一种基于凹凸棒土的核酸提取方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于凹凸棒土的核酸提取方法。


背景技术：

2.核酸提取目前主要集中在固相载体吸附法，其操作步骤可分为细胞裂解、核酸吸附和洗脱三个部分。据报道，核酸吸附固相材料主要包括：二氧化硅及其衍生物、金属基材料、高分子材料和其他无机非金属材料等。其中商业化比较常用的是以硅胶滤膜为固相载体的柱提法和以金属基的磁珠法，柱提法需经过离心、过滤等繁琐操作，而可自动化、高通量的磁珠法为避免二次污染也是一次性使用成本略高。因此，目前急需发展一种低成本、高效提取核酸的材料与方法。


技术实现要素：

3.为了解决目前核酸提取材料存在的成本高或效率低等问题，本发明首次使用凹土作为核酸提取材料，建立一种凹土样品对dna吸附和解吸附的方法和体系，达到了低成本、高效提取细菌核酸的目的。
4.本发明提供一种基于凹凸棒土的dna吸附方法，具体步骤如下：
5.配制凹土悬浮液，然后将凹土悬浮液、含有dna的溶液、缓冲溶液混合，震荡，离心，取离心后的沉淀。
6.进一步的，凹土样品悬浮液浓度为10～50mg/ml，具体可选为30mg/ml。
7.进一步的，待吸附溶液为含有1～900μg/ml dna的溶液。
8.具体可选的，含有dna的溶液为含有100～200μg/ml鱼精dna的溶液，或为包含dna的金黄色葡萄球菌细胞裂解液。
9.进一步的，凹土样品悬浮液和待吸附溶液体积比为1：(1～20)。
10.优选的，凹土样品悬浮液和待吸附溶液体积比为1：(5～15)。
11.进一步的，缓冲溶液为ch3cooh-ch3coona溶液。
12.进一步的，加入缓冲溶液后体系中ph为3～8，na
+
浓度为100～600mm。
13.具体可选的，混合液体系中ph为5，na
+
浓度为300mm。
14.进一步的，振荡为以1000r/min震荡1～60min。
15.本发明提供一种凹凸棒土对dna的解吸附方法，具体步骤如下：
16.用乙醇洗涤dna吸附方法中离心后的沉淀，干燥固体，用洗脱液和清洗过的凹土样品混合进行离心，取上清液即为解吸附的dna溶液。
17.进一步的，乙醇的浓度为50～80％，具体可选为70％。
18.进一步的，洗脱液为水、tris-edta缓冲液或三聚磷酸钠水溶液中的一种。
19.优选的，洗脱液为超纯水、tris-edta缓冲液(10mm tris，1mm edta，ph 8.0)或浓度为15～40mm的三聚磷酸钠水溶液中的一种。
20.具体可选的，洗脱液为25mm的三聚磷酸钠水溶液。
21.进一步的，吸附有dna的凹土样品和洗脱液的质量体积比为300μg：(80～200)μl。
22.具体可选的，吸附有dna的凹土样品和洗脱液的质量体积比为300μg：100μl。
23.一种dna提取方法，先按一种基于凹凸棒土的dna吸附方法进行dna的吸附，再按一种凹凸棒土对dna的解吸附方法进行dna的解吸附。
24.本发明的优点和效果：
25.(1)本发明利用凹凸棒土，建立一种凹土样品对dna吸附和解吸附的方法和体系，可实现低成本提取核酸。
26.(2)本发明所使用的凹凸棒土对鱼精dna的饱和吸附量为18.8972μg/mg，利用合适的解吸剂可使凹凸棒土对dna的解吸率达到90％以上。据报道，包被二氧化硅的磁珠(optimization of influencing factors of nucleic acid adsorption onto silica-coated magnetic particles:application to viral nucleic acid extraction from serum)对dna的饱和吸附量为10.6μg/mg，解吸率为93
±
3.1％；已报道的锂改性蒙脱石(xie hy,wan zq,liu s,et al.charge-dependent regulation in dnaadsorption on 2d clay minerals[j].sci rep,2019.)对dna的8～10μg/mg的饱和吸附容量，这表明本发明对dna的饱和吸附量优于上述报道包被二氧化硅的磁珠，且对dna的解吸率与包被二氧化硅的磁珠皆可达到90％以上。
附图说明
[0027]
图1为本发明实施例1中凹土样品的x射线衍射(xrd)和傅里叶红外光谱(ftir)分析图。
[0028]
图2为本发明实施例1中凹土样品的zeta电位分析和扫描电子显微镜(sem)分析图。
[0029]
图3为本发明实施例1中凹土样品的n2吸附－脱附曲线和材料孔径分布曲线。
[0030]
图4为本发明实施例2中凹土样品在不同ph和钠离子浓度下对dna吸附的效果。
[0031]
图5为本发明实施例2中凹土样品在不同时间下对dna吸附的效果。
[0032]
图6为本发明实施例3中解吸剂对凹土样品上dna的解吸效果，图6(a)为不同解吸剂对dna解吸效果的影响，图6(b)为最优解吸剂stpp的浓度对dna解吸的影响。
[0033]
图7为本发明实施例3中dna在凹土样品上解吸平衡时间。
[0034]
图8为本发明实施例4中基因组dna提取电泳图。
具体实施方式
[0035]
材料与试剂：
[0036]
凹凸棒土产自江苏省盱眙欧百特；鱼精dna、三聚磷酸钠(reagent grade，purity≥98.0％)、柱式细菌基因组dna抽提试剂盒(no.b518255ezup)、磁珠法细菌基因组dna抽提试剂盒(no.b518725)购自上海生物工程有限公司；dna上样缓冲液(instant view
tm
红色荧光dna上样缓冲液，6
×
含溴酚蓝)购自上海碧云天有限公司；无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；冰醋酸(分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司)；无水醋酸钠(分析纯，北京伊诺凯科技有限公司)；实验中使用的超纯水使用milli-q a10过滤系统纯化(18.2mω
·
cm)；金黄色葡萄球菌atcc 6538：江南大学食品学院食品安全与质量控制研究中心保藏。
[0037]
仪器与设备：
[0038]
tus-200p振荡恒温金属浴(上海一恒科学仪器有限公司)；ss-5452小型高速离心机(德国eppendorf公司)；tanon 5200全自动化学发光图像分析系统(上海天能生命科学有限公司)；k5500超微量分光光度计(杭州瑞析科技有限公司)；ls-b50l型杀菌锅(上海医用核子仪器厂)；d2 phaser x射线衍射仪(德国布鲁克axs有限公司)、is10傅里叶红外光谱仪(美国nicolet公司)、quanta 250feg场发射扫描电子显微镜(美国fei公司)、zetasizer nano zs纳米粒度及zeta电位分析仪(英国马尔文公司)、asap2460 bet比表面积和孔径分析仪(美国麦克默瑞提克仪器有限公司)。
[0039]
实施例1
[0040]
此实施例为凹凸棒土对dna的吸附方法。
[0041]
将30mg凹土样品添加至1ml超纯水中以制成凹土样品悬浮液。然后，将10μl凹土样品悬浮液(30mg/ml)与50μl待吸附鱼精dna溶液(200ng/μl)、10μlch3cooh-ch3coona缓冲溶液和30μl超纯水混合，体系ph为5，na
+
浓度为300mm，体积为100μl。将混合物在振荡恒温金属浴内以1000r/min振荡10min，随后以8000
×
g离心，利用超微量分光光度计测量上清液中dna浓度，计算得出凹土样品对dna的饱和吸附容量可达18.7181μg/mg。针对5.6μg鱼精dna，在100μl吸附体系内dna吸附率可达到99％以上。
[0042]
凹土吸附材料对dna的吸附量通过吸附平衡前后溶液中dna含量变化计算所得，如下式：
[0043][0044]
式中：qe(ng/μg)为达到吸附平衡时的dna的吸附量；ce(ng/μl)为达到吸附平衡时上清液中dna的浓度；c0(ng/μl)为dna溶液的初始浓度；v0(μl)为加入dna溶液的体积；ws(μg)为吸附剂投加量。
[0045]
对所使用的凹土样品进行性能表征，所得到的xrd如图1(a)所示，将样品的xrd图与凹凸棒土(pdf标准卡片号#31-0783)、石英(pdf标准卡片号#85-0798)和白云石(pdf标准卡片号#36-0426)相对照，结果显示样品中的主要矿物组成有凹凸棒土，以及石英和白云石。所使用的凹土样品的红外吸收光谱(ftir)如图1(b)所示，样品在3622cm-1
和3543.5cm-1
为(mg,al)-oh的两个伸缩振动峰，3417cm-1
处为凹土样品内沸石水的伸缩振动峰；1645cm-1
处为吸附水和结晶水的弯曲振动吸收峰；1033cm-1
处为单链内部四面体层间的si-o的非对称伸缩振动峰；790cm-1
和516cm-1
为si-o的弯曲振动峰；1448cm-1
和730cm-1
处为白云石co
32-的特征峰。
[0046]
所使用的凹土样品的zeta电位测试结果如图2(a)所示，在所测范围内，凹土样品的表面均带负电荷。粘土矿物表面所带负电荷是由于晶格缺陷所造成，属于永久电荷，但表面边缘断键水解产生的电荷属于可变电荷，与ph有关。凹土样品的sem测试结果如图2(b)所示为平均直径为50nm，长度为200～300nm的纳米棒相互缠结并聚集。
[0047]
所使用的凹土样品的bet比表面积结果如图3所示，图3(a)和(b)所示为凹土样品的n2吸附－脱附曲线和孔径分布曲线。凹土样品的n2吸附-脱附等温线属于应用化学联合会(international union of pure and applied chemistry,iupac)关于吸附等温线分类规定的ⅳ型等温线，说明其是以介孔为主的多孔性材料，且显示出h3型迟滞环。bet测试结
果：凹土样品的bet比表面积为158.375m2/g，孔体积为0.275cm3/g，平均孔径为6.947nm。
[0048]
对比例1
[0049]
考察溶液初始ph对吸附的影响，调整体系中缓冲液的ch3cooh用量来调节吸附体系ph为3、4、6、7、8。
[0050]
将30mg凹土样品添加至1ml超纯水中以制成凹土样品悬浮液。然后，将10μl凹土样品悬浮液(30mg/ml)与50μl待吸附鱼精dna溶液(100μg/ml)、10μlch3cooh-ch3coona缓冲溶液和30μl超纯水混合，na
+
浓度为300mm，体积为100μl。将混合物在振荡恒温金属浴内以1000r/min振荡30min，随后以8000
×
g离心3min，利用超微量分光光度计测量上清液中dna浓度。
[0051]
凹土样品在不同ph下对dna吸附的影响如图4(a)所示，对凹土样品而言，ph在3.0～8.0范围内，随着ph增加dna在凹土样品表面的吸附量逐渐降低，考虑低ph下存在使dna不稳定的影响，选取吸附体系中最适ph为5.0。溶液的ph值会影响吸附质的状态和吸附剂的表面电荷。在实验条件下，dna分子中的氨基或磷酸基团脱去质子带负电，因此dna很难吸附于同样带负电的凹土样品表面。而据报道，基于阳离子桥结构可使带负电荷的dna被吸收到带负电荷的粘土上。
[0052]
对比例2
[0053]
考察溶液na
+
浓度对吸附的影响，调整体系中缓冲液的ch3coona来调节吸附体系na
+
浓度为0、100、200、300、400、500、600mm。
[0054]
将30mg凹土样品添加至1ml超纯水中以制成凹土样品悬浮液。然后，将10μl凹土样品悬浮液(30mg/ml)与50μl待吸附鱼精dna溶液(100μg/ml)、10μlch3cooh-ch3coona缓冲溶液和30μl超纯水混合，ph为5，体积为100μl。将混合物在振荡恒温金属浴内以1000r/min振荡30min，随后以8000
×
g离心3min，利用超微量分光光度计测量上清液中dna浓度。
[0055]
凹土样品在不同na
+
浓度下对dna吸附的影响如图4(b)所示，为离子浓度对dna吸附的影响，对凹土样品而言，naac浓度从0mm增加到300mm，dna在凹土样品表面的吸附量逐渐增加，随着naac浓度的继续增大，dna吸附量变化不大，故吸附体系中na
+
最适浓度为300mm。
[0056]
对比例3
[0057]
考察振荡吸附时间对吸附的影响，设置吸附时间梯度在0～60min。
[0058]
将30mg凹土样品添加至1ml超纯水中以制成凹土样品悬浮液。然后，将10μl凹土样品悬浮液(30mg/ml)与50μl待吸附鱼精dna溶液(100μg/ml)、10μlch3cooh-ch3coona缓冲溶液和30μl超纯水混合，ph为5，na
+
浓度为300mm，体积为100μl。将混合物在振荡恒温金属浴内以1000r/min振荡，随后以8000
×
g离心3min，利用超微量分光光度计测量上清液中dna浓度。
[0059]
采用准一级动力学(pseudo-first order)和准二级动力学模型(pseudo-second order)对不同时间下凹凸棒土对dna的吸附量数据进行拟合，依据r2值判断拟合的优劣。利用动力学模拟可考察吸附过程中的吸附速率大小及反应平衡时间。
[0060]
dna在凹土样品上的吸附动力学曲线如图5所示，利用准一级吸附动力学及准二级吸附动力学模型对吸附数据进行拟合，比较两种模型的r2，确定准一级模型为最佳拟合模型。平衡吸附量的实验值与准一级模型的理论值吻合性较好，预测凹土样品饱和吸附量为
18.8972μg。凹土样品在最初的10min内皆迅速吸附，吸附百分率达到90％以上，10min以后的吸附逐渐放缓，说明吸附逐渐接近平衡。在后续实验中选择10min作为反应时间。
[0061]
实施例2
[0062]
此实施例为凹凸棒土对鱼精dna的解吸附实验。
[0063]
先用70％的乙醇洗涤300μg实施例1中吸附了dna的凹土样品，以去除杂质，经晾干后，用100μl的洗脱液和清洗过的凹凸样品混合，经8000
×
g离心1min后，利用超微量分光光度计测量上清液中dna浓度。
[0064]
选取超纯水、te buffer(10mm tris，1mm edta，ph 8.0)和三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，stpp)三种洗脱剂对dna进行洗脱，考察不同洗脱剂对dna在凹土样品上的洗脱效果。dna在凹土吸附材料上的解吸率依式计算：
[0065][0066]
式中：e(％)为dna的解吸率；c1(ng/μl)为洗脱后上清液中dna的浓度；v1(μl)为加入洗脱液的体积；q(ng)为dna的吸附量。
[0067]
不同洗脱剂对凹土样品上dna的洗脱效果如图6所示，图6(a)为超纯水、te buffer和stpp三种洗脱剂对dna的洗脱效果，结果表明stpp对凹土样品上的核酸解吸效果显著优于te buffer和超纯水。由于dna是一种聚磷酸分子，而stpp是含有三个磷酸根的聚合物分子，可实现dna的解吸。图6(b)为15～40mm stpp对dna解吸的浓度优化，结果表明stpp对凹土样品上的dna最适解吸浓度为25mm，解吸率可达(95.80
±
0.44)％。stpp解吸剂对dna解吸平衡时间结果如图7所示，吸附在凹土样品上的核酸在1min内实现迅速解吸，解吸率达90％以上。
[0068]
实施例3
[0069]
此实施例为凹凸棒土核酸提取实验。
[0070]
以金黄色葡萄球菌为核酸提取对象，评价凹土样品提取细菌基因组dna的得率及核酸质量。
[0071]
(1)菌体的收集与裂解
[0072]
取金黄色葡萄球菌液接种至3ml已灭菌的胰酪胨大豆肉汤培养基(tsb)中，置于37℃摇床160rpm培养18h，取0.5ml培养的金黄色葡萄球菌，参考《柱式细菌基因组dna抽提试剂盒说明书》，进行菌体的收集与裂解，获得400μl菌体裂解液。
[0073]
(2)凹凸棒土对细菌基因组dna的吸附
[0074]
将30mg凹土样品添加至1ml超纯水中以制成凹土样品悬浮液。然后，将30μl凹土样品悬浮液(30mg/ml)、400μl细胞裂解液和70μlch3cooh-ch3coona缓冲溶液混合，体系ph为5，na
+
浓度为3mm，体积为500μl。将混合物在恒温震荡孵育器内以1000r/min震荡，并以8000
×
g离心10min。利用微量核酸定量仪测量上清液中dna浓度。通过添加dna的量与上清液dna的量之间的差值可计算吸附的dna量。
[0075]
(3)凹凸棒土对基因组dna的解吸附实验
[0076]
先用70％的乙醇洗涤步骤(2)中吸附了dna的凹土样品，以去除杂质，经晾干后，用100μl的25mm三聚磷酸钠溶液和清洗过的凹凸样品混合，经8000
×
g离心1min后，利用超微量分光光度计测量上清液中dna浓度。
[0077]
(4)凹凸棒土提取基因组dna质量与效果评价
[0078]
取1μl步骤(3)中的dna提取产物，用超微量核酸定量仪测定其浓度、a
260
及a
280
，计算得量(浓度
×
洗脱液体积)和纯度(a
260
/a
280
)，见表1。当a
260
/a
280
的比值在1.7～1.9之间，说明凹土样品提取基因组dna的纯度较好。
[0079]
采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组dna，上样量为5μl，3～5v/cm恒压电泳2h。在波长为254nm的紫外光下观察并进行拍照。电泳出现一条片段大小合适的单一条带说明dna完整性较好。
[0080]
对比例4
[0081]
以离心柱法和磁珠法提取基因组dna方法为对照，以金黄色葡萄球菌为核酸提取对象，评价改性凹凸棒土提取细菌基因组dna的得率及核酸质量。
[0082]
离心柱法：离心柱法对核酸的吸附方法为将吸附柱放入收集管中，用移液器将400μl实施例4步骤(1)中获得的细胞裂解液全部加入吸附柱中，静置2min，再12,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。再将吸附柱放回收集管，加入500μl pw solution，10,000rpm离心30s倒掉滤液。随后将吸附柱放回收集管，加入500μl wash solution，10,000rpm离心30s倒掉滤液。将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的wash solution。最后取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-100μl ce buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集dna溶液。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。
[0083]
磁珠法：磁珠法对核酸的吸附方法为向400μl实施例4步骤(1)中获得的细胞裂解液中加入500μl buffer mb和10μl磁珠，吸打或者点振混匀，室温静置1min。将离心管置于磁力架上30s，待磁珠完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。再向离心管中加入900μl 70％乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30s，待磁珠完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。随后重复上步步骤一次，室温开盖干燥20min或者55℃恒温箱中开盖干燥5min至管内无液体残留。向离心管中加入50-100μl te buffer，65℃水浴10min，间或混匀。最后取出离心管并置于磁力架上30s，待磁珠完全吸至管壁上之后，小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组dna。
[0084]
凹土样品在实际样品核酸提取(金黄色葡萄球菌)中的应用效果如图8所示，m为自下到上的500bp～15000bp的dna marker，1为磁珠法得到的条带，2为柱提法得到的条带，3和4为凹土样品吸附提取得到的条带，提取得到的金黄色葡萄球菌基因组dna长度均大于15000bp，且为单一条带，表明提取的基因组dna具有较好的完整性。
[0085]
不同方法与材料提取基因组dna得量如下表1所示，与离心柱提法和磁珠法提取基因组dna相比，磁珠法提取得量最高，凹土样品提取结果略低于离心柱提法。
[0086]
表1不同方法提取基因组dna提取得量和纯度
[0087][0088]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种基于凹凸棒土的dna吸附方法，其特征在于，具体步骤如下：配制凹土悬浮液，然后将凹土悬浮液、含有dna的溶液、缓冲溶液混合，震荡，离心，取离心后的沉淀。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，凹土样品悬浮液浓度为10～50mg/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，凹土样品悬浮液和待吸附溶液体积比为1：(1～20)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲溶液为ch3cooh-ch3coona溶液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入缓冲溶液后体系中ph为3～8。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入缓冲溶液后体系中na
+
浓度为100～600mm。7.一种凹凸棒土对dna的解吸附方法，其特征在于，具体步骤如下：用乙醇洗涤权利要求1中离心后的沉淀，干燥固体，用洗脱液和清洗过的凹土样品混合进行离心，取上清液即为解吸附的dna溶液。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，洗脱液为水、tris-edta缓冲液或三聚磷酸钠水溶液中的一种。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，吸附有dna的凹土样品和洗脱液的质量体积比为300μg：(80～200)μl。10.一种dna提取方法，其特征在于，先按权利要求1～6任一项所述方法进行dna的吸附，再按权利要求7～9任一项所述方法进行dna的解吸附。

技术总结
本发明公开了一种基于凹凸棒土的核酸提取方法，属于生物技术领域。该方法具体步骤如下：配制凹土悬浮液，然后将凹土悬浮液、待吸附溶液、缓冲溶液混合，将混合物震荡，离心，取离心后的沉淀即为吸附有DNA的凹土样品。本发明利用凹凸棒土，建立一种凹土样品对DNA吸附和解吸附的方法和体系，可实现低成本提取核酸，所使用的凹凸棒土对鱼精DNA的饱和吸附量为18.8972μg/mg，利用合适的解吸剂可使凹凸棒土对DNA的解吸率达到90％以上。土对DNA的解吸率达到90％以上。土对DNA的解吸率达到90％以上。


技术研发人员：郭亚辉 王莫凡 金萍 丁洪流 董菡 谢云飞 于航 成玉梁 钱和 姚卫蓉
受保护的技术使用者：苏州市产品质量监督检验院（苏州市质量技术监督综合检验检测中心、苏州市质量认证中心）
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/8/5