一种纳米铝佐剂生物安全性的评估方法

1.本发明涉及纳米铝佐剂生物安全性的评估方法，具体说是纳米羟基氧化铝佐剂及由其引发的神经毒性的评估方法。


背景技术：

2.佐剂作为添加在疫苗中的重要组成部分，常被用来增强抗原的免疫反应，通俗意义来说佐剂可以帮助疫苗更好的发挥作用。铝盐佐剂的发展已有近百年的历史，是最早被批准用于人预防性疫苗的佐剂，包括羟基氧化铝、磷酸铝佐剂等，而这些铝盐佐剂可能导致多种毒副反应，统称为佐剂诱导的自身免疫性/炎性综合征。大量临床学和流行病学实验数据证实铝毒性效应最敏感的靶点是中枢神经系统，通常表现在学习能力、记忆力、注意力和语言能力缺陷，运动控制能力受损和其他行为改变等。因此有必要对铝盐佐剂的神经毒性进行更严谨的评价与控制，例如确定导致脑易位的因素进而设计出难以转运至中枢神经系统的铝盐佐剂，或是确定引起毒性的究竟是铝离子的金属毒性还是由纳米颗粒引起的颗粒毒性进而对铝盐佐剂进行设计等等。总结来说，除最简单的对铝盐佐剂进行用量管理之外，建立能准确评估铝盐佐剂神经毒性的方法，在铝盐疫苗佐剂的安全应用领域具有极其重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种通过简单的实验操作进而系统全面地评价由铝盐佐剂所引发的生物安全性的评估方法。该方法是基于体外细胞模型，利用中枢神经系统内细胞对于无机材料刺激的响应，通过细胞生长状态的变化情况反映出材料的神经毒性，并通过改变无机材料浓度与材料刺激时间等因素，精准反映纳米铝佐剂对于中枢神经系统内细胞可能造成的毒性，并最终反映出其生物安全性。本发明方法操作简便，可重复性好，结果可信度高，在疫苗佐剂的生产与安全应用中具有良好的前景。
4.本发明的方法包括以下步骤：
5.一种纳米铝佐剂生物安全性的评估方法，包括以下步骤：
6.1)将纳米铝佐剂分散于去离子水中形成均匀的白色悬浊液；
7.2)用细胞培养基对上述悬浊液进行稀释，并在其中培养神经系统细胞；
8.3)对培养后的细胞进行不同种类毒性测试，测试包括细胞活力(mts)测试、线粒体活性氧测试、细胞凋亡检测等。
9.4)若无细胞相对活力显著下降，无显著线粒体活性氧产生，无显著细胞凋亡现象发生，则证明纳米铝佐剂无神经毒性，即纳米铝佐剂生物安全性良好。
10.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述纳米铝佐剂分散于去离子水的过程是在室温下超声波分散的。
11.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的纳米铝佐剂包括羟基氧化铝、磷酸铝纳米材料中的一种或两种。
12.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的纳米铝佐剂包括自行合成的纳米铝佐剂、商业化铝佐剂中的一种或两种。
13.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，所述自行合成的羟基氧化铝的制备方法，包括如下步骤：
14.①
将无机铝盐完全溶解于去离子水形成透明澄清的铝盐溶液(即：前驱物溶液)；
15.②
向上述铝盐溶液中均匀滴加碱性溶液，发生均匀沉淀并持续搅拌得到混合液；
16.③
对上述混合液进行水热反应；
17.④
收集到产物并对其进行冷却、离心、洗涤、干燥操作，得到白色粉末固体。
18.对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤
①
所述的前驱物材料(无机铝盐)主要是但不限于九水合硝酸铝al(no3)3·
9h2o，可以采用如六水合氯化铝alcl3·
6h2o、硫酸铝al2(so4)3等常用无机铝盐的一种或其混合物；铝盐溶液浓度为0.1-0.3m。
19.对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤
①
所述无机铝盐完全溶解于去离子水形成透明澄清的铝盐溶液是在室温下进行搅拌溶解的。
20.对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤
②
所述的碱性溶液包括氨水、乙二胺的一种或其混合物；所述的碱性物质与铝盐的摩尔比为(0.8-2)：1。
21.对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤
③
所述的水热反应温度为160-220℃，水热处理时间为2-24h；通过调控反应中的温度和时间等因素，可得到结晶度不同的最终产物。实施例中将所述混合液转移至以聚四氟乙烯ptfe材料为内胆的高压水热釜中完成水热反应。
22.对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤
④
所述的冷却为将水热产物混合液空冷降温至室温即可；所述的离心转速优选为6000-10000rpm，离心时间优选为10-30min；所述的洗涤目的是除去所含杂质，实施例中洗涤过程具体采用去离子水水洗3-5次；所述的产物干燥温度为40-80℃，最优选60℃进行恒温干燥得到白色固体粉末。
23.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的商业化佐剂包括但不限于商业化羟基氧化铝佐剂、商业化磷酸铝佐剂等。
24.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤1)所述的悬浊液的浓度为3-10mg/ml之间。
25.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的神经系统细胞包括小鼠小胶质细胞、小鼠脑微血管内皮细胞、小鼠海马神经元细胞中的一种或多种，所使用的细胞培养基为dmem培养基，不同类别细胞所需培养基成分有所差别，小鼠小胶质细胞、小鼠脑微血管内皮细胞采用dmem(++-)，小鼠海马神经元细胞采用dmem(+++)，二者区别在于是否含有丙酮酸钠。
26.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)用细胞培养基对上述悬浊液进行稀释，稀释后al浓度范围在10-120μg/ml之间，用于培养神经系统细胞。
27.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的细胞培养条件为37℃，5％co2，培养时间为4-24h。
28.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的细胞凋亡采用流式细胞术测试，包括annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测。
29.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，本发明采用无机铝盐溶液对神经系统细胞进行处理，作为纳米铝佐剂的对照；具体步骤为：先将无机铝盐溶解于去离子水中形成无机铝盐溶液，再进行后续的步骤。
30.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，所述的无机铝盐主要是但不限于六水合氯化铝alcl3·
6h2o，可以采用如九水合硝酸铝al(no3)3·
9h2o、硫酸铝al2(so4)3等常用无机铝盐的一种或其混合物。
31.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，所述的无机铝盐溶液的浓度为3-10mg/ml，与上述步骤1)纳米铝佐剂配置的悬浊液中的铝浓度保持一致的情况下对应的溶液浓度。
32.对于上文所述评估方法的技术方案中，优选的情况下，用细胞培养基对无机铝盐溶液进行稀释，稀释后al浓度范围在10-120μg/ml之间，用于培养神经系统细胞。
33.本发明中，采用相同铝浓度的自合成的纳米铝佐剂悬浮液、商业化铝佐剂悬浮液与无机铝盐溶液，对中枢神经系统最为常见的几种细胞进行处理，随着时间的推移，观测细胞生长状态的变化，并对其诱发毒性的可能机理进行测试，系统地评估出纳米铝佐剂的神经毒性并最终反映出其生物安全性。本发明的方法操作简单，重复性好，适用范围广，且该评估方法可准确地反映自行合成的纳米佐剂材料可能引发的神经毒性，在疫苗佐剂的制备与使用等医学领域中具有很好的应用前景。
附图说明
34.图1是实施例1中经过不同水热时间所得羟基氧化铝的x射线衍射表征结果。
35.图2是实施例1中经过不同水热时间所得羟基氧化铝的傅里叶红外光谱表征结果。
36.图3是小鼠小胶质细胞n9、小鼠脑微血管内皮细胞bend.3、小鼠海马神经元细胞ht-22分别接受实施例1中制备所得的羟基氧化铝纳米佐剂、商业化羟基氧化铝佐剂和alcl3·
6h2o溶液处理24h后mts实验的对比结果。
37.图4是小鼠小胶质细胞n9接受实施例1中制备所得的羟基氧化铝纳米佐剂、商业化羟基氧化铝佐剂和alcl3·
6h2o溶液处理24h后线粒体活性氧测定实验的对比结果。
38.图5是小鼠小胶质细胞n9接受实施例1中制备所得的羟基氧化铝纳米佐剂、商业化羟基氧化铝佐剂和alcl3·
6h2o溶液处理16h后annexinv-fitc/pi染色实验的对比结果。
具体实施方式
39.下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
40.实施例1
41.准确称取1.3933g九水合硝酸铝，并将其在室温下溶解到20ml去离子水溶液中，在溶解的过程中进行不断搅拌，搅拌速率控制在600rpm，待九水合硝酸铝完全溶解于去离子水形成透明澄清的前驱物溶液。吸取0.238ml乙二胺，并将其缓慢地、逐滴滴加入上述溶液中，溶解的过程中进行不断搅拌，搅拌速率控制在600rpm，随着乙二胺的滴加可观察到白色絮状沉淀生成，溶液逐渐变浑浊。将所得的混合液转移至提前预热的相应体积的高压聚四氟乙烯反应釜中，置于恒温烘箱中保持200℃恒温分别处理2h、3h、6h、24h。在相应时间点将
反应釜取出，待自然冷却至室温，将反应产物取出，使用去离子水离心(10000rpm，20min)洗涤三次，60℃下恒温干燥，得到白色粉末状固体。其中，200℃恒温处理2h，所得产物记作为eaa-1；200℃恒温处理3h，所得产物记作为eaa-2；200℃恒温处理6h，所得产物记作为eaa-3；200℃恒温处理24h，所得产物记作为eaa-4。通过对所得产物进行xrd与ftir检测，从检测结果可以确定所得产物确为羟基氧化铝纳米佐剂。具体结果如图1,2。
42.准确称取5mg上述合成而得的羟基氧化铝佐剂材料和invivogen商业化佐剂材料，在室温下分别分散于1ml去离子水中，并将其置于超声波清洗机中使其充分分散，分别得到羟基氧化铝佐剂悬浊液和商业化佐剂悬浊液。计算与5mg羟基氧化铝有相同铝含量的六水合氯化铝的质量，因此准确称取20mg六水合氯化铝，并将其在室温下溶解到1ml去离子水中，待六水合氯化铝完全溶解于去离子水形成透明澄清的溶液，得到六水合氯化铝溶液。在37℃、5％co2的环境中培养小鼠小胶质细胞n9、小鼠脑微血管内皮细胞bend.3、小鼠海马神经元细胞ht-22。用人脑中枢神经系统可能沉积的铝的最大含量与人脑脊液含量计算出人脑中铝的最大浓度，以此浓度作为材料处理最大浓度并设置浓度梯度，具体为14.08、28.15、56.31、112.61μg al/ml。先将细胞在空白细胞培养基中培养24h后，用细胞培养基(n9与bend.3细胞使用培养基为体积分数89％ dmem++-，体积分数10％fbs,体积分数1％双抗；ht-22细胞使用培养基为体积分数89％ dmem+++，体积分数10％fbs,体积分数1％双抗)对上述三种材料原液(分别为羟基氧化铝佐剂悬浊液、商业化佐剂悬浊液、六水合氯化铝溶液)进行稀释，稀释到设定的浓度梯度，并对细胞进行材料刺激，刺激时间分别为4h、8h、16h、24h。在接受刺激后，对细胞进行mts与线粒体活性氧测试；同时再分别刺激4h、8h、16h、24h后的细胞进行annexinv-fitc/pi染色，并用流式细胞术检测细胞凋亡情况。上述实验均以未经处理的细胞为阴性对照(ctrl.)。
43.上述测试结果显示，在实验设置的铝浓度范围内，接受三种材料低浓度刺激后的细胞活力基本维持不变，在设置的最大浓度下，接受alcl3·
6h2o刺激后的细胞活力显著下降，相对细胞活力最高下降了近40％；而接受自合成羟基氧化铝纳米佐剂和商业化羟基氧化铝佐剂材料刺激的细胞活力下降并不明显，相对细胞活力下降在10％内，可能是由极少量溶解的al
3+
造成；且alcl3·
6h2o可诱导更多的线粒体活性氧产生，与ctrl.对照组相比产量增加一倍；此外，alcl3·
6h2o诱导了更多的细胞凋亡，annexinv-fitc阳性比率较ctrl.对照组增长了20％左右。即经过自合成的羟基氧化铝纳米佐剂或商业化佐剂刺激的细胞与经过氯化铝刺激的细胞相比活力更强，即佐剂材料神经毒性更低，甚至几乎不构成神经毒性危害，具有良好的生物安全性。具体结果如图3,4,5。
44.对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

技术特征：
1.一种纳米铝佐剂生物安全性的评估方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将纳米铝佐剂分散于去离子水中形成均匀白色悬浊液；2)用细胞培养基对上述悬浊液进行稀释，并在其中培养神经系统细胞；3)对培养后的细胞进行毒性测试，毒性测试包括细胞活力、线粒体活性氧测试、细胞凋亡检测；4)若无细胞相对活力下降，无线粒体活性氧产生，无细胞凋亡现象发生，则证明纳米铝佐剂无神经毒性，即纳米铝佐剂生物安全性良好。2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤1)所述的纳米铝佐剂包括羟基氧化铝、磷酸铝纳米材料中的一种或两种。3.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤1)所述的纳米铝佐剂包括自行合成的纳米铝佐剂、商业化铝佐剂中的一种或两种。4.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤1)所述的悬浊液的浓度为3-10mg/ml。5.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤2)中稀释后al浓度在10-120μg/ml。6.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤2)所述的神经系统细胞包括小鼠小胶质细胞、小鼠脑微血管内皮细胞、小鼠神经元细胞一种或几种，所使用的细胞培养基为上述细胞类型对应所需的培养基。7.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤2)所述的细胞培养条件为37℃，5％co2，细胞培养时间为4-24h。8.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤3)所述的细胞凋亡检测采用流式细胞术检测annexin v-fitc/pi细胞染色。9.根据权利要求3所述的评估方法，其特征在于：所述自行合成的羟基氧化铝的制备方法，包括如下步骤：
①
将无机铝盐溶解于去离子水形成铝盐溶液；
②
向上述铝盐溶液中滴加碱性溶液，发生沉淀并持续搅拌得到混合液；
③
对上述混合液进行水热反应；
④
收集产物并进行冷却、离心、洗涤、干燥，得到白色粉末。10.根据权利要求9所述的评估方法，其特征在于：步骤
①
所述的无机铝盐为九水合硝酸铝、六水合氯化铝、硫酸铝中一种或其混合物；铝盐溶液的浓度为0.1-0.3m；步骤
②
所述的碱性溶液包括氨水、乙二胺的一种或其混合物；所述的碱性物质与铝盐的摩尔比为(0.8-2)：1；步骤
③
所述的水热反应温度为160-220℃，水热处理时间为2-24h；步骤
④
所述的冷却为将水热产物空冷至室温；所述的离心转速为6000-10000rpm，离心时间为10-30min；所述的洗涤次数为3-5次；所述的干燥温度为40-80℃。

技术总结
本发明公开了一种纳米铝佐剂生物安全性的评估方法。该方法利用中枢神经系统内细胞对于无机材料刺激的响应，通过细胞生长状态的变化情况反映出材料的神经毒性，并通过改变无机材料浓度与材料刺激时间等因素，精准反映纳米铝佐剂对于中枢神经系统内细胞可能造成的毒性，并最终反映出其生物安全性。本发明方法操作简便，可重复性好，结果可信度高，在疫苗佐剂的生产与安全应用中具有良好的前景。的生产与安全应用中具有良好的前景。


技术研发人员：孙冰冰 姜佳璇 毕世升
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/6