一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法及其应用

1.本发明涉及饲料技术领域，尤其是涉及一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.纳米硒作为一种新型的硒形式，与传统的无机硒和有机硒相比，具有更高的生物活性和生物利用率；同时，其还具有纳米材料独特的纳米尺寸效应，可以显著提高硒的营养功效。在畜禽生产上，饲料中补充硒元素主要以亚硒酸钠(na2seo3)、硒代蛋氨酸为主，但是na2seo3毒性较高，而且生物利用率低，由于畜禽对硒的中毒范围较窄，因此往往容易造成因补充量不当而引起中毒。硒代蛋氨酸虽然较na2seo3安全，但其使用成本高，大规模使用会增加畜禽生产成本。纳米单质硒在没有分散模板的情况下，会发生团聚从而影响生物活性，因此，使用具有天然生物活性的褐藻寡糖(aos)作为制备纳米硒的模板分散剂，复合物不仅具有纳米硒的生物学作用，还具备了aos的相关生物活性。
3.肉鸡处于高温环境下，机体会产生热应激反应，热应激导致体内产生过多的氧化自由基(ros)，各种生理代谢活动因此受到严重影响，机体免疫机能、抗氧化机能、消化机能等生物学功能受到抑制，最终影响生产性能。热应激会显著降低肉鸡的法氏囊、脾脏等器官的免疫性能，影响机体整体的抗菌抗病毒能力。而在高温环境下，热应激肉鸡的消化吸收功能也会受到破坏。肠道机械屏障作为机体一种重要的物理屏障，既能阻挡大分子毒素透过肠黏膜进入机体，又能保证机体对营养物质的吸收和转化利用。目前已证实热应激能提高肉鸡肠道通透性：体现在血清二胺氧化酶(dao)活性和d-乳酸(d-la)水平的升高；降低肠道紧密连接蛋白的基因和蛋白表达水平。从而损伤肠道机械屏障功能，严重危害肉鸡健康和生产。
4.本发明通过制备一种新型的高效补硒添加剂：纳米硒-褐藻寡糖(senps-aos)，发现其可以有效地保护热应激诱导的肉鸡肠道机械屏障损伤，在肉鸡生产中具有极大的潜在应用价值。因此，研制senps-aos符合行业可持续发展的需求，应用前景广阔。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法及其应用，为缓解肉鸡热应激提供一种新型的优质硒产品。
6.根据本发明的一个目的，本发明提供一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
7.1)利用正交及单因素试验探索纳米硒-褐藻寡糖(senps-aos)最佳制备条件，确定褐藻寡糖浓度、反应时间、反应温度对复合物制备的影响；
8.2)通过扫描电镜(sem)、能谱扫描(eds)等设备表征senps-aos，纳米硒颗粒直径、se含量；
9.3)动物试验探究senps-aos对热应激肉鸡肠道通透性、回肠抗氧化性能指标、回肠
屏障功能相关因子基因及蛋白表达指标的影响；
10.4)综合评估senps-aos对热应激肉鸡肠道机械屏障功能的保护作用，即得。
11.进一步地，senps-aos溶液利用vc还原na2seo3，制备纳米硒。
12.进一步地，senps-aos的最佳制备条件为褐藻寡糖浓度400mg/l、反应时间0.5h、反应温度60℃。
13.进一步地，senps-aos的纳米硒颗粒粒径约为80nm，se元素含量约为8％。
14.进一步地，senps-aos能降低热应激肉鸡的肠道通透性，提高回肠组织抗氧化酶水平。
15.进一步地，senps-aos能提高热应激肉鸡回肠的相关紧密连接蛋白、硒蛋白、抗氧化酶的基因表达和蛋白表达水平。
16.根据本发明的另一个目的，本发明提供一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的应用，用于降低热应激肉鸡肠道通透性、提高回肠抗氧化酶、紧密连接蛋白、硒蛋白等屏障功能相关因子的基因和蛋白表达水平。
17.本发明技术方案确定了senps-aos的最佳制备条件，以及明确的纳米硒粒径大小和复合物的se含量；同时明确了senps-aos能有效保护热应激肉鸡的肠道机械屏障功能，为进一步开发新型高效的绿色纳米硒添加剂提供试验参考，对家禽行业通过营养途径解决热应激问题具有重要意义。
附图说明
18.图1是senps-aos的sem和eds表征结果图。
19.图2是回肠屏障功能相关基因的mrna表达水平图。
20.图3是回肠屏障功能相关蛋白表达水平图。
具体实施方式
21.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.在本发明的描述中，需要理解的是，术语"中心"、"纵向"、"横向"、"长度"、"宽度"、"厚度"、"上"、"下"、"前"、"后"、"左"、"右"、"竖直"、"水平"、"顶"、"底"、"内"、"外"、"顺时针"、"逆时针"等指示的方位或位置关系仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
23.此外，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本发明的描述中，"多个"的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。此外，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普
通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
24.实施例1
25.一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，包括如下步骤：
26.1)利用正交及单因素试验探索纳米硒-褐藻寡糖(senps-aos)最佳制备条件，为褐藻寡糖浓度400mg/l、反应时间0.5h、反应温度60℃；
27.2)通过扫描电镜(sem)、能谱扫描(eds)等设备表征senps-aos，纳米硒颗粒粒径约为80nm，se含量为8％；
28.3)动物试验结果表明senps-aos能降低热应激肉鸡血清二胺氧化酶(dao)活性和d-乳酸(d-la)水平；
29.4)动物试验结果表明senps-aos能提高热应激肉鸡回肠抗氧化酶、肠道紧密连接蛋白、硒蛋白基因和蛋白表达水平，即得。
30.实施例2
31.材料和方法
32.1.主要材料
33.抗坏血酸(vc)、亚硒酸钠(na2seo3)、褐藻寡糖(aos，青岛博智汇力生物科技有限公司)、纳米硒-褐藻寡糖(senps-aos)、aa肉鸡(湛江正大食品有限公司)、过氧化氢酶(cat)、总抗氧化能力(t-aoc)、总超氧化物歧化酶(t-sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、丙二醛(mda)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。d-乳酸(d-la)、二胺氧化酶(dao)试剂盒购自江苏酶免实业有限公司。4
×
gdnawipermix、5
×
hiscript ii qrt supermix ii等qpcr(real-time quantitative pcr)试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。loading buffer购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。磷酸酶抑制剂、bca法蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司，ripa裂解液、一抗稀释液购自碧云天生物技术有限公司，一抗和二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司。
34.2.主要仪器
35.主要试验仪器为hh.s11-2数显恒温水浴锅(joanlab)，s-4800形扫描电子显微镜sem、eds能谱仪(sem，日本株式会社日立高新技术那珂事业所)，alpha1-4 lsc basic christ真空冷冻干燥机(德国marin christ公司)，synergy htx型多功能酶标仪(biotek instruments,inc,美国)。hh.s11-2数显恒温水浴锅(joanlab)，alpha1-4 lsc basic christ真空冷冻干燥机(marin christ，德国)，3k15型台式高速冷冻离心机(sigma，德国)，pcr基因扩增仪(bio-gener)，实时荧光定量pcr仪(bio-rad，英国)，bg-power 600i型电泳仪(北京百晶生物技术有限公司)，ax-ii型暗匣(广东粤华医疗器械厂有限公司)。
36.实施例3
37.senps-aos的最佳制备条件探索及表征：
38.(1)利用vc还原na2seo3，通过正交试验，筛选出senps-aos优选组合。
39.(2)通过单因素试验，对显著因素进行单因素分析，从而筛选出最佳的制备因素水平。
40.(3)通过sem、eds表征senps-aos复合物，分析纳米硒颗粒粒径以及se元素含量。
41.结果如下表所示：
42.表1正交试验设计与结果
[0043][0044]
表2方差分析表-主体间效应检验
[0045]
源iii类平方和自由度均方f显著性修正模型3.457120.28830.6710.000截距203.3731203.37321650.6350.000a0.39340.09810.4570.000b0.49940.12513.2750.000c2.57840.64568.6220.000误差0.582620.009
ꢀꢀ
总计207.41375
ꢀꢀꢀ
修正后总计4.04074
ꢀꢀꢀ
[0046]
表3单因素统计量表
[0047]
褐藻寡糖浓度(mg/l)个案数平均值标准差平均值标准误差1005.0001.5060.2990.1342005.0001.6900.1480.0663005.0001.6640.3240.1454005.0001.7030.1130.051
5005.0001.6930.2650.118
[0048]
表4单因素统计量表
[0049]
反应时间(h)个案数平均值标准差平均值标准误差0.55.0001.7600.1180.05315.0001.7140.1540.06935.0001.6360.2400.10755.0001.5370.3180.14275.0001.6090.3140.140
[0050]
表5单因素统计量表
[0051]
反应时间(h)个案数平均值标准差平均值标准误差0.55.0001.7600.1180.05315.0001.7140.1540.06935.0001.6360.2400.10755.0001.5370.3180.14275.0001.6090.3140.140
[0052]
注：不同肩标字母表示差异显著，p《0.05。
[0053]
实施例4
[0054]
使用eilsa试剂盒对肉鸡血清dao和d-la水平进行检测，并对数据进行统计学分析。结果如下表所示：
[0055]
表6 senps-aos对热应激肉鸡反应肠道通透性的血清指标的影响
[0056]
注：不同肩标字母表示差异显著，p《0.05。
[0057]
实施例5
[0058]
使用抗氧化试剂盒对肉鸡回肠组织相关抗氧化指标进行检测，结果如下表所示：
[0059]
表7 senps-aos对热应激肉鸡回肠抗氧化指标的影响
[0060][0061]
注：不同肩标字母表示差异显著，p《0.05。
[0062]
实施例6
[0063]
通过实时荧光定量pcr技术(real-time quantitative pcr，qpcr)和免疫印迹法(western blot)检测回肠组织屏障功能相关抗氧化蛋白、紧密连接蛋白、硒蛋白等基因的mrna和蛋白表达水平，综合分析senps-aos对肉鸡热应激肠道机械屏障功能的保护作用。
[0064]
图1是senps-aos的sem和eds表征结果。其中图1a为sem结果，图1b为eds结果。
[0065]
图2是senps-aos对热应激肉鸡回肠屏障功能相关基因mrna表达水平的影响。不同上标字母表示组间差异显著，p《0.05；上标p值分别表示环境效应(p
t
)，senps-aos添加效应(p
se
)以及环境与senps-aos的互作效应(p
t
×
se
):p《0.05表示该因素具有显著效应，p《0.01表示该因素具有极显著效应。
[0066]
图3是senps-aos对热应激肉鸡回肠屏障功能相关蛋白表达水平的影响。不同上标字母表示组间差异显著，p《0.05；上标p值分别表示环境效应(p
t
)，senps-aos添加效应(p
se
)以及环境与senps-aos的互作效应(p
t
×
se
):p《0.05表示该因素具有显著效应，p《0.01表示该因素具有极显著效应。
[0067]
结果表明，通过一系列试验获得了senps-aos制备的最佳条件，确定了制备senps-aos所需的褐藻寡糖浓度、反应时间、反应温度，并明确了senps-aos可以保护热应激肉鸡的肠道机械屏障功能。通过发明这个绿色高效的纳米硒复合物添加剂，对通过营养途径缓解热应激肉鸡肠道机械屏障功能的研究及新型纳米抗热应激添加剂产品的开发具有重要意义。
[0068]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)利用正交及单因素试验探索纳米硒-褐藻寡糖senps-aos最佳制备条件，确定褐藻寡糖浓度、反应时间、反应温度对复合物制备的影响；2)通过扫描电镜sem、能谱扫描eds设备表征senps-aos，纳米硒颗粒直径、se含量；3)动物试验探究senps-aos对热应激肉鸡肠道通透性、回肠抗氧化性能指标、回肠屏障功能相关因子基因及蛋白表达指标的影响；4)综合评估senps-aos对热应激肉鸡肠道机械屏障功能的保护作用，即得。2.根据权利要求1所述的一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，其特征在于，senps-aos溶液利用vc还原na2seo3，制备纳米硒。3.根据权利要求1所述的一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，其特征在于，senps-aos的最佳制备条件为褐藻寡糖浓度400mg/l、反应时间0.5h、反应温度60℃。4.根据权利要求1所述的一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，其特征在于，senps-aos的纳米硒颗粒粒径为80nm，se元素含量为8％。5.根据权利要求1所述的一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，其特征在于，senps-aos能降低热应激肉鸡的肠道通透性，提高回肠组织抗氧化酶活性。6.根据权利要求1所述的一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法，其特征在于，senps-aos能提高热应激肉鸡回肠的相关紧密连接蛋白、硒蛋白、抗氧化酶的基因表达和蛋白表达水平。7.根据权利要求1-6任一所述的一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法制备的纳米硒-褐藻寡糖复合物的应用，其特征在于，用于降低热应激肉鸡肠道通透性，提高回肠抗氧化酶活性、紧密连接蛋白、硒蛋白、抗氧化酶相关因子的基因和蛋白表达水平。

技术总结
本发明提供了一种纳米硒-褐藻寡糖复合物的制备方法及其应用，包括如下步骤：利用正交及单因素试验探索纳米硒-褐藻寡糖(SeNPs-AOS)最佳制备条件，确定褐藻寡糖浓度、反应时间、反应温度对复合物制备的影响；通过扫描电镜、能谱扫描等设备表征SeNPs-AOS，纳米硒颗粒直径、Se含量；动物试验探究SeNPs-AOS对热应激肉鸡肠道通透性、回肠抗氧化性能指标、相关因子基因及蛋白表达指标的影响；综合评估SeNPs-AOS对热应激肉鸡肠道机械屏障功能的保护作用，即得。本发明确定了SeNPs-AOS的最佳制备条件，以及明确的纳米硒粒径大小和复合物的Se含量；同时明确了SeNPs-AOS能有效保护热应激肉鸡的肠道机械屏障功能，对家禽行业通过营养途径解决热应激问题具有重要意义。径解决热应激问题具有重要意义。径解决热应激问题具有重要意义。


技术研发人员：刘文超 邱盛坚 李晓斌 赵越 杨玉莹 黄孟祎 夏晨明
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/6