一种基于探针法质粒捕获技术的DNA片段功能性互作组学分析方法

一种基于探针法质粒捕获技术的dna片段功能性互作组学分析方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于探针法质粒捕获技术的dna片段功能性互作组学分析方法。


背景技术：

2.在dna-蛋白质相互作用的研究中，主流方法为dna pull down及reverse-chip技术。
3.dnapull down技术是使用特定序列的标记dna探针在体外与蛋白样本共孵后得到与特定dna序列结合的蛋白质。dna探针与蛋白质结合的平衡主要受到蛋白、dna探针浓度影响。考虑细胞内亚细胞区室及相分离等因素，细胞及亚细胞区室内蛋白浓度在功能状态下分布并不均一。目前，蛋白质提取方法仅能粗略区分到部分亚细胞结构，如线粒体、细胞核。因此，体外进行的dnapull down实验无法完整反应功能状态下细胞内蛋白质浓度分布情况。真核细胞内，表观修饰、转录复杂等生物过程调控通常以复杂的核酸-蛋白复合体作为基本单位实现。非编码rna往往也在蛋白复合体定位及装配过程中发挥重要作用。而目前dnapull down的蛋白提取过程往往忽略rna保护，并且相较于蛋白质，rna降解及构象改变更易发生于提取过程中，这些更降低了实验的可靠性及可重复性。并且，dnapull down中dna探针无法对蛋白复合体进行功能验证，即特定dna序列探针所结合蛋白可能无功能，增加实验的假阳性可能，增加实验时间及资源损耗。
4.reverse-chip技术首先使用甲醛等交联剂固定细胞内蛋白-核酸复合体后，使用特定核酸探针捕获片段化的蛋白-dna复合体。reverse chip所得产物可以反应生理状态下的dna-核酸相互作用及复合体组成，但由于reverse chip实验对象为基因组dna，且为了不影响目标dna片段与蛋白的结合，因此需要寻找目标dna片段周围无蛋白结合、与目标dna片段复合体无相互作用的特异性靶向序列，这使得核酸探针设计变得十分困难，随着片段化长度减小而增加。同时，由于dna片段化过程的随机性，捕获片段纯度较低，假阳性可能随着片段化长度的增加而增加。并且，由于内部对照组设置，难以纠正上述假阳性结果。综上，reverse chip虽可反应生理状态下的dna-蛋白相互作用，但适用范围较小，应用较为困难，且后续验证成本较高。
5.另外，既往对于质粒dna的捕获技术，是通过全细胞dna提取后使用质粒安全的脱氧核糖核酸酶(plasmid-free dnase)分解基因组dna。然而，如此捕获质粒dna会是质粒上所结合的蛋白质、rna信息，无法用于下游机制研究。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明建立了一种基于探针法质粒捕获技术在细胞内进行功能状态下特定dna片段相互作用组学分析的实验方法。具体地，
7.本发明第一方面提供了用于目标dna片段功能性互作组学分析的报告质粒，所述
质粒包含第一核酸片段，所述第一核酸片段包含目标dna片段及任选地荧光素酶编码片段。
8.在某些实施方式中，所述第一核酸片段进一步包含编码自剪切肽元件；优选地，所述剪切肽选自p2a，t2a，e2a和f2a。
9.在某些实施方式中，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶。
10.在某些实施方式中，第一核酸片段进一步包含目标dna调控序列。
11.在某些实施方式中，所述目标dna选自甲基化位点片段、羟甲基化位点片段、乙酰化位点片段等dna表观修饰位点片段，优选地，所述甲基化位点片段包含seq id no：1所述的核酸序列。
12.在某些实施方式中，所述目标dna调控序列为cpg甲基化调控序列。
13.在某些实施方式中，所述质粒进一步包含第二核酸片段；优选地，所述第二核酸片段包含内参表达盒；更优选地，所述内参为海参荧光素酶。
14.在某些实施方式中，所述质粒进一步包含质粒复制、筛选、转录和/或翻译相关的基础调控元件，所述基础表达元件包括复制起始位点、启动子、筛选标记。
15.本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的报告质粒捕获的探针。
16.在某些实施方式中，所述探针为5’端带有生物标记的ssdna探针。
17.在某些实施方式中，所述探针为5’端带有生物标记的seq id no:9所示的核酸。
18.本发明第三方面提供了基于探针法质粒捕获技术的dna片段功能性互作组学分析系统，所述系统包括根据本发明第一方面所述的报告质粒和根据本发明第二方面所述的探针。
19.本发明第四方面提供了根据本发明第一方面所述的报告质粒和/或根据本发明第二方面所述的探针和/或本发明第三方面所述的分析系统在目标dna片段功能性互作组学研究中的应用。
20.在某些实施方式中，所述应用包括质粒、探针转染，细胞裂解，磁珠捕获探针-质粒复合体，dna、蛋白提取纯化等步骤。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
22.本发明提供的质粒探针系统可在体内进行功能状态下特定dna片段相互作用组学分析，通过探针法捕获质粒获得完整、真实的原位互作组，通过与对照组比较分析进行特定dna序列相互作用组学分析，从而提高实验灵敏度、特异度与可重复性。
附图说明
23.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
24.图1显示dna甲基化报告质粒图谱。(a)dna甲基化调控报告质粒图谱；(b)含cpg甲基化调控序列的报告质粒图谱。
25.图2显示dna甲基化报告质粒功能验证结果。(a)实时定量甲基化特异性pcr结果；(b)双荧光素酶报告实验结果；met组为无调控序列的cpg甲基化报告质粒组，met-mrbox为含调控序列质粒组。
26.图3显示探针法质粒捕获产物验证结果。(a)探针法质粒捕获产物质粒富集的qpcr验证结果(plasmid concentraion＝plasmid/gapdh)；(b)探针法质粒捕获产物质粒富集的
qpcr后1％琼脂糖凝胶电泳验证结果；neg组无质粒组，met组为无调控序列的cpg甲基化报告质粒组，mrbox为含调控序列质粒组。
27.图4显示探针法质粒捕获技术在互作蛋白组学分析上的应用。(a)探针法质粒捕获蛋白产物考马斯亮蓝染色结果；(b)关于探针法质粒捕获蛋白产物的互作谱定性蛋白质组分析所富集蛋白交集的韦恩图；蛋白上样量均根据磁珠捕获dna单位浓度配平。根据质谱结果，β-actin在各组质粒互作蛋白中含量相近，可作为内参。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
30.实施例1dna甲基化调控报告质粒的构建
31.基于pmirglo质粒(北京天恩泽基因科技有限公司，cat#:60908-5035)构建dna甲基化调控报告质粒：将带有起始密码子的目标dna甲基化位点片段(5
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atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggt cacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccagg-3’，seq id no:1)插入萤火虫荧光素酶前，以p2a元件连接得到dna甲基化报告质粒(图1a)。
32.基于dna甲基化调控报告质粒构建含cpg甲基化调控序列(5
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agctgtaaattctttcaataaatatttactgcatgctgtgtgctctcat gtgccttttctaattcacaccctatgaggaaggaataatctttattcctgttttattttatttatatattttttaaaaagaagagggttttgctatgttacccagcctggtctcaactcctgggctcaagcaatcctcctgccttggcttcccaaagtgccgagataacaagcaggagccaccaagcccatacctattttagatttttttttttttttttttttgagacaaagtctcactctgttgcgcagactggagtgcagtagcacaatctcagctcactgcgacctctgcctcctgggttcagcctcccaagtagctggaattacaggtccctgccaccggcatggcttttttttttttttttttttttttttttgtatttttagtagagacagggtttcaccatgttgcccaggctggtcttgaattcttgacctcaagtaatccacccaccttggcctcccaaagtgctgggattacagacatgagccactgcaccagccttagatttttttttttttttaagatggagtttcactttttcacccgggctgaagtagagtggcacaatctgggctcactgcaacttctgcttcccaggttccagtgattctcctgccttagcctcccaagtagctgggattttaggtgcctgccaccacgcccggctaatttttgtattttcagtacagacggggtttcaccatgttgggtaggctagtctcaaactcctgacctcaggtgatccacccacctcggcctcccaaagtgctagaactataggcatgagccactgtgcctggcctttttttttaagtgcagttctgagaggtaaagtgatttatccgatatcacatagcttagagagaggaagagaaaggatttgaacccaggtttgtccagagcctggaccctagaccactgcaccgtggagcctgtgtttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttttgagatgaagtctctttctgttacccagcctggagtacagtggtgacaagatctcagctcactgcaacctctgcctcccaggttcaagtgattctcctgcctgagcctcttgaatagctaggattacaggcacgtgccaccatgcctggctaatttttgtatttttagtagagacaatgtttcaccatgttgcccaggctagtctcaaactcctgacctcaaatgatccacctgcctcagcctcccaaagtgctggattacag
gcgtgagccactgtgcctgccctaagcctgtgtgttttattcttctgacttgcaggctaaagcggcagctcttccatatctcattgctatctcctagggcttccgc-3’，seq id no:2)的报告质粒：将cpg甲基化调控序列dna片段使用酶切法插入mcs区域(图1b)。
33.实施例2报告质粒和探针的转染
34.使用lipo2000将质粒转染入293t细胞48h后,使用天根公司离心柱法细胞基因组提取试剂盒提取总dna，使用天根公司dp215试剂盒对dna进行亚硫酸盐转化与回收。对亚硫酸盐转化后dna产物使用巢式引物(forward：5
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tgggaaggggtgggt-3’，seq id no:3；reverse：5
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cctcacctacctcctt-3’，seq id no:4)及taq酶进行插入的目标dna甲基化位点周围共1456bp的dna序列进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化1456bp dna片段。使用甲基化特异性引物对(forward：5
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cgtgttttaggggttacg-3’，seq id no:5；reverse：5
’‑
atatccaaatccaccaccttaacct-3’，seq id no:6)与非甲基化特异性引物对(forward：5
’‑
gcatgcgtgttttaggggttata-3’，seq id no:7；reverse：5
’‑
atatccaaatccaccaccttaacct-3’，seq id no:8)及对巢式pcr扩增产物进行甲基化特异性实时荧光pcr对目标dna甲基化位点的甲基化水平进行评价，结果显示含有cpg甲基化调控序列质粒组的目标dna甲基化位点甲基化水平显著高于不含cpg甲基化调控序列的dna甲基化报告质粒组。结果提示，本质粒模型具有甲基化报告功能(如图2a)。使用yeason双荧光素酶报告试剂盒进行功能验证,结果显示：相较于不含cpg甲基化调控序列的dna甲基化报告质粒组，含有cpg甲基化调控序列质粒组的萤火虫素酶和海肾萤光素酶的发光测量值比值显著降低。上述结果表明海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶荧光素酶活性正常(如图2b)。
35.合成靶向质粒海参荧光素酶编码区的5’生物素标记ssdna探针：5’biotin-atggcttccaaggtgtacgaccccgagcaacg-3’(seq id no:9)。使用lipo2000将探针转染入293t细胞，孵育12h。
36.交联：吸净培养基，对于24孔板，加入200ul/孔含1％甲醛的无血清dmem培养基，全面覆盖细胞，室温10min。
37.终止交联：加入4ul 50
×
甘氨酸水溶液至甘氨酸终浓度125mm，同时轻柔吹打混匀，并将细胞悬液转移至新的1.5ml无酶ep管中。4℃，1500rpm，离心10min，弃上清。预冷pbs洗2遍。
38.细胞裂解：使用加入了rnase inhibitor和proteinase inhibitor cocktail的ripa(强)裂解液，以1ml/107细胞的比例加入裂解液，冰上裂解30min。4℃，12000rpm离心，取上清。
39.磁珠准备：每组样品准备200ug链霉亲和素(sav)免疫磁珠，洗净保护液后，使用500ul裂解液清洗磁珠3遍后使用含抑制剂裂解液重悬。
40.质粒捕获：每份裂解产物中加入200ug sav磁珠，颠倒混匀。4℃，垂直摇床孵育过夜(16h)。
41.洗涤：磁力架上使用遇冷的加入dtt、rnase inhibitor(invitrogen，am2694)及proteinase inhibitor cocktail的rip洗涤缓冲液(cell signaling technology,#5871)洗涤磁珠，重复3遍。
42.dna提取纯化：使用天根全基因组提取试剂盒完成。nanodrop检测dsdna浓度。
43.蛋白质提取纯化：加入等磁珠体积的2
×
loading buffer，100℃，10min。
44.实施例3效果验证
45.使用靶向rluc luciferase orf区域质粒特异性引物(5
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tgggaaggggtgggt-3’，seq id no:10；5
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cctcacctacctcctt-3’，seq id no:11)，以基因组gapdh引物(5
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agatccctccaaaatcaagtgg-3’，seq id no:12；5
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ggcagagatgatgaccctttt-3’，seq id no:13)为对照，对探针法质粒捕获实验dna产物进行qpcr实验，结果显示相较于总dna提取产物(total组)，探针法质粒捕获产物(pull-down组)中质粒相对浓度(质粒/基因组gapdh)显著增高，提示质粒富集于探针捕获产物(如图3a)。对上述质粒特异性引物rt-qpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见250bp附近单一目标条带(100bp下方为引物二聚体)(如图3b)。以上结果提示质粒捕获产物为质粒且纯度较高。
46.对捕获质粒结合蛋白产物进行sds-page凝胶电泳，考马斯蓝染色验证蛋白结合(图4a)。进一步进行互作谱定性蛋白质组分析见空白对照(无质粒)组共鉴定153种蛋白，甲基化报告质粒组共鉴定330种蛋白，含甲基化调控序列质粒组共鉴定出399种蛋白(图4b)。go component complex差异富集分析显示，质粒结合蛋白富集于dna包装复合体、核小体、复制叉等。综上，结果提示使用探针法质粒捕获技术可获得质粒结合蛋白组，并可进行特定dna序列互作组学分析，为dna-蛋白互作分析提供一种全新的研究手段。
47.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
48.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.用于目标dna片段功能性互作组学分析的报告质粒，其特征在于，所述质粒包含第一核酸片段，所述第一核酸片段包含目标dna片段及任选地荧光素酶编码片段。2.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述第一核酸片段进一步包含编码自剪切肽元件；优选地，所述剪切肽选自p2a，t2a，e2a和f2a。3.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶。4.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，第一核酸片段进一步包含目标dna调控序列。5.根据权利要求1-4任一项所述的报告质粒，其特征在于，所述目标dna包括甲基化位点片段、羟甲基化位点片段、乙酰化位点片段，优选地，所述甲基化位点片段包含seq id no：1所述的核酸序列。6.根据权利要求5所述的报告质粒，其特征在于，目标dna调控序列为cpg甲基化调控序列。7.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述质粒进一步包含第二核酸片段；优选地，所述第二核酸片段包含内参表达盒；更优选地，所述内参为海参荧光素酶。8.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述质粒进一步包含质粒复制、筛选、转录和/或翻译相关的基础调控元件，所述基础表达元件包括复制起始位点、启动子、筛选标记。9.用于权利要求1-8中任一项所述的报告质粒捕获的探针。10.根据权利要求9所述的探针，其特征在于，所述探针为5’端带有生物标记的ssdna探针。11.基于探针法质粒捕获技术的dna片段功能性互作组学分析系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1-8任一项所述的报告质粒和权利要求9-10任一项所述的探针。12.权利要求1-8任一项所述的报告质粒和/或权利要求9-10任一项所述的探针和/或权利要求11所述的分析系统在目标dna片段功能性互作组学研究中的应用。13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，包括质粒、探针转染，细胞裂解，磁珠捕获探针-质粒复合体，dna、蛋白提取纯化。

技术总结
本发明公开了一种质粒探针系统，所述系统可在体内进行功能状态下特定DNA片段相互作用组学分析，通过探针法捕获质粒获得完整、真实的原位互作组，通过与对照组比较分析进行特定DNA序列相互作用组学分析，从而提高实验灵敏度、特异度与可重复性。特异度与可重复性。特异度与可重复性。


技术研发人员：过一凡 古杰 葛棣 刘荣花 张宏宇
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/6