得液体涂抹面部(导入后的当天不涂抹)，每次1.5ml；每天观察是否有红肿、瘙痒、刺痛、皮疹等过敏现象或其他异常(如果出现严重过敏或异常情况，立即停用，清水清洁面部，需要时采取必要治疗措施)，每位测试者在每次施用样品前用visia皮肤检测仪检测记录皮肤状况。
[0131]
测试结果：所有受试者(导入组和对照组)无过敏现象，使用后皮肤明显更为细腻，细纹减少，面部暗沉减轻，肤色整体提亮，使用1次(10天后)色斑无肉眼可见变化，使用多次后色斑变化略有不同，并且导入组在使用1次(10天后)细纹明显减少；具体见下表。
[0132][0133]
根据结果可知，通过仪器导入的使用方法，更有助于各成分被吸收利用，更好地发挥改善皮肤干燥粗糙，减轻色素沉着，细纹等抗衰老作用。
[0134]
本发明的方案已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容和范围内对本文所述的方案或应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进条件/参数来实现和/或应用本发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

技术特征：
1.一种固体和一种液体在制备用于消除、减轻和/或改善皮肤的干燥，粗糙，色素沉着和/或细纹老化现象的试剂盒中的应用，其中，所述固体由羟基酪醇和烟酰胺的共晶和海藻糖组成，所述共晶中羟基酪醇和烟酰胺的摩尔比为1:1；所述共晶与海藻糖的质量比为1:0.5-1:5；所述液体包括：寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5，精氨酸/赖氨酸多肽，乙酰基八肽-3，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，甘油葡糖苷，燕麦β-葡聚糖，对羟基苯乙酮，1,3-丁二醇，1,2-己二醇和水；所述液体任选含有可溶性胶原交联聚合物，透明质酸钠或透明质酸锌，1,2-戊二醇，甘油，甘油磷酸肌醇胆碱盐，苯氧乙醇和/或乙基己基甘油；所述固体和所述液体的使用方法包括：将所述固体和所述液体配制成浓度为60mg/ml-160mg/ml的混合液，再将混合液涂抹于有需要的皮肤处并使用仪器导入至皮下，或者将混合液在有需要的皮肤处通过仪器导入至皮下。2.根据权利要求1所述的应用，其中，混合液的用量为每平方厘米皮肤使用混合液0.001ml-0.1ml或0.003ml-0.1ml，或者混合液的用量为至少1ml/次。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，将固体与液体混合配制成60mg/ml的混合液，混合液的用量为至少4ml/次或至少8ml/次；或者将固体与液体混合配制成80mg/ml的混合液，混合液的用量为至少3ml/次或至少6ml/次；或将固体与液体混合配制成120mg/ml的混合液，混合液的用量为至少2ml/次或至少4ml/次；或将固体与液体混合配制成160mg/ml的混合液，混合液用量为至少1.5ml/次或至少3ml/次。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其中，所述混合液在混合后12小时内被施用。5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其中，混合液通过微针导入仪，滚针或超声导入仪导入至皮下，仪器导入至皮下时的深度控制为0-1mm或0.1mm-0.6mm。6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其中，将混合液至少连续3，5，6，7，9或10次导入施用于有需要的皮肤处，每次间隔至少7，10或15天。7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其中，两次导入的间隔期内的每一天，将所述液体施用于有需要的皮肤处，每天2次，每次至少1ml。8.根据权利要求1-7任一所述的应用，其中，所述共晶与海藻糖的质量比为1:3。9.根据权利要求1-8任一所述的应用，其中，所述液体中，基于液体的总质量，所述寡肽-1，寡肽-2，寡肽-5或精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数不超过0.002％，所述乙酰基八肽-3的质量分数不超过0.04％，或者所述二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数不超过0.1％；所述甘油葡糖苷的质量分数为0.5％-5％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数为0.5％-5％，所述对羟基苯乙酮的质量分数为0.1％-1％，所述1,3-丁二醇的质量分数为1％-10％，所述1,2-己二醇的质量分数为0.1％-2％。10.根据权利要求1-8任一所述的应用，其中，所述液体中，基于液体的总质量，寡肽-1的质量分数为0.0001％，寡肽-2的质量分数为0.00002％，寡肽-5的质量分数为0.00004％，精氨酸/赖氨酸多肽的质量分数为0.0002％，乙酰基八肽-3的质量分数为0.003％，二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐的质量分数为0.008％；所述甘油葡糖苷的质量分数为1％，所述燕麦β-葡聚糖的质量分数为1％，所述对羟基苯乙酮的质量分数为0.5％，所述1,3-丁二醇的质量分数为5％，所述1,2-己二醇的质量分数为0.6％；所述液体任选含有：质量分数为0.15％的可溶性胶原交联聚合物，质量分数为0.05％的透明质酸钠，质量分数为0.1％的1,2-戊二醇，质量分数为2.2％的甘油，质量分数为0.2％的甘油磷酸肌醇胆碱盐，和/或质量
分数为0.002％的苯氧乙醇或乙基己基甘油。

技术总结
本发明涉及一种固体的使用方法，属于医用制剂使用方法领域。本发明的方法，包括将固体和液体配制后经过仪器导入至皮下，所述使用方法有助于各成分被吸收利用，更好地发挥改善皮肤的干燥，粗糙，色素沉着，细纹等衰老老化现象。象。


技术研发人员：包瑶 杨文国 蓝晓芳
受保护的技术使用者：珠海瑞玞生物工程有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/6