慢性阻塞性肺病的生物标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及慢性阻塞性肺病的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.慢性阻塞性肺病(copd)是全球发病率和死亡率的主要原因。copd的诊断和严重程度分类是在有呼吸系统症状的患者中进行的，持续气流受限由支气管扩张剂后1秒用力呼气容积(fe v1)/用力肺活量(fvc)70％确认。慢性阻塞性肺病通常与吸烟有关。吸入烟草烟雾会激活上皮细胞和肺泡巨噬细胞(ams)，释放化学诱导剂，使中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞进入肺部循环。慢性阻塞性肺病患者体内的这些细胞释放出大量的蛋白酶和生长因子，导致肺实质分解、粘液分泌过多和小气道纤维化。然而，越来越多的证据表明，其他风险因素也很重要。据估计，25-45％的慢性阻塞性肺病患者从未吸烟，这表明非吸烟慢性阻塞性肺病的负担比以前认为的要高得多。因此，寻找非吸烟copd患者的生物标志物对于诊断和治疗具有重要意义。迄今为止发现的大多数copd生物标志物都不能排除吸烟的影响。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供慢性阻塞性肺病的生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现α-2-巨球蛋白或α-2-巨球蛋白/基质金属蛋白酶-9可作为诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物；基质金属蛋白酶-9可作为诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的生物标志物；α-2-巨球蛋白可作为诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的生物标志物。
4.α-2-巨球蛋白(a2m)是一种主要的人血浆蛋白酶抑制剂，推测其在肺蛋白酶活性的调节中发挥作用。凭借独特的蛋白酶捕获机制，a2m引诱活性蛋白酶进入其捕捉器，屏蔽这些潜在的底物，并标记其复合物以通过受体介导的内吞作用消除。肺泡巨噬细胞在肺中局部合成a2m的能力和受体介导的a2m蛋白酶复合物的吞噬作用对于在与蛋白酶反应时减少肺的蛋白酶负荷可能是非常重要的，a2m被转化并因此获得结合生长因子、细胞因子和细胞受体的能力。近年来，蛋白酶-抗蛋白酶平衡的恶化被认为在copd的发病机理中起作用。影响这种平衡的基质金属蛋白酶(mmps)是组织重建不可或缺的元素。在发明人的前期研究中发现，与正常对照组相比，吸烟和非吸烟copd患者的a2m调节失调，a2m水平在吸烟和非吸烟copd患者中均降低，这表明它可能是非吸烟和吸烟copd的潜在生物标志物。巨噬细胞释放的mmps导致弹性蛋白的破坏，并导致肺气肿。mmp-9是mmps家族成员之一，是copd患者ams产生的主要蛋白水解酶之一，但也由嗜中性粒细胞、上皮细胞、肥大细胞和成纤维细胞分泌。mmp-9蛋白水解消化细胞外基质(ecm)蛋白，包括胶原蛋白、明胶和弹性蛋白，并激活潜在的mmp-9前体和mmp-13前体。活化的蛋白酶被其主要血清抑制剂迅速抑制，包括α1-抗胰蛋白酶(aat)、金属蛋白酶组织抑制剂(timps)和a2m，它们可以抑制广谱丝氨酸蛋白酶和mmps。几项研究发现，mmp-9的活性受a2m调节。mmp-9和a2m之间的失衡可能参与了copd的发
生和发展。慢性阻塞性肺病的发病机制可能是由蛋白酶活性失调引起的，当蛋白酶和抗蛋白酶之间的不平衡发展时，因为蛋白酶的活性较高或蛋白酶抑制剂的功能障碍。本发明阐明了循环中mmp-9、a2m、mmp-9/a2m比值与copd临床特征之间的关系，并评估了其在诊断copd和预测copd急性加重中的价值。
5.基于此，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物，所述生物标志物为α-2-巨球蛋白。
7.本发明还提供一种诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物组合，所述生物标志物组合包括α-2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶-9。
8.本发明还提供一种诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的生物标志物，所述生物标志物为基质金属蛋白酶-9。
9.本发明还提供一种诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的生物标志物，所述生物标志物为α-2-巨球蛋白。
10.本发明还提供以下(1)或(2)所述的试剂在制备诊断慢性阻塞性肺病的试剂盒中的应用：
11.(1)检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂；
12.(2)检测血浆中α-2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶-9浓度的试剂。
13.本发明还提供检测血浆中基质金属蛋白酶-9浓度的试剂在制备诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的试剂盒中的应用。
14.本发明还提供检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂在制备诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的试剂盒中的应用。
15.本发明还提供一种诊断慢性阻塞性肺病的试剂盒，包括以下(1)或(2)所述的试剂：
16.(1)检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂；
17.(2)检测血浆中α-2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶-9浓度的试剂。
18.本发明还提供一种诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的试剂盒，包括检测血浆中基质金属蛋白酶-9浓度的试剂。
19.本发明还提供一种诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的试剂盒，包括检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂。本发明公开了以下技术效果：
20.本发明阐明了循环中mmp-9、a2m、mmp-9/a2m比值与copd临床特征之间的关系，并评估了其在诊断copd和预测copd急性加重中的价值，结果发现α-2-巨球蛋白或α-2-巨球蛋白/基质金属蛋白酶-9可作为诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物；基质金属蛋白酶-9可作为诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的生物标志物；α-2-巨球蛋白可作为诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的生物标志物。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获
得其他的附图。
22.图1为稳定期慢性阻塞性肺疾病患者和健康对照者血浆中a2m、mmp-9的研究；其中，a-b为elisa测定稳定期copd患者和健康组之间血浆中a2m(a)和mmp-9(b)的表达水平的结果；c为pearson相关分析，用于揭示a2m和mmp-9之间的关系；d为与对照组相比，稳定期copd患者中的mmp-9/a2m比值；两组间的差异通过双样本独立学生t检验分析进行评估，****p《0.0001；
23.图2为健康非吸烟组、健康吸烟组、copd非吸烟组和copd吸烟组之间a2m(a)和mmp-9(b)的表达水平；通过单向方差分析评估各组之间的差异；ns:无显著性(p》0.05)，*p《0.05；
24.图3为a2m(a)和mmp-9/a2m(b)在copd诊断中的表现；
25.图4为a2m、mmp-9与慢性阻塞性肺疾病急性加重的相关性研究结果；其中a为稳定期copd组和aecopd组之间mmp-9的表达水平；b为mmp-9在预测慢性阻塞性肺疾病急性加重中的价值；c为基于双样本独立学生t检验分析，a2m在稳定copd组和aecopd组之间的表达水平；两组间的差异通过双样本独立学生t检验分析进行评估；ns:无显著性(p》0.05)，****p《0.0001；
26.图5为a2m在非感染aecopd组和感染aecopd组之间的表达水平；两组间的差异通过双样本独立学生t检验分析进行评估；****p《0.0001。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.α-2-巨球蛋白(a2m)是一种主要的人血浆蛋白酶抑制剂，推测其在肺蛋白酶活性的调节中发挥作用。凭借独特的蛋白酶捕获机制，a2m引诱活性蛋白酶进入其捕捉器，屏蔽这些潜在的底物，并标记其复合物以通过受体介导的内吞作用消除。肺泡巨噬细胞在肺中
局部合成a2m的能力和受体介导的a2m蛋白酶复合物的吞噬作用对于在与蛋白酶反应时减少肺的蛋白酶负荷可能是非常重要的，a2m被转化并因此获得结合生长因子、细胞因子和细胞受体的能力。近年来，蛋白酶-抗蛋白酶平衡的恶化被认为在copd的发病机理中起作用。影响这种平衡的基质金属蛋白酶(mmps)是组织重建不可或缺的元素。在发明人的前期研究中发现，与正常对照组相比，吸烟和非吸烟copd患者的a2m调节失调，a2m水平在吸烟和非吸烟copd患者中均降低，这表明它可能是非吸烟和吸烟copd的潜在生物标志物。巨噬细胞释放的mmps导致弹性蛋白的破坏，并导致肺气肿。基质金属蛋白酶-9(mmp-9)是mmps家族成员之一，是copd患者ams产生的主要蛋白水解酶之一，但也由嗜中性粒细胞、上皮细胞、肥大细胞和成纤维细胞分泌。mmp-9蛋白水解消化细胞外基质(ecm)蛋白，包括胶原蛋白、明胶和弹性蛋白，并激活潜在的mmp-9前体和mmp-13前体。活化的蛋白酶被其主要血清抑制剂迅速抑制，包括α1-抗胰蛋白酶(aat)、金属蛋白酶组织抑制剂(timps)和a2m，它们可以抑制广谱丝氨酸蛋白酶和mmps。几项研究发现，mmp-9的活性受a2m调节。mmp-9和a2m之间的失衡可能参与了copd的发生和发展。慢性阻塞性肺病的发病机制可能是由蛋白酶活性失调引起的，当蛋白酶和抗蛋白酶之间的不平衡发展时，因为蛋白酶的活性较高或蛋白酶抑制剂的功能障碍。本发明阐明了循环中mmp-9、a2m、mmp-9/a2m比值与copd临床特征之间的关系，并评估了其在诊断copd和预测copd急性加重中的价值，具体详述如下：
33.实施例1
34.一、方法
35.1.研究设计
36.在本发明中，收集了2022年1月至2022年11月南京医科大学附属常州第二医院呼吸与危重症医学科的35例稳定期copd患者、70例aecopd患者和35例性别和年龄匹配的健康对照。
37.本发明中的所有copd患者均根据copd全球倡议标准招募，并根据慢性阻塞性肺疾病全球倡议(gold)指南，根据症状的严重程度和恶化风险分为四组(i、ii、iii和iv)。这些患者有稳定的气流限制，fev1/fvc《70％，随后吸入β2-激动剂。
38.所有患者被分为以下三组：
39.第一组(稳定的copd组)：稳定被定义为在前3个月中没有copd恶化需要住院、口服皮质类固醇或抗生素；
40.第二组(aecopd组)：恶化被定义为至少连续2天出现以下呼吸系统症状中的任何两种增加-呼吸困难、痰脓、痰量、喘息、咳嗽和普通感冒症状；
41.第三组(健康对照组)：正常fev1》预测值的70％，且无肺部疾病病史。
42.目前的吸烟者被定义为一生中至少吸过100支烟，并且在过去一年中仍然吸烟或已经戒烟的人。在目前的吸烟者中，吸烟量以包年为基础(pys)计算。吸烟少于100支的受试者，包括那些从不吸烟的人，被认为是“从不吸烟”。目前的不吸烟者和吸烟者被分为健康-不吸烟者(健康-ns)、健康-吸烟者(健康-s)、copd-吸烟者(copd-s)和copd-不吸烟者(copd-ns)。感染被定义为咳嗽和痰产量增加，呼吸困难增加，发热，痰细菌培养阳性。在门诊就诊时，测量身高、体重、呼出一氧化氮分数(feno)和肺泡一氧化氮浓度(cano)以及肺功能，并采集血样。如果患者患有支气管扩张症、肺结核、哮喘、恶性肿瘤或其他混淆性炎症疾病，如关节炎、结缔组织疾病或炎症性肠病，则被排除在外。
43.所有患者均提供了书面知情同意书，该研究经常州市第二人民医院伦理委员会批准(2022ky113-01)。
44.2.肺功能的测量
45.由医生使用肺活量计(zan 100，nspire health，ober thulba，德国)在坐姿下记录肺功能测试。在测量过程中，密切监测体积和流量曲线。测量肺功能测试参数，包括fvc、fev1、fev1/fvc，并计算预测值。
46.3.feno和cano测量
47.所有患者都接受了流速为50毫升/秒的标准feno和cano测量(nioxmino，aerocrine，solna，sweden)，使用反馈信号进行控制。这是在身体体积描记和支气管激发之前进行的，因为所涉及的呼吸操作可能导致feno结果失真。
48.4.a2m和基质金属蛋白酶-9的测定
49.血浆样品中a2m和mmp-9的总浓度通过使用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(中国江苏美标)根据制造商的说明进行测定。在450nm处获得标准品和样品的吸光度值，比较为每次测定构建的标准曲线，并用于最小化测定间的差异。为了避免任何偏见，所有的样本都进行了盲法分析。
50.5.统计分析
51.统计软件spss 21.0用于分析。图像由graphpad prism 7绘制。kolmogorov-smirnov检验用于检验测量数据的正态性。符合正态分布的测量数据表示为均值
±
标准差，不符合正态分布的测量数据表示为中位数(四分位数)，分类变量数据表示为比例。使用pearson的χ2分析二分变量，t检验(正态分布数据)或mann-whitney u检验(非正态分布数据)用于连续变量。pearson相关分析(正态分布数据)或spearman等级相关分析(非正态分布数据)用于相关分析。roc曲线用于确定诊断的敏感性和特异性，曲线下面积(auc)用于确定诊断效果。p值《0.05被认为是显著的。
52.二、结果
53.1.群体的总体特征
54.表1总结了各组的总体特征。如表1所示，健康对照组和稳定期copd(s-copd)患者在性别、年龄、身体质量指数和吸烟史方面没有显著差异。s-copd患者的fev1/fvc和fev1％较低。然而，与对照组相比，稳定期copd患者的feno和cano较高。
55.表1患者的临床特征
[0056][0057][0058]
注：数据以平均值sem表示；s-copd：稳定期copd。
[0059]
2.稳定期慢性阻塞性肺疾病患者和健康对照者血浆中a2m、基质金属蛋白酶-9的研究
[0060]
各组的蛋白酶-抗蛋白酶水平如图1所示。与对照组相比，s-copd患者的血浆a2m浓度降低(p《0.0001)(图1中a)，mmp-9浓度升高(p《0.0001)(图1中b)。pearson相关分析显示，copd患者血浆中的a2m水平与mmp-9呈负相关(r＝-0.726，p《0.0001)(图1中c)。与对照组相比，在s-copd患者中发现了更高的mmp-9/a2m比值(p《0.0001)(图1中d)。
[0061]
3.a2m、mmp-9和稳定的copd指数、肺功能
[0062]
a2m、mmp-9、a2m/mmp-9与s-copd患者临床指标的相关性见表2。s-copd患者血浆a2m水平与fev1％和fev1/fvc呈正相关，与cat评分和mmrc评分呈负相关。mmp-9水平和mmp-9/a2m与fev1％和fev1/fvc呈负相关，与cat评分和mmrc评分呈正相关。
[0063]
表2a2m、mmp-9、mmp-9/a2m与稳定期copd患者临床及肺功能指标的相关性
[0064][0065]
4.a2m、基质金属蛋白酶9和吸烟状况
[0066]
在copd-ns中发现的a2m浓度低于健康-ns(p《0.01)，这也在copd-s中发现，高于健康-s(p《0.01)。此外，健康ns和健康s之间的血浆a2m没有统计学显著差异。此外，copd-ns和copd-s之间的血浆a2m没有统计学显著差异(图2中a)，这意味着a2m表达水平不受吸烟的影响。与健康对照组相比，健康对照组的血浆mmp-9浓度升高。此外，当比较copd-ns和copd-s时，在copd-s中发现了更高浓度的mmp-9(图2中b)。
[0067]
5.a2m和a2m/基质金属蛋白酶-9对稳定期慢性阻塞性肺疾病的诊断作用
[0068]
进行受试者工作特征曲线(roc)分析，以评估a2m和mmp-9/a2m作为copd生物标志物的价值(图3中a和b)。当截止值为5.49时，a2m作为copd生物标志物的敏感性为0.8571，特异性为0.6，auc为0.7669(95％ci＝0.6569-0.877，p《0.0001)，其作为copd生物标志物的诊断价值最佳。当截止值为6.418时，mmp-9/a2m作为copd生物标志物的敏感性为0.7429，特异性为0.8，auc为0.84(95％ci＝0.7495-0.9305，p《0.0001)，其作为稳定期copd的生物标志物的诊断价值高于a2m。
[0069]
6.a2m、基质金属蛋白酶9与慢性阻塞性肺疾病急性加重
[0070]
表3总结了s-copd组和aecopd组的总体特征。s-copd和aecopd患者在性别、年龄、身体质量指数、吸烟方面无显著差异。aecopd患者血浆中mmp-9的水平显著高于s-copd患者(p《0.0001)(图4中a)。当截断值为42.69时，mmp-9对aecopd进展的敏感性为91.43％，特异性为85.71％(图4中b)。然而，aecopd和稳定期copd之间的血浆a2m水平没有显著差异(图4中c)。
[0071]
表3患者的临床特征
[0072][0073]
注：数据以平均值sem表示。
[0074]
7.a2m和感染
[0075]
众所周知，感染是aecopd的主要原因之一。为了探讨copd急性加重期血浆a2m水平是否受感染影响，本发明进一步扩大样本量，将70例aecopd患者分为感染组和非感染组。表4总结了非感染性急性加重copd(ni-aecopd)和感染性急性加重copd(i-aecopd)的总体特征。ni-aecopd和i-aecopd患者的临床特征相似。结果显示，感染组的血浆a2m水平显著高于非感染组(图5)，这表明copd患者在急性加重期间血浆a2m的增加与感染有关。
[0076]
表4患者的临床特征
[0077][0078][0079]
注：数据以平均值sem表示。
[0080]
综上所述，本发明发现，与对照组相比，稳定期copd患者血浆a2m浓度降低，mmp-9浓度、mmp-9/a2m比值升高。pearson分析显示a2m与mmp-9表达呈负相关。吸烟者和非吸烟者copd或健康对照受试者之间的a2m水平没有统计学差异。无论是否患有慢性阻塞性肺疾病，吸烟者的mmp-9水平均高于不吸烟者。此外，a2m、mmp-9和mmp-9/a2m与copd患者的fev1％、fev1/fvc、cat评分和mmrc评分显著相关，但与呼出气一氧化氮分数(feno)和肺泡一氧化氮浓度(cano)无关。roc曲线结果显示mmp-9/a2m的诊断价值优于a2m。aecopd患者血浆中mmp-9的相对表达水平明显高于稳定期copd患者，而血浆a2m水平在aecopd和稳定期copd之间无显著差异。此外，与无感染的copd患者相比，有感染的copd患者a2m水平升高。
[0081]
此外，慢性阻塞性肺疾病患者外周血a2m水平发生改变，并与病情严重程度和感染相关。然而，a2m的变化与吸烟、feno和cano之间没有显著的相关性，这表明a2m可能反映了copd患者的整体炎症而不是局部炎症，并且可以作为非吸烟copd患者的生物标志物。
[0082]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为α-2-巨球蛋白。2.一种诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包括α-2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶-9。3.一种诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为基质金属蛋白酶-9。4.一种诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为α-2-巨球蛋白。5.以下(1)或(2)所述的试剂在制备诊断慢性阻塞性肺病的试剂盒中的应用：(1)检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂；(2)检测血浆中α-2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶-9浓度的试剂。6.检测血浆中基质金属蛋白酶-9浓度的试剂在制备诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的试剂盒中的应用。7.检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂在制备诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的试剂盒中的应用。8.一种诊断慢性阻塞性肺病的试剂盒，其特征在于，包括以下(1)或(2)所述的试剂：(1)检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂；(2)检测血浆中α-2-巨球蛋白和基质金属蛋白酶-9浓度的试剂。9.一种诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的试剂盒，其特征在于，包括检测血浆中基质金属蛋白酶-9浓度的试剂。10.一种诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的试剂盒，其特征在于，包括检测血浆中α-2-巨球蛋白浓度的试剂。

技术总结
本发明公开了慢性阻塞性肺病的生物标志物及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明阐明了循环中MMP-9、A2M、MMP-9/A2M比值与COPD临床特征之间的关系，并评估了其在诊断COPD和预测COPD急性加重中的价值，结果发现α-2-巨球蛋白或α-2-巨球蛋白/基质金属蛋白酶-9可作为诊断慢性阻塞性肺病的生物标志物；基质金属蛋白酶-9可作为诊断慢性阻塞性肺病是否急性加重的生物标志物；α-2-巨球蛋白可作为诊断慢性阻塞性肺病恶化期是否发生感染的生物标志物。志物。志物。


技术研发人员：张倩 肖心儒
受保护的技术使用者：常州市第二人民医院
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/8/5