一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶及其合成方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶及其合成方法与应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.纳米酶是具有天然酶催化活性的一类纳米材料，近年来，随着纳米技术的进步，越来越多的纳米材料被开发用于模拟天然酶，这些纳米酶具有易于制备、成本低和稳定性高的优点，在生物传感器、催化、仿生学、免疫检测和环境科学领域显示出巨大的应用前景，如金(au)、氧化铈(ceo2)、铂(pt)和碳纳米管(cnts)等纳米颗粒已被报道具有类似酶的活性，然而，目前基于cofs纳米酶活性进行肿瘤联合治疗的报道较少，尤其是研究通过改变单体掺杂比例来提高酶催化活性。目前已发现纳米材料具有过氧化氢酶、氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等活性。特别是模拟过氧化物酶(pod)通过调控细胞内活性氧(ros)的生成实现肿瘤催化治疗。pod通过催化肿瘤微环境中过氧化氢(h2o2)的分解，产生高度细胞毒性的羟基自由基(
·
oh)，导致癌症细胞损伤、凋亡，抑制肿瘤生长。然而，发明人研究发现，肿瘤微环境中h2o2的浓度有限，只靠pod纳米酶产生的单一催化疗法不足以完全消融肿瘤，这也就导致纳米酶在肿瘤治疗方面往往面临着催化效率低下、抗肿瘤效果不明显的问题。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶及其合成方法与应用，本发明通过铁卟啉单体与卟啉单体共同形成共价有机框架纳米酶，从而提高共价有机框架纳米酶的催化活性；同时，通过该共价有机框架纳米酶联合光热/光动力，能够改善纳米酶的肿瘤治疗效果。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一方面，一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶，由铁卟啉基共价有机框架负载2,2
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偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)，所述铁卟啉基共价有机框架由铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛通过形成席夫碱基团连接形成；
7.其中，所述铁卟啉单体的化学结构式为：
8.所述卟啉单体的化学结构式为：
9.其中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:1～8。
10.本发明研究表明，向卟啉cof中掺入铁能够增加卟啉cof的催化abts的活性，进一步研究表明，随着掺入铁量的增加，其催化abts的活性上升，本发明提供的上述铁卟啉基共价有机框架纳米酶具有较高的催化abts的活性。
11.另一方面，一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，将铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛进行席夫碱反应获得铁卟啉基共价有机框架；将铁卟啉基共价有机框架分散于溶剂中混合均匀获得分散液，向分散液中添加2,2
’‑
偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，搅拌10～20小时，离心分离，干燥，即得；
12.其中，所述铁卟啉单体的化学结构式为：
13.所述卟啉单体的化学结构式为：
14.其中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:1～8。
15.第三方面，一种上述铁卟啉基共价有机框架纳米酶在制备抗肿瘤药物中的应用。
16.本发明的有益效果为：
17.本发明通过改变铁卟啉单体的掺杂比例改变共价有机框架中的铁含量，从而提高共价有机框架纳米酶的催化活性。同时通过负载abts，构建了过氧化氢(h2o2)响应型铁卟啉基cof纳米酶体系，该纳米酶体系可催化肿瘤内源性h2o2产生高细胞毒性的羟基自由基(
·
oh)原位治疗肿瘤，同时abts转化为具有较强近红外光吸收的氧化型abts(oxabts)，在近红外光照射下实现光热治疗效果，而基于铁卟啉的cofs也可在近红外激光照射下产生单线态氧杀伤细胞，实现光动力治疗。而且，生成的oxabts可消耗肿瘤细胞中的谷胱甘肽进而增强催化疗法和光动力疗法。
附图说明
18.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
19.图1为本发明实施例1中fe-tph的合成路线图；
20.图2为本发明实施例1中fe-tphdha的合成路线图；
21.图3为本发明对比例中tphdha的合成路线图；
22.图4为本发明实施例中不同摩尔比的fe-tphdha的x射线衍射图谱；
23.图5为本发明实施例中不同摩尔比的fe-tphdha催化abts在425nm处的吸光度结果图；
24.图6为本发明实施例中不同条件下tmb/fe-tphdha/h2o2体系的紫外可见光谱，a为不同h2o2浓度条件，b为不同fe-tphdha浓度条件，c为不同ph值条件；
25.图7为本发明实施例中不同组处理下hct116细胞的细胞存活率结果图；
26.图8为本发明实施例中不同组处理hct116细胞后活/死细胞染色激光共聚焦图像，a为pbs，b为激光处理，c为fe-tphdha处理，d为abts@fe-tphdha，e为fe-tphdha+660nm激光，f为abts@fe-tphdha+660nm激光，g为abts@fe-tphdha+808nm激光，h为abts@fe-tphdha+(660+808)nm激光，比例尺为100μm；
27.图9为本发明实施例中不同处理组小鼠的相对肿瘤体积生长曲线和对应的肿瘤图像。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
30.鉴于现有纳米酶在在肿瘤治疗方面存在催化效率低下、抗肿瘤效果不明显的问题，本发明提出了一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶及其合成方法与应用。
31.本发明的一种典型实施方式，提供了一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶，由铁卟啉基共价有机框架负载2,2
’‑
偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)，所述铁卟啉基共价有机框架由铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛通过形成席夫碱基团连接形成；
32.其中，所述铁卟啉单体的化学结构式为：
33.所述卟啉单体的化学结构式为：
34.其中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:1～8。
35.在一些实施例中，铁卟啉基共价有机框架与2,2
’‑
偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的质量比为3.5～4.5:1。
36.在一些实施例中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1::2～5。研究表明，该摩尔条件下，尤其是摩尔比为1:2～3的纳米酶催化活性更好。
37.本发明的另一种实施方式，提供了一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，将铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛进行席夫碱反应获得铁卟啉基共价有机框架；将铁卟啉基共价有机框架分散于溶剂中混合均匀获得分散液，向分散液中添加2,2
’‑
偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，搅拌10～20小时，离心分离，干燥，即得；
38.其中，所述铁卟啉单体的化学结构式为：
39.所述卟啉单体的化学结构式为：
40.其中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:1～8。
41.在一些实施例中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:2～5，优选为1:2～3，进一步优选为1:2.0～2.5。
42.在一些实施例中，进行席夫碱反应采用的溶剂为二氯苯与乙醇的混合物。二氯苯与乙醇的体积比为1:0.9～1.1。
43.在一些实施例中，进行席夫碱反应的体系中含有乙酸。
44.在一些实施例中，进行席夫碱反应的过程为：将铁卟啉单体、卟啉单体、2,5-二羟基苯甲醛加入至溶剂中超声分散均匀，经过冷冻-抽真空除氧处理后，进行密封，加热至110～130℃反应。
45.在一些实施例中，铁卟啉基共价有机框架与2,2
’‑
偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的质量比为3.5～4.5:1。
46.在一些实施例中，铁卟啉单体的制备方法为：将卟啉单体与亚铁盐加入至溶剂中分散均匀，再进行冷冻-抽真空-解冻循环处理，然后再惰性气氛下，加热至110～130℃进行反应。
47.本发明的第三种实施方式，提供了一种上述铁卟啉基共价有机框架纳米酶在制备抗肿瘤药物中的应用。
48.具体地，所述抗肿瘤药物为催化、光热和光动力联合治疗肿瘤的药物。
49.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
50.实施例1
51.1.铁卟啉(fe-tph)的制备
52.将5,10,15,20-四(4-氨基苯基)-21h,23h-卟啉(tph)(93.12mg,0.138mmol)、feso4(41.8mg,0.275mmol)和dmf(20ml)放入pyrex管中，超声分散均匀，采用冷冻泵解冻技术进行三次冷冻-抽真空-解冻后，将管子在n2下密封，在120℃下搅拌4小时。冷却至室温后，向上述溶液中加入80ml水，抽滤，收集产生的固体，用甲醇洗涤，并在真空烘箱中干燥，得到fe-tph，合成路线如图1所示。
53.2.铁卟啉基cof(fe-tphdha)的制备
54.将2,5-二羟基苯甲醛(dha)(13.3mg,0.08mmol)、tph(18mg,0.0267mmol)、fe-tph(9mg,0.0133mmol)和二氯苯-乙醇(2ml，二氯苯:乙醇＝1:1)混合，超声10min，最后加入乙酸(0.2ml,6mol/l)，经过冷冻，抽真空，密封，在烘箱中120℃加热5天。用乙醇洗涤，120℃真空干燥12h后，得到fe-tphdha固体，合成路线如图2所示。
55.3.制备负载了abts的铁卟啉基cof(abts@fe-tphdha)
56.将fe-tphdha(0.4mg)溶于乙醇(1ml)，超声，2,2
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偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)(0.1mg)溶于水(1ml)，将二者混合并在室温下搅拌，12小时后，离心(8000r/min，5min)，用乙醇洗涤，在60℃真空烘箱中干燥6小时，最终得到abts@fe-tphdha粉末。
57.实施例2
58.本实施例与实施例1相同，区别在于：铁卟啉基cof(fe-tphdha)的制备过程中，tph与fe-tph的摩尔比为3:1，即tph为0.03mmol，fe-tph为0.01mmol。
59.实施例3
60.本实施例与实施例1相同，区别在于：铁卟啉基cof(fe-tphdha)的制备过程中，tph与fe-tph的摩尔比为4:1，即tph为0.032mmol，fe-tph为0.008mmol。
61.实施例4
62.本实施例与实施例1相同，区别在于：铁卟啉基cof(fe-tphdha)的制备过程中，tph与fe-tph的摩尔比为5:1，即tph为0.0333mmol，fe-tph为0.0067mmol。
63.实施例5
64.本实施例与实施例1相同，区别在于：铁卟啉基cof(fe-tphdha)的制备过程中，tph与fe-tph的摩尔比为8:1，即tph为0.0356mmol，fe-tph为0.0044mmol。
65.对比例
66.1.铁卟啉(fe-tph)的制备
67.将5,10,15,20-四(4-氨基苯基)-21h,23h-卟啉(tph)(93.12mg,0.138mmol)、feso4(41.8mg,0.275mmol)和dmf(20ml)放入pyrex管中，超声分散均匀，采用冷冻泵解冻技术进行三次冷冻(液氮冷冻)-抽真空-解冻后，将管子在n2下密封，在120℃下搅拌4小时。冷却至室温后，向上述溶液中加入80ml水，抽滤，收集产生的固体，用甲醇洗涤，并在真空烘箱中干燥，得到fe-tph，合成路线如图1所示。
68.2.铁卟啉基cof(fe-tphdha)的制备
69.将2,5-二羟基苯甲醛(dha)(13.3mg,0.08mmol)、tph(27mg,0.04mmol)和二氯苯-乙醇(2ml，二氯苯:乙醇＝1:1)混合，超声10min，最后加入乙酸(0.2ml,6mol/l)，采用冷冻泵解冻技术进行三次冷冻(液氮冷冻)-抽真空-解冻后，再经过冷冻，抽真空，密封，在烘箱中120℃加热5天。用乙醇洗涤，120℃真空干燥12h后，得到tphdha固体，合成路线如图3所示。
70.实施例1～5合成了不同铁卟啉与卟啉掺杂摩尔比的cof，分别命名为fe-tphdha(1)(1:2)，fe-tphdha(2)(1:3)，fe-tphdha(3)(1:4)，fe-tphdha(4)(1:5)和fe-tphdha(5)(1:8)，其x射线衍射图谱如图4所示，说明不同铁含量的铁卟啉基cof与cof具有相同的晶体结构。
71.不同摩尔比的fe-tphdha催化abts在425nm处的吸光度如图5所示，在不同fe含量的fe-tphdha中，fe-tphdha(1)/h2o2/abts体系的吸收峰在425nm处最强，同时体系颜色由无色变为绿色,表明有oxabts生成，由此可以证实fe-tphdha(1)的酶催化活性最好，在后续的工作中也选择了fe-tphdha(1)进行研究，以下直接命名为fe-tphdha。
72.在过氧化氢存在下，fe-tphdha可以催化过氧化物酶底物3,3’,5,5
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四甲基联苯胺(tmb)氧化，生成蓝色的oxtmb，从图6可以看出，fe-thpdha/h2o2/tmb体系的紫外-可见光谱在650nm处出现特征吸收峰，颜色由无色变为蓝色，说明体系中有oxtmb生成，验证了fe-tphdha的模拟过氧化物酶性能，且其催化活性具有自身浓度依赖性，h2o2浓度依赖性，纳米酶浓度越高，h2o2浓度越高，蓝色越深，催化活性还受ph的影响，在ph＝5.5时的活性更好，说明fe-tphdha是一种对酸性环境敏感的纳米酶。
73.通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)法研究abts@fe-tphdha诱导的联合治疗体外细胞毒性，结果如图7所示，由于细胞毒性
·
oh的生成，abts@fe-tphdha组的细胞存活率呈现出浓度依赖性，在660nm(100mw/cm2,10min)或者808nm(2w/cm2,10min)近红外激光照射下，产生的光动力治疗和光热治疗的细胞存活率分别为57.33％和53.10％，在660和808nm激光的共同照射下，细胞存活率急剧下降至29.46％，表明催化治疗
74./pdt/ptt联合治疗能更有效的杀伤肿瘤细胞。用活/死细胞染色法进一步观察不同处理组对肿瘤细胞的杀伤效果，结果显示660和808nm激光共同照射下，abts@fe-tphdha组细胞的死亡率最高，如图8所示，与mtt实验结果一致。
75.如图9所示，与对照组(pbs)相比，abts@fe-tphdha+pdt+ptt组的肿瘤治疗效果最好，与细胞实验结果一致，也与肿瘤照片的显示结果一致。
76.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶，其特征是，由铁卟啉基共价有机框架负载2,2
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偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，所述铁卟啉基共价有机框架由铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛通过形成席夫碱基团连接形成；其中，所述铁卟啉单体的化学结构式为：所述卟啉单体的化学结构式为：其中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:1～8。2.如权利要求1所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶，其特征是，铁卟啉基共价有机框架与2,2
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偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的质量比为3.5～4.5:1。3.如权利要求1所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶，其特征是，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:2～5，优选为1:2～3。4.一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，其特征是，将铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛进行席夫碱反应获得铁卟啉基共价有机框架；将铁卟啉基共价有机框架分散于溶剂中混合均匀获得分散液，向分散液中添加2,2
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偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，搅拌10～20小时，离心分离，干燥，即得；其中，所述铁卟啉单体的化学结构式为：所述卟啉单体的化学结构式为：其中，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:1～8。5.如权利要求4所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，其特征是，铁卟啉单体与卟啉单体的摩尔比为1:2～5，优选为1:2～3，进一步优选为1:2.0～2.5。6.如权利要求4所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，其特征是，进行席夫碱反应采用的溶剂为二氯苯与乙醇的混合物；优选地，二氯苯与乙醇的体积比为1:0.9～1.1；或，进行席夫碱反应的体系中含有乙酸；
或，进行席夫碱反应的过程为：将铁卟啉单体、卟啉单体、2,5-二羟基苯甲醛加入至溶剂中超声分散均匀，经过冷冻-抽真空除氧处理后，进行密封，加热至110～130℃反应。7.如权利要求4所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，其特征是，铁卟啉基共价有机框架与2,2
’‑
偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的质量比为3.5～4.5:1。8.如权利要求4所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶的合成方法，其特征是，铁卟啉单体的制备方法为：将卟啉单体与亚铁盐加入至溶剂中分散均匀，再进行冷冻-抽真空-解冻循环处理，然后再惰性气氛下，加热至110～130℃进行反应。9.一种权利要求1～3任一所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶或权利要求4～8任一所述的合成方法制备的铁卟啉基共价有机框架纳米酶在制备抗肿瘤药物中的应用。10.如权利要求9所述的铁卟啉基共价有机框架纳米酶在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是，所述抗肿瘤药物为催化、光热和光动力联合治疗肿瘤的药物。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种铁卟啉基共价有机框架纳米酶及其合成方法与应用。铁卟啉基共价有机框架纳米酶由铁卟啉基共价有机框架负载ABTS，所述铁卟啉基共价有机框架由铁卟啉单体、卟啉单体与2,5-二羟基苯甲醛通过形成席夫碱基团连接形成。本发明通过铁卟啉单体与卟啉单体共同形成共价有机框架纳米酶，从而提高共价有机框架纳米酶的催化活性；同时，通过该共价有机框架纳米酶联合光热/光动力，能够改善纳米酶的肿瘤治疗效果。能够改善纳米酶的肿瘤治疗效果。能够改善纳米酶的肿瘤治疗效果。


技术研发人员：冯杰 于浩 孔斐 李宸宇 董育斌
受保护的技术使用者：山东师范大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/6