一种双功能水凝胶及其制备方法与应用

1.本发明涉及一种水凝胶材料，特别涉及一种调节氧化应激并促进神经再生的双功能水凝胶及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。


背景技术：

2.脊髓损伤(spinal cord injury，sci)是一种严重的中枢神经系统疾病，往往会对损伤部位以下的机体造成严重的功能损伤。目前，sci后的再生修复仍然是一个世界性的医学难题。这主要是因为sci后会产生一系列不利于再生修复的因素。其中，过量活性氧(reactive oxygen species，ros)诱导的氧化应激(oxidative stress，os)微环境和抑制神经再生的微环境严重阻碍了sci后的再生修复。
3.抗氧化类药物是调节损伤后os微环境的传统手段。例如，脂质过氧化抑制剂甲强龙。作为美国食品药品监督管理局(food and drug administration，fda)批准的药物，其可以有效抑制炎症因子的活化和产生，减少自由基的释放和脂质过氧化，减少细胞内ca
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的积累，抑制免疫反应，从而保护受损的神经元及轴突，减轻继发性损伤。然而已有研究表明，长期大剂量的使用甲强龙这样的激素类药物可能会引起严重的副反应，增加不良事件发生的概率，甚至引发继发性的病理损伤，影响神经功能的恢复。
4.而水凝胶作为一类亲水性的内部具有三维网状结构的材料，往往具有良好的生物相容性和生物降解性。同时我们还可以通过调整水凝胶的化学组成、交联度和孔隙率使其具有仿生的机械性能，溶胀性能和物质扩散性能，从而更好的模拟天然组织的结构以促进细胞的黏附与生长。所以，制备ros清除水凝胶用于损伤部位，以清除损伤后过量的ros，改善损伤后的os微环境，从而促进损伤后功能的恢复是一种值得考虑的方法。
5.例如，wen shi等人以苯硼酸改性透明质酸(ha-pba)与聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，pva)之间的苯硼酸酯动态共价键为基础，制备了一种可注射的自愈合的水凝胶，其具有良好的ros清除性能，可以保护神经祖细胞免受ros诱导的损伤(shi，w.；hass b.；kuss，m.a.；zhang，h.p.，et al.fabrication of versatile dynamic hyaluronic acid-based hydrogels.carbohydrate polymers2020，233.)。
6.缺乏神经营养因子来保护原有神经元，刺激内在的神经元再生是在sci后产生抑制神经再生的微环境的一个重要因素。
7.所以，将ros清除水凝胶与神经营养因子相结合，制备一种可以调节os微环境并有效促进神经再生的双网络水凝胶以促进脊髓损伤后的再生修复是一种值得考虑的方法。


技术实现要素：

8.本发明的主要目的在于提供一种调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
9.本发明的另一目的还在于提供所述双功能水凝胶的应用。
10.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
11.本发明实施例提供了一种双功能水凝胶的制备方法，其包括：
12.使苯硼酸基团修饰于高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团的高分子材料；
13.使马来酰亚胺基团修饰于所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料；
14.使包含所述修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇和能够促进神经再生的因子的混合反应体系进行加成反应和酯化反应，制得调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶。
15.在一些实施例中，所述高分子材料包括明胶、胶原、壳聚糖中的任意一种或两种以上的组合。
16.在一些实施例中，所述能够促进神经再生的因子包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，bdnf)、神经生长因子-3、胶质细胞源性神经营养因子中的任意一种或两种以上的组合。
17.本发明实施例还提供了由前述制备方法制得的双功能水凝胶，具有调节os微环境并促进神经再生的双重功能。
18.本发明实施例还提供了前述的双功能水凝胶在制备用于修复脊髓损伤、脑损伤或外周神经损伤的药物中的应用。
19.相应的，本发明实施例还提供了一种促进神经再生的药物，其包含前述的双功能水凝胶，所述药物具有修复脊髓损伤、脑损伤或外周神经损伤等功能。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
21.本发明提供的制备方法中，修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料在生理ph下通过和单独的聚乙烯醇的酯化反应引入了苯硼酸酯基团，并通过和巯基的加成反应进一步接枝了bdnf。前者赋予了水凝胶良好的ros清除性能，而无需额外引入小分子抗氧化剂。后者不仅提高了仅基于苯硼酸酯键交联的ros清除水凝胶促进内源神经再生的性能，同时也进一步提高了水凝胶的屈服应力。成胶反应在生理ph下进行，避免了高ph值对水凝胶的不利影响。此外，整个过程中均采用纯水或以纯水配置的缓冲溶液为溶剂，无需额外引入二甲基亚砜或n，n-二甲基酰胺等有机物质。
22.综上，本发明合成了一种可以调节os微环境并能促进神经再生的双功能水凝胶，其相较于仅基于苯硼酸酯键交联的水凝胶，具有更高的屈服应力和更好的促进神经再生的性能，并且制备过程安全简便。
附图说明
23.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1是本发明一典型实施例中调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶的制备流程示意图；
25.图2是本发明实施例1中gl、mgl-1、mgl-2、mgl-3的1hnmr图；
26.图3是本发明实施例1中mgl-2、mgl-pba-1、mgl-pba-2、mgl-pba-3、mgl-pba-4、
mgl-pba-5的1hnmr图；
27.图4是本发明实施例1中35gpp、60gpp、85gpp水凝胶的时间扫描图像；
28.图5是本发明实施例1中35gpp、60gpp、85gpp水凝胶的频率扫描图像；
29.图6a、图6b、图6c分别是本发明实施例1中35gpp、60gpp、85gpp水凝胶的应力应变曲线图；
30.图7是本发明实施例1中35gpp、60gpp、85gpp水凝胶培养神经干细胞48小时后的活/死染色图；
31.图8是本发明实施例1中35gpp、60gpp、85gpp水凝胶培养神经干细胞48小时后的cck-8检测结果图；
32.图9是本发明实施例1中mgl-pba和mgl-pba-ma的1hnmr图；
33.图10是本发明实施例1中60gpmbp水凝胶的时间扫描图像；
34.图11是本发明实施例1中60gpmbp水凝胶的频率扫描图像；
35.图12是本发明实施例1中60gpmbp水凝胶的应力应变曲线图；
36.图13是本发明实施例1中sci组、gp组、60gpp组、60gpmbp组的巢蛋白(nestin，nes)/iii类β微管蛋白(beta iii tubulin antibody，tuj-1)/胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，gfap)/4
′
，6-二脒基-2-苯基吲哚(4
′
，6-diamidino-2-phenylindole，dapi)免疫荧光染色图；
37.图14是本发明实施例1中sci组、gp组、60gpp组、60gpmbp组的sod含量检测图。
具体实施方式
38.鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得出本发明的主要技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
39.如下对涉及到的术语进行解释：
40.活性氧：活性氧(reactive oxygen species，ros)是指细胞代谢产生的一系列含氧的活性分子，包括超氧自由基阴离子(o2·-)、过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(oh)以及含氮氧化物等。
41.氧化应激：氧化应激(oxidative stress，os)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化状态。
42.本领域研发人员通常是以明胶和pva来合成水凝胶，这使得水凝胶具有良好的生物相容性。同时本领域研发人员还可对明胶修饰苯硼酸基团，使其与pva可以通过苯硼酸的酯化反应直接形成基于苯硼酸酯键交联的ros清除水凝胶，而无需额外引入具有ros清除性能的小分子抗氧化剂，这使得体系更为简单。然而在生理ph下制备的仅基于苯硼酸酯键交联的ros清除水凝胶屈服应力较低，且对于损伤后的神经再生功能有限，所以本案发明人对修饰有苯硼酸基团的高分子材料进一步修饰了马来酰亚胺基团，并在生理ph下引发加成反应进一步接枝了bdnf。这进一步促进了内源神经的再生，同时提高了仅基于苯硼酸酯键交联的ros清除水凝胶的屈服应力，而且避免了高ph值对水凝胶的不利影响。
43.本发明实施例的一个方面提供的一种调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶的制备方法包括：
44.使苯硼酸基团修饰于高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团的高分子材料；
45.使马来酰亚胺基团修饰于所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料；
46.使包含所述修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇和能够促进神经再生的因子的混合反应体系在生理ph值下进行加成反应和酯化反应，制得调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶。
47.在一些实施方案中，所述加成反应和酯化反应的温度为25℃～40℃，时间为20分钟～40分钟。
48.在一些实施方案中，所述高分子材料可以是明胶(gelatin，gl)，也可以考虑将明胶换成其它的高分子材料，如胶原、壳聚糖等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
49.在一些实施方案中，所述能够促进神经再生的因子可以是bdnf，还可以将bdnf换成其他的一种或多种有助于神经再生的因子，如神经生长因子-3、胶质细胞源性神经营养因子等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此，以促进损伤后受损的神经系统再生修复。此外，该水凝胶体系也可用于脑损伤和外周神经损伤修复。
50.在一些更具体的实施方案中，所述制备方法包括：
51.使高分子材料、甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸甲酯反应，生成具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料；
52.使所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料与3-氨甲基苯硼酸反应，制得修饰有苯硼酸基团的高分子材料。
53.上述过程中均采用纯水为溶剂。
54.在一些实施方案中，所述高分子材料与甲基丙烯酸酐的质量比为0.906∶1～2.415∶1，或者，所述高分子材料与甲基丙烯酸甲酯的质量比为1.40∶1～3.72∶1。
55.进一步地，所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料的甲基丙烯酸酐基团接枝率为78.21％～94.98％。
56.在一些实施方案中，所述制备方法包括：将具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料完全溶解后，调节溶液的ph值至6～7，然后加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐完全溶解，25分钟～60分钟之后加入3-氨甲基苯硼酸。
57.进一步地，所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料与3-氨甲基苯硼酸的摩尔比为1.2∶1～3.85∶1。
58.进一步地，所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料的苯硼酸基团接枝率为11.4％～45.8％。本发明对高分子材料修饰了苯硼酸基团，使其后续可以直接与pva通过苯硼酸的酯化反应合成具有ros清除性能的水凝胶，而无需额外引入具有ros清除性能的交联剂。
59.在一些更具体的实施方案中，所述制备方法包括：使修饰有苯硼酸基团的高分子材料与n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐反应，从而使马来酰亚胺基团修饰于所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料上，获得修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料，该过程中采用以纯水配置的缓冲溶液为溶剂。
60.本发明使所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料，进一步修饰马来酰亚胺基团，通过生理ph下引发的巯基的加成反应来进一步修饰含有巯基的因子或药物。
61.进一步地，所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料与n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐的质量比为3∶1～4∶1。
62.在一些实施方案中，所述修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇与能够促进神经再生的因子的质量比约为21∶21∶1～56∶56∶1，无需额外引入其余含有多元羟基的物质。
63.在一些实施方案中，所述加成反应的温度为25℃～40℃，时间为20分钟～40分钟。本发明不仅可通过加成反应进一步引入bdnf来进一步促进内源神经再生，而且还通过加成反应进一步改善仅基于苯硼酸酯键交联的水凝胶的力学性能。
64.本发明实施例的另一个方面还提供了由前述制备方法制得的双功能水凝胶，其具有协同调节sci后os微环境并促进神经再生的双重功能。
65.进一步地，所述双功能水凝胶的屈服应力约为1pa～40pa，约为60gpp水凝胶的1.3倍～31倍。
66.进一步地，在成胶过程中，所述修饰有甲基丙烯酸酐基团、苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇溶解于ph为7.4的pbs溶液中，水凝胶在生理ph值下形成。
67.进一步地，所述双功能水凝胶的整体成胶时间为20分钟～40分钟。
68.本发明实施例的另一个方面还提供了前述调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶在制备用于修复sci、脑损伤或外周神经损伤等的药物中的应用。该水凝胶体系不仅可以调节sci后的os微环境，修复脊髓损伤，也可用于脑损伤和外周神经损伤修复。
69.进一步地，本发明实施例的另一个方面还提供了一种促进神经再生的药物，其包含前述调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶，所述药物具有修复sci、脑损伤或外周神经损伤等功能。
70.综上所述，本发明合成了一种可以在sci后调节os微环境并有效促进神经再生的双功能水凝胶，其相较于仅基于苯硼酸酯键交联的水凝胶，具有更高的屈服应力和更好的促进神经再生的性能，并且无需引入小分子抗氧化剂、有机溶剂和高ph，只需要将修饰了苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的明胶、pva、bdnf混合，使其通过酯化反应赋予水胶ros清除性能，同时通过加成反应负载bdnf，进一步提高水凝胶的屈服应力，并赋予其有效促进内源神经干细胞再生的性能，使得水凝胶的制备过程简单安全。
71.下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
72.实施例1
73.本实施例主要是通过苯硼酸的酯化反应形成ros清除水凝胶，并通过加成反应连接bdnf，进一步提高了水凝胶促进sci后神经再生的性能与屈服应力，从而制备了一种可以调控sci后的os微环境并能有效促进神经再生的双功能水凝胶。具体的实验方案如下：
74.本案发明人首先通过调整甲基丙烯酸酐的用量，合成了具有不同甲基丙烯酸酐接
枝率的明胶。所述高分子材料与甲基丙烯酸酐的质量比为0.906∶1～2.415∶1。如图2所示，核磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance，1hnmr)中在5.70ppm和5.46ppm的化学相对位移处的峰来自甲基丙烯酸酐基团中c＝c上的氢，结合0.97ppm的化学位移处的峰，计算出改性明胶的甲基丙烯酸酐接枝率分别为78.21％、87.25％、94.98％，依次记为mgl-1、mgl-2、mgl-3。考虑到后续仍然要对明胶进行一系列的修饰改性，为了避免过大的空间位阻，本案发明人选择了具有中等甲基丙烯酸酐接枝率的mgl-2进行了后续研究。本案发明人通过调整4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和3-氨甲基苯硼酸的用量，对mgl-2进一步修饰了不同含量的苯硼酸基团，所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料与3-氨甲基苯硼酸的摩尔比为1.2∶1～3.85∶1。如图3所示，1hnmr在7.69ppm的化学位移处出现属于硼酸基团的峰，结合2.04ppm处-ch2的峰，经过计算，修饰后的明胶分子中苯硼酸基团的接枝率分别为11.4％、17.6％、19.8％、24.4％、45.8％，依次记为mgl-pba-1、mgl-pba-2、mgl-pba-3、mgl-pba-4、mgl-pba-5。
75.为了使水凝胶具有良好的ros清除性能，本案发明人采用了等体积的3.5wt％、6wt％及8.5wt％的mgl-pba-5溶液和pva溶液合成了仅基于苯硼酸酯键交联的ros清除水凝胶(作为对比例)。本案发明人还对该水凝胶进行了流变学实验，进行了时间扫描，图4表明，在1％的恒定应变下，35gpp、60gpp、85gpp的g’分别为13.5pa、11.2pa、9.9pa，水凝胶的模量几乎不随时间变化，且g’一直大于g”，说明水凝胶的结构随时间变化较为稳定。在0.5％的恒定应变下进行了频率扫描，图5表明，在1hz～10hz的频率范围内，三种水凝胶的模量随着频率的增加而增加，g’分别从15.58pa增加至1643pa，从16.6pa增加至1606pa，从15.71pa增加至1568pa，说明水凝胶均具有良好的弹性，表现出弛豫现象。在1hz的恒定频率下，测定了在1％至500％的应变范围内模量的变化。图6a-图6c表明，三种水凝胶的屈服应力分别为0.98pa、1.06pa、1.29pa，并无较大差别。
76.本案发明人还采用新生大鼠(昭衍(苏州)有限公司提供)中提取的原代的脑源神经干细胞进行了水凝胶的体外细胞毒性实验，共分为pbs组、35gpp组、60gpp组、85gpp组(每组n＝3)。简单来说，向多聚赖氨酸包被过的96孔板的每个孔内分别加入20μl的1
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pbs溶液、35gpp水凝胶、60gpp水凝胶、85gpp水凝胶，再加入10000个神经干细胞。在细胞培养箱内培养两天后，分别进行了细胞活/死染色和cck-8实验。图7为35gpp、60gpp、85gpp水凝胶培养神经干细胞48小时后的活/死染色图，定性表明了采用35gpp、60gpp或85gpp水凝胶培养神经干细胞两天后绝大多数细胞仍保持存活状态，死细胞相对较少。图8为35gpp、60gpp、85gpp水凝胶培养神经干细胞48小时后的cck-8检测结果图，定量表明了相较于pbs组，采用35gpp、60gpp或85gpp水凝胶培养神经干细胞两天后，分别仍有87.01％、71.86％、65.37％的活细胞。这说明三种水凝胶均具有良好的生物相容性。综合考虑力学性能和生物相容性后，为了充分引入马来酰亚胺基团以接枝bdnf，本案发明人选择了60gpp水凝胶进行了进一步的研究。考虑到单独的水凝胶促进损伤后神经再生的功能有限，所以为了使水凝胶更好的促进sci后的神经再生，本案发明人使mgl-pba-5通过酰胺化反应进一步修饰了马来酰亚胺基团，并通过甲基丙烯酸酐基团和马来酰亚胺基团的加成反应进一步负载了bdnf。所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料与n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐的质量比为3.3∶1。如图9所示为mgl-pba和mgl-pba-ma的1hnmr图，1hnmr中6.72ppm的化学位移处新增的峰来自ma基团中c＝c上的氢。采用6wt％的mgl-pba-ma溶液、2mg/ml的bdnf溶液、6wt％的pva溶液
通过酯化反应和加成反应合成了60gpmbp水凝胶。所述修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇与能够促进神经再生的因子的质量比为38∶38∶1。在1％的应变下进行时间扫描，图10表明60gpmbp水凝胶的g’在110pa上下浮动，变化幅度较小，g’一直大于g”，这说明在37℃下，随着时间的变化，水凝胶具有一定的结构稳定性。在0.5％的恒定应变下，对水凝胶进行频率扫描，结果如图11所示，在1hz～10hz的频率范围内，60gpmbp水凝胶的g’从143.7pa增加至1922pa。体现了水凝胶良好的弹性。在1hz的恒定频率下，在1％到500％的应变范围内对水凝胶进行应变扫描，图12表明，60gpmbp水凝胶的屈服应力约为19.41pa，约为60gpp水凝胶的18.3倍，这说明60gpmbp水凝胶可以更好地抵抗外界应力对于结构的破坏，具有良好的结构稳定性。总的来说，流变学实验表明，相较于60gpp水凝胶，60gpmbp水凝胶具有更高的屈服应力，可以更好的抵抗外界应力对于结构的破坏。
77.进一步地，本案发明人采用7周龄的雌性sprague dawley大鼠，体重200～240g(昭衍(苏州)有限公司提供)，构建了t8节段处2mm全横断的脊髓损伤模型，分为sci组(作为对比例)、gp水凝胶组(作为对比例)、60gpp水凝胶组(作为对比例)、60gpmbp水凝胶组(作为实验例)(sci组n＝8、gp水凝胶组n＝7、60gpp水凝胶组n＝7、60gpmbp水凝胶组n＝6)。造模前大鼠适应性饲养1周，期间提供充足的食物和水，动物房室温25℃，并在造模前1天对实验大鼠进行断食处理。具体造模过程如下，用异氟烷麻醉大鼠后，向大鼠腹腔注射10wt％的水合氯醛溶液(5μl/g)。然后将大鼠俯卧式固定于手术台上，对背部常规备皮，消毒铺巾，并在无菌操作下以t8棘突为中心在背部正中做一个长约1～1.5cm的纵向切口，然后逐层分离皮下的筋膜、肌肉，再紧贴棘突和椎板骨膜分离t7～t9节段的竖脊肌，暴露t7到t9节段的脊椎棘突和椎板。小心的咬除棘突和椎板，并打开椎管，使硬脊膜充分暴露。然后用剪刀在中间剪开硬脊膜和蛛网膜，切除t8节段对应的脊髓2mm，并在切除后抬起断端以确定脊髓完全横断。然后用明胶海绵止血，生理盐水冲洗，再缝合切口两侧肌肉，并逐层缝合筋膜与皮肤，此即sci组。剩余的水凝胶组，则是在止血冲洗后在缺损部位填充了40μl相应的水凝胶。其中值得注意的是，gp水凝胶组是在缺损部位注入了40μl的6wt％的pva与mgl-pba-5的混合溶液，然后再用蓝光照射3分钟成胶。造模完成后将实验大鼠放入室温25℃的动物房内，提供充足的食物和水。每天对实验大鼠进行人工排尿2次，并且在排尿后对于膀胱感染的大鼠，腹腔注射青霉素钠(0.25万u/kg)。在术后第7天，用异氟烷麻醉实验大鼠，再次腹腔注射10wt％的水合氯醛溶液(5μl/g)，然后将大鼠仰卧式固定于手术台上，打开胸腔，暴露心脏，将穿刺针从左心室插入主动脉，并用止血钳固定针头。然后剪开右心耳，先灌入300ml pbs溶液，直至冲出液体透明清亮，然后再灌入300ml的4wt％的多聚甲醛溶液，直至大鼠下肢僵硬，然后以损伤部位为中心取出长约1cm的脊髓组织。用4wt％的多聚甲醛对取出的组织进行固定，然后依次用20％、30％的蔗糖溶液进行梯度脱水，再用oct(optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋，然后用冰冻切片机制备了25μm厚的冷冻切片用于nes/tuj-1/gfap/dapi免疫荧光染色。图13表明，相较于60gpp组，60gpmbp水凝胶更为有效的促进了损伤部位内源性神经干细胞和神经元的再生。这表明bdnf的引入增强了水凝胶促进神经再生的性能。在术后第7天，部分实验大鼠用异氟烷麻醉后，再次腹腔注射10wt％的水合氯醛溶液(5μl/g)。然后将大鼠俯卧式固定于手术台上，于原切口处取出以缺损部位为中心的长约1cm的脊髓组织。用纸巾擦去组织表面的残血，液氮速冻，然后置于-80℃冻存。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)的含量往往与机体os的程度呈负相关。基于
超氧阴离子自由基能够氧化试剂盒内的无色底物生成黄色产物，而sod可以清除超氧阴离子自由基从而抑制上述反应，降低产物的吸光度，使得产物的吸光度与sod的浓度呈负相关的原理。本案发明人对活体取出的脊髓组织进行了sod含量检测。图14表明，60gpp水凝胶和60gpmbp水凝胶组，均可以有效调节sci后的os微环境，从而增加体内sod的含量。而gp水凝胶组，相较于sci组，sod含量降低，吸光度增加。这可能是因为长时间的蓝光照射诱导了损伤部位ros含量增加，从而消耗了更多的sod。总的来说，60gpmbp水凝胶是一种具有优良的结构稳定性，可以在sci后有效调节os微环境并促进神经再生的双功能水凝胶。
78.另外，本案发明人还采用本说明书列举的其它原料及工艺条件，并参考实施例1的方式制取了一系列的双功能水凝胶。经测试发现，这些双功能水凝胶也具有本说明书述及的各项优异性能。
79.综合分析以上结果，可以看到，本发明通过对修饰有苯硼酸基团的高分子材料修饰了马来酰亚胺基团，并在生理ph下通过加成反应进一步接枝了bdnf，不仅提高了仅基于苯硼酸酯键交联的ros清除水凝胶促进内源神经再生的性能，同时也提高了其屈服应力。其相较于仅基于苯硼酸酯键交联的水凝胶，可以更好地抵抗外界剪切应力对于结构的破坏，同时更好的促进神经再生，并且无需小分子抗氧化剂、有机溶剂、高ph值。这使得制备过程更为安全简便，体系更为简单清晰。
80.应当理解，上述实施例仅为说明本技术的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本技术的内容并据以实施，并不能以此限制本技术的保护范围，例如，前述紫杉醇亦可替代为其它化学药物。凡根据本技术精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种双功能水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：使苯硼酸基团修饰于高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团的高分子材料；使马来酰亚胺基团修饰于所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料；使包含所述修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇和能够促进神经再生的因子的混合反应体系进行加成反应和酯化反应，制得调节氧化应激并促进神经再生的双功能水凝胶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述高分子材料包括明胶、胶原、壳聚糖中的任意一种或两种以上的组合；和/或，所述能够促进神经再生的因子包括脑源性神经营养因子、神经生长因子-3、胶质细胞源性神经营养因子中的任意一种或两种以上的组合。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：使高分子材料、甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸甲酯反应，生成具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料；使所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料与3-氨甲基苯硼酸反应，制得修饰有苯硼酸基团的高分子材料。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述高分子材料与甲基丙烯酸酐的质量比为0.906∶1～2.415∶1，或者，所述高分子材料与甲基丙烯酸甲酯的质量比为1.40∶1～3.72∶1；和/或，所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料的甲基丙烯酸酐基团接枝率为78.21％～94.98％；和/或，所述制备方法包括：将具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料用水完全溶解后，调节溶液的ph值至6～7，加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，25分钟～60分钟之后加入3-氨甲基苯硼酸；优选的，所述具有甲基丙烯酸酐基团的高分子材料与3-氨甲基苯硼酸的摩尔比为1.2∶1～3.85∶1；和/或，所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料的苯硼酸基团接枝率为11.4％～45.8％。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：使修饰有苯硼酸基团的高分子材料与n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐反应，从而使马来酰亚胺基团修饰于所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料上，获得修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料；优选的，所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料与n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐的质量比为3∶1～4：1。6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料、聚乙烯醇与能够促进神经再生的因子的质量比为21∶21∶1～56∶56∶1；和/或，所述加成反应和酯化反应的温度为25℃～40℃，时间为20分钟～40分钟。7.由权利要求1-6中任一项所述制备方法制得的双功能水凝胶，具有调节氧化应激微环境并促进神经再生的双重功能。8.根据权利要求7中所述的双功能水凝胶，其特征在于：所述双功能水凝胶的整体成胶时间为20分钟～40分钟；和/或，所述双功能水凝胶的屈服应力为1pa～40pa。9.权利要求7-8中任一项所述双功能水凝胶在制备用于修复脊髓损伤、脑损伤或外周
神经损伤的药物中的应用。10.一种促进神经再生的药物，其特征在于包含权利要求7-8中任一项所述双功能水凝胶，所述药物具有修复脊髓损伤、脑损伤或外周神经损伤的功能。

技术总结
本发明公开了一种双功能水凝胶及其制备方法与应用。所述制备方法包括：使苯硼酸基团修饰于高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团的高分子材料；使马来酰亚胺基团修饰于所述修饰有苯硼酸基团的高分子材料上，形成修饰有苯硼酸基团和马来酰亚胺基团的高分子材料；使其与聚乙烯醇和能够促进神经再生的因子在生理pH下进行酯化反应和加成反应，制得调节氧化应激并促进神经再生的双功能水凝胶。本发明的制备方法不仅提高了仅基于苯硼酸酯键交联的ROS清除水凝胶促进内源神经的再生的能力，同时也进一步提高了水凝胶的屈服应力，所合成的双功能水凝胶相较于仅基于苯硼酸酯键交联的水凝胶，具有更好的促进神经再生的性能和更高的屈服应力。应力。应力。


技术研发人员：沈贺 王慧茹 戴建武 庄燕
受保护的技术使用者：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/6