一种萎缩芽孢杆菌WLKYSY-4、生物菌剂及应用的制作方法

一种萎缩芽孢杆菌wlkysy-4、生物菌剂及应用
技术领域
1.本发明属于微生物学、生物技术和生物防治技术领域，具体涉及一种萎缩芽孢杆菌wlkysy-4、生物菌剂及应用。


背景技术：

2.芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧，可产生芽孢的革兰氏阳性菌。芽孢杆菌最突出的特点是可在恶劣的环境中产生抗逆性强的芽孢以度过不良的环境条件，且在自然界中普遍存在、对人畜无害、对植物无致病性，并且大多数芽孢杆菌还能够对一些植物病原菌生长有抑制作用。因此，芽孢杆菌成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的植物生防细菌之一。
3.目前，植物病害的防治仍以化学防治为主，长期使用化学农药不仅使植物病原菌产生抗药性，同时造成农药的残留，杀伤天敌，污染环境，威胁人类健康，破坏生态平衡。利用拮抗微生物防治植物病害对人畜无毒，不污染环境，无残留，能保持农产优良品质，对害虫天敌和有益生物安全，有助于保持生态平衡等优点。
4.但是生防微生物与土壤环境中的微生物群落之间往往存在相互作用，外源拮抗微生物的引入可以引起作物根际土壤微生物群落的组成发生变化，因此生防菌剂的使用有很大的地域适应性。目前国内外的一些商品化生防菌制剂由于上述原因在防治本地农作物上的一些土传病害时，效果并不理想，这就迫切需要立足本地特有的微生物资源，筛选出一些适合本土土壤和气候条件的生防菌用于作物病害的防治，这不论在技术发明上还是在实际应用方面都有重大意义。从民勤青土湖肉苁蓉种植区土壤中分离筛选获得的对多种病原菌有拮抗作用的生防菌株，对于植物病害的防治具有非常重要的意义。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明的目的是提供一株广谱抗病萎缩芽孢杆菌wlkysy-4、生物菌剂及其应用，特别涉及该菌在植物病害生物防治方面的应用。
6.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
7.一种萎缩芽孢杆菌wlkysy-4，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.26815，分类命名：萎缩芽孢杆菌bacillus atrophaeus，保藏日期：2023年3月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.一种生物菌剂，其含有如上所述的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4。
9.如上所述的生物菌剂，其由所述萎缩芽孢杆菌wlkysy-4经发酵而成。
10.如上所述的生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述萎缩芽孢杆菌wlkysy-4首先接种于lb固体培养基活化，然后将活化后的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4接种于lb液体培养基发酵培养，制成种子液，所述种子液再接种于lb液体培养基中发酵培养，得到生物菌剂。
11.优选的，所述培养温度为26～30℃；所述种子液接种量为4～6％，所述种子液发酵培养时间为2～4d。
12.如上所述的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4或如上所述的生物菌剂在抗病原菌、或由病原菌所导致的相关疾病和植物病害中的应用。
13.优选的，所述病原菌为肉苁蓉茎腐病菌、葡萄灰霉病菌和枸杞叶枯病菌中的至少一种；所述植物病害为肉苁蓉茎腐病、葡萄灰霉病和枸杞叶枯病中的至少一种。
14.优选的，所述肉苁蓉茎腐病菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和锐顶镰刀菌中的至少一种；所述葡萄灰霉病菌为灰葡萄孢霉菌；所述枸杞叶枯病菌为链格孢属。
15.如上所述的应用方法，将包含所述萎缩芽孢杆菌wlkysy-4的生物菌剂，对植物进行灌根或喷洒。
16.优选的，所述生物菌剂稀释至其中的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4有效活菌数为1.0
×
106～1.0
×
108cfu/ml后使用。
17.本技术提供的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4对多种植物病害无论是预防防治还是治疗防治都有较好的防治效果，在生物农药方面具有非常好的应用前景。
附图说明
18.图1为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌落形态。
19.图2为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4革兰氏染色。
20.图3为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株的系统进化树。
21.图4为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4产纤维素酶的能力。
22.图5为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4产蛋白酶的能力。
23.图6为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4产淀粉酶的能力。
24.图7为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的抑菌谱。
25.注：a.尖孢镰刀菌:图左为受拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株影响的尖孢镰刀菌，图右为正常生长的尖孢镰刀菌；b.层出镰刀菌:图左为受拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株影响的层出镰刀菌，图右为正常生长的层出镰刀菌；c.锐顶镰刀菌:图左为受拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株影响的锐顶镰刀菌，图右为正常生长的锐顶镰刀菌；d.葡萄灰霉病菌:图左为受拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株影响的葡萄灰霉病菌，图右为正常生长的葡萄灰霉病菌；e.枸杞叶枯病菌:图左为受拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株影响的枸杞叶枯病菌，图右为正常生长的枸杞叶枯病菌；
26.图8为本发明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4在葡萄叶片上对灰霉的防治效果；其中，从左到右依次为：wlkysy-4菌剂、阳性药剂对照、阴性对照。
具体实施方式
27.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中所涉及的病原菌来源如表1所示。
28.表1
29.病原菌来源尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)武威市林业科学研究院层出镰刀菌(fusariumprolifertum)武威市林业科学研究院
锐顶镰刀菌(fusariumacuminatum)武威市林业科学研究院葡萄灰霉病菌(botrytiscinerea)武威市林业科学研究院枸杞叶枯病菌(alternariaalternata)武威市林业科学研究院
30.实施例1
31.本实施例的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4的分离筛选方法及其鉴定如下所述。其中本实施例的菌株2020年采自甘肃省武威市民勤县青土湖肉苁蓉种植区土壤中。
32.1、拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的筛选，该筛选过程包括以下步骤：
33.1)将采集的肉苁蓉种植区土壤称取10g，加入装有90ml无菌水并放有玻璃珠的250ml锥形瓶中，80℃水浴30min，再充分振荡30min，10倍倍比稀释，用无菌涂布棒涂于lb培养基平板上，以无菌水为对照。纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、g+的分离物为芽孢杆菌。将采用上述方法分离得到的芽孢杆菌编号，观察菌落形态，其中每1000ml lb培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，琼脂粉15g，ph 7.0～7.2。
34.2)将已培养3d的引起肉苁蓉茎腐病的尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、层出镰刀菌(fusarium prolifertum)和锐顶镰刀菌(fusarium acuminatum)(申请人从甘肃省武威市民勤县青土湖肉苁蓉种植区肉苁蓉发病植株分离、鉴定获得)用5mm打孔器打孔或者接种少量的菌丝，其中尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、层出镰刀菌(fusarium prolifertum)和锐顶镰刀菌(fusarium acuminatum)菌饼的直径为5mm，将菌饼移到马铃薯琼脂培养基(pda)中央，在离真菌等距离的四周接上待测芽孢杆菌，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。
35.3)3～5d后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、层出镰刀菌(fusarium prolifertum)和锐顶镰刀菌(fusarium acuminatum)具有最强抑制效果的1株菌株，命名为wlkysy-4。
36.2、肉苁蓉茎腐病病菌拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株的鉴定
37.采用菌落形态观察、常规生理生化及分子生物学方法对wlkysy-4菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于萎缩芽孢杆菌。
38.1)拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株在lb培养基(1000ml lb培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，琼脂粉15g，ph7.0～7.2)平板上呈乳白色，不透明，菌落光滑，中央隆起，有褶皱，边缘完整(如图1所示)。
39.2)通过显微镜观察表明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌体大小约0.5～0.8μm
×
1.5～2.5μm之间，无荚膜，有芽孢，周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性(如图2所示)。
40.3)生化实验结果表明，拮抗芽孢杆菌wlkysy-4具有运动性，好氧，v-p反应呈阳性，甲基红反应呈阳性，接触酶反应呈阳性，氧化酶反应呈阳性，能还原硝酸盐，水解淀粉和酪蛋白，能液化明胶，能氧化葡萄糖、l-阿拉伯糖、甘露醇产酸，不能氧化d-木糖产酸，氧化葡萄糖但不产气。能在0.5～10％的nacl浓度的lb培养液(每1000ml含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，琼脂粉15g，ph 7.0～7.2)中生长。本实施例的拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株的生物学特性如表2所示。
41.表2拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株的基本生物学特性
42.革兰氏染色+甲基红反应+
淀粉水解+接触酶+需氧性测定+10％nacl+v-p测试+ph5.7+葡萄糖+温度生长范围15～45℃阿拉伯糖+石蕊-牛奶变红red形成吲哚﹣卵磷脂酶测定+酪氨酸水解﹣酪蛋白水解+甘露醇+硫化氢生成+硝酸盐还原+利用碳水化合物产酸+明胶+v-p反应后ph值6.77～7.33柠檬酸利用+l-阿拉伯糖+最适生长ph7最适生长温度28℃氧化酶试验+利用葡萄糖产气﹣丙二酸盐利用+ph生长范围4～10d-木糖产酸﹣
43.注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
44.4)拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株的分子生物学鉴定
45.16s rdna基因序列测定及其系统进化树的构建。提取细菌基因组dna为模板，以7f(5'-cagagtttgatcctggct-3')和1540r(5'-aggaggtgat ccagccgca-3')(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)为上、下游引物扩增菌株的16s rdna。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送往该公司进行序列测定。测得该菌株的16srdna核苷酸序列长度为1460bp(如seq id no:1所示)，genbank登录号为oq345824。将该序列与genbank中相关数据进行相似性分析，通过与ncbi中菌株的16s rdna序列比对分析和系统发育树的构建(如图3所示)，可以发现：菌株wlkysy-4与萎缩芽孢杆菌bacillus atrophaeus(genbank登录号为nr024689.1)聚类在同一大分支内(支持率100％)，说明该菌株与萎缩芽孢杆菌菌株相似性最高。
46.综合菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16s rdna序列分析结果，最终确定wlkysy-4菌株为萎缩芽孢杆菌bacillus atrophaeus。
47.3、本发明提供萎缩芽孢杆菌wlkysy-4生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
48.首先将萎缩芽孢杆菌wlkysy-4接种于lb固体培养基活化，然后将活化后的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4接种于lb液体培养基发酵培养，制成种子液，种子液再接种于lb液体培养基中发酵培养，得到生物菌剂。
49.其中，优选的，培养温度为26～30℃；种子液接种量为4～6％，种子液发酵培养时间为2～4d。
50.进一步地，本实施例提供一种优选的制备方法，具体包括以下步骤：
51.1)种子液的制备：将拮抗芽孢杆菌先经过lb固体培养基活化，于28℃下培养36h，将经活化后的拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株接种于lb液体培养基中于28℃下150r/min振荡培养24h，制成种子液；
52.其中，lb固体培养基和液体培养基的组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，
nacl 10g/l，ph7.4；固体培养基还包括琼脂粉15g/l；
53.2)发酵培养：种子液按5％的接种量接入装有100ml lb液体培养基的250ml三角瓶中，150r/min振荡培养28℃下，进行恒温发酵培养，培养3d后，用无菌水稀释至有效成分含量1.0
×
106～1.0
×
108cfu/ml后，得到生物菌剂。
54.实施例2
55.将培养1d的拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株点接在纤维素培养基、酪蛋白培养基和淀粉培养基上，每皿接3株菌，30℃培养2～7d，以空白作对照，设3个重复；观察菌落周围有无透明圈产生，其中淀粉培养基在观察之前应滴加数滴碘液，纤维素酶活性的测定用1g/l的刚果红染10～15min，然后，倒掉染液，再用1mol/l的nacl浸泡15min，检查透明圈的有无，培养过程中发现：拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株在纤维素酶、蛋白酶培养基和淀粉酶培养基上都能正常生长而且菌落周围有明显的水解圈产生，从图4、图5和图6中明显观察到，表明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株在生长代谢过程中分泌产生了纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶，从而水解了培养基中的纤维素、蛋白质及淀粉，导致菌落周围出现透明降解圈，这表明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4在抑制植物病原菌生长、防治植物病害时产生了一系列酶类。
56.本实施例中，所述产纤维素酶培养基为羧甲基纤维素培养基(1000ml)：cmc-na 5.0g，mgso4·
7h2o 0.1g，(nh4)2so
4 0.5g，k2hpo
4 0.25g，琼脂16g，水l000ml。
57.本实施例中，所述产蛋白酶培养基为酪蛋白培养基(1000ml)：脱脂奶粉20g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，琼脂16g，水1000ml，ph7.0。
58.本实施例中，所述产淀粉酶培养基为淀粉培养基(1000ml)：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，葡糖糖5g，nacl 5g，牛肉膏5g，琼脂16g，水1000ml，ph 7.0。
59.实施例3
60.菌株wlkysy-4对植物病原真菌的抑制
61.采用对峙培养法检测wlkysy-4的真菌抑菌谱，分别测定其对引起肉苁蓉茎腐病的3株镰刀菌分别为尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、层出镰刀菌(fusarium prolifertum)和锐顶镰刀菌(fusarium acuminatum)、葡萄灰霉病菌(botrytis cinerea)和枸杞叶枯病菌(alternaria alternata)的抑制效果，首先将病原菌在pda平皿上活化，用5mm打孔器制作病原菌菌饼或者挑取少数菌丝，接种于pda平皿中央，用牙签将wlkysy-4点接于距离菌饼2cm处，25℃培养4～7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照式i)计算抑制率，结果如图7和表3所示。
[0062][0063]
表3 wlkysy-4的抑菌谱
[0064]
病原菌抑制率(％)尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)57.93
±
1.21层出镰刀菌(fusariumprolifertum)45.60
±
1.78锐顶镰刀菌(fusariumacuminatum)45.20
±
1.34葡萄灰霉病菌(botrytiscinerea)76.67
±
0.92枸杞叶枯病菌(alternariaalternata)54.55
±
0.45
[0065]
实施例4
[0066]
田间试验防治肉苁蓉茎腐病的效果
[0067]
2021年4月，选取民勤青土湖肉苁蓉种植区为实验地，挑选刚刚露头的肉苁蓉，挖开露出肉苁蓉接种部位(接种部位是肉苁蓉种子与梭梭根部寄生生长的部位，每株梭梭上大约每年1～2个肉苁蓉接种部位生长出肉苁蓉，每个接种部位上大约生长1～20个肉苁蓉不等)，处理1为ck空白对照，用肉苁蓉茎腐病3种镰刀菌孢子液(10倍镜下每视野200个左右)200ml每个接种部位(下同)灌根，待24h完全吸收后，然后使用没有接种芽孢杆菌wlkysy-4的空白发酵液200ml进行灌根；处理2为先用拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的菌剂(实施例1中制备，下同)200ml(下同)灌根，待24h完全吸收后，然后再用肉苁蓉茎腐病3种镰刀菌孢子液灌根，待完全吸收后沙土回填；处理组3先用肉苁蓉茎腐病3种镰刀菌孢子液灌根，待24h吸收后，用拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的菌剂灌根，待完全吸收后沙土回填，调查每株梭梭的全部接种部位里的肉苁蓉发病情况。每个处理组采用6个梭梭植株作为重复，比较肉苁蓉茎腐病的发病率，结果发现施用拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌剂的植株肉苁蓉茎腐病发病率(处理组2、处理组3)显著低于未施用菌液的对照组(表4)。而且处理2先施用拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的菌剂的肉苁蓉茎腐病发病率，明显低于处理3后施用拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的菌剂，因此，证明在针对肉苁蓉茎腐病时，优选在发病前首先施用拮抗芽孢杆菌wlkysy-4的菌剂进行预防防治。
[0068]
表4不同处理组的发病率
[0069]
实验组肉苁蓉茎腐病发病率(％)处理191
±
5.64a处理217
±
4.78c处理329
±
8.32b
[0070]
注：表中数据为平均值
±
标准差。同列数据后不同字母表示经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。
[0071]
由镰刀菌引起的肉苁蓉茎腐病，常常使肉苁蓉肉质茎腐烂，是肉苁蓉的一种主要病害。因为，肉苁蓉是直接食用或药用，所以其生产过程多数都是有机生产为主，不能使用任何化肥农药，使得该病害发生时生产者几乎不能采取任何防治措施，造成该产业健康发展严重受阻。本技术提供的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4经实验室内抑菌和大田实验证明，可以有效的预防和治疗肉苁蓉茎腐病的发病率。
[0072]
实施例5
[0073]
实施例wlkysy-4在葡萄叶片上对灰霉病的防治效果
[0074]
离体叶片法测定防治效果：选取生长一致的健康葡萄叶片(葡萄品种为酿酒葡萄甘农大6号)，用无菌水冲洗干净，在实施例1制备的wlkysy-4菌剂(同上)200ml中浸泡30分钟后，用脱脂棉包住叶柄，叶背朝上，置于垫有无菌湿纱布的培养皿中(直径200mm)，每个培养皿中放置一枚叶片，用保鲜膜密封好，25℃培养1d。之后在叶背主叶脉处接种培养的直径为5mm的灰葡萄孢菌饼，再次密封，置于25℃培养，以50％多菌灵500倍液为阳性药剂对照，以无菌水为阴性对照，处理方法和用量同wlkysy-4菌剂。每天观察，待对照充分发病后采用十字相乘法测量病斑直径，计算病斑面积。设空白对照，每个处理6次重复(表5)。
[0075]
病斑面积(mm2)＝病斑长度(mm)
×
病斑宽度(mm)
×
3.14/4
[0076]
防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积
×
100
[0077]
表5 wlkysy-4在葡萄叶片上对灰霉的防治效果
[0078]
处理病斑面积防效(％)空白对照＝208.81
±
3.56a-wlkysy-4液体制剂＝50.24
±
4.53b75.94
±
3.24b多菌灵＝32.97
±
7.81c84.21
±
5.63a
[0079]
注：表中数据为平均值
±
标准差。同列数据后不同字母表示经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。
[0080]
实施例6
[0081]
田间试验防治枸杞叶枯病的效果
[0082]
田间防治试验于2021年在甘肃省武威市林业科学研究院枸杞栽培园进行，枸杞品种为宁夏枸杞。将筛选到的拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株进行田间药效测试，采用实施例1制备的wlkysy-4菌剂(同上)，以80％代森锰锌wp 800倍液、清水为对照。具体设计如下：
[0083]
1)预防防治效果先喷药后接种枸杞叶枯病病原菌。选择20cm左右的枝条，对上面的青果(20个左右)进行针刺处理，先喷施10ml左右各处理药剂，24h后，再喷施10ml左右孢子悬浮液(10倍镜下每视野200个左右)，套上保鲜袋保湿12h，以清水为对照，随机选择枸杞植株，每个处理10个枝条，每次3个重复。10d后分别调查发病情况，并计算病情指数及防效，结果如表6所示。
[0084]
病情指数＝∑(各级病果数
×
该病级值)/(调查总果数
×
最高级值)
×
100％；
[0085]
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数/对照病情指数)]
×
100％；
[0086]
枸杞叶枯病分级标准，0级：果实表面伤口愈合，不扩展；1级：果实表面(0～1/8)变黑；2级：果实表面(1/8～1/4)变黑；3级：果实表面(1/4～1/2)变黑；4级：果实表面1/2以上变黑。
[0087]
由表6中的结果表明，拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌剂在枸杞植株先喷药后接种枸杞叶枯病菌后病情指数为34.32，防治效果为64.78％；而对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液处理的病情指数为31.35，防治效果为67.83％。
[0088]
表6拮抗芽孢杆菌wlkysy-4对枸杞叶枯病的田间预防防治效果
[0089]
处理病情指数防治效果(％)wlkysy-434.32
±
0.56b64.78b80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液31.35
±
0.21c67.83a清水对照ck97.45
±
0.86a—
[0090]
注：表中数据为平均值
±
标准差。同列数据后不同字母表示经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。
[0091]
2)治疗防治效果先接种枸杞叶枯病病原菌后喷药，选择20cm左右的枝条，对上面的青果(20个左右)进行针刺处理，先喷施10ml左右病原菌孢子悬浮液(10倍镜下每视野200个左右)，套上保鲜袋保湿12h，以清水为对照，再喷10ml左右各处理药剂(同上)，随机选择枸杞植株，每个处理10个枝条，每次3个重复。10d后分别调查发病情况，并计算病情指数及防效。病情指数、防治效果和枸杞叶枯病分级标准同上。
[0092]
结果(表7)表明，拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株菌剂在枸杞植株先接种枸杞叶枯病病菌后喷药病情指数为35.42，防治效果为63.54％；而对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂
800倍液处理的病情指数为29.45，防治效果为69.69％。
[0093]
表7拮抗芽孢杆菌wlkysy-4对枸杞叶枯病的田间治疗防治效果
[0094]
处理病情指数防治效果(％)wlkysy-435.42
±
0.38b63.54b80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液29.45
±
0.98c69.69a清水对照ck97.15
±
0.43a—
[0095]
注：表中数据为平均值
±
标准差。同列数据后不同字母表示经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。
[0096]
通过田间试验，进一步证明拮抗芽孢杆菌wlkysy-4菌株对多种植物病害无论是预防防治还是治疗防治都有较好的防治效果，作为微生物农药具有一定的开发应用前景。
[0097]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0098]
[0099]

技术特征：
1.一种萎缩芽孢杆菌wlkysy-4，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.26815。2.一种生物菌剂，其特征在于，其含有如权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4。3.如权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于，其由所述萎缩芽孢杆菌wlkysy-4经发酵而成。4.如权利要求2～3所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述萎缩芽孢杆菌wlkysy-4首先接种于lb固体培养基活化，然后将活化后的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4接种于lb液体培养基发酵培养，制成种子液，所述种子液再接种于lb液体培养基中发酵培养，得到生物菌剂。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养温度为26～30℃；所述种子液接种量为4～6％，所述种子液发酵培养时间为2～4d。6.如权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4或如权利要求2～3任一项所述的生物菌剂在抗病原菌、或由病原菌所导致的相关疾病和植物病害中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病原菌为肉苁蓉茎腐病菌、葡萄灰霉病菌和枸杞叶枯病菌中的至少一种；所述植物病害为肉苁蓉茎腐病、葡萄灰霉病和枸杞叶枯病中的至少一种。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肉苁蓉茎腐病菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和锐顶镰刀菌中的至少一种；所述葡萄灰霉病菌为灰葡萄孢霉菌；所述枸杞叶枯病菌为链格孢属。9.如权利要求6～8任一项所述的应用方法，其特征在于，将包含所述萎缩芽孢杆菌wlkysy-4的生物菌剂，对植物进行灌根或喷洒。10.如权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述生物菌剂稀释至其中的萎缩芽孢杆菌wlkysy-4有效活菌数为1.0
×
106～1.0
×
108cfu/ml后使用。

技术总结
本发明公开了一种萎缩芽孢杆菌WLKYSY-4、生物菌剂及其应用，该萎缩芽孢杆菌WLKYSY-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.26815。本申请提供的萎缩芽孢杆菌WLKYSY-4对多种植物病害无论是预防防治还是治疗防治都有较好的防治效果，在生物农药方面具有非常好的应用前景。在生物农药方面具有非常好的应用前景。在生物农药方面具有非常好的应用前景。


技术研发人员：李强 刘伟 何彩 胡芳 叶芳 陈岩辉 晋敏 金娜 张军 赵连鑫 牟德生 张勤德 段爱莉 郭艳兰 张涛 王鑫 李栋 杨作奎 韩登山 董存元 史星雲 姚元文 王曼 俞志琴 李长江
受保护的技术使用者：武威市林业科学研究院
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/6