一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法及其应用

1.本发明涉及生物材料制备技术领域，具体涉及一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法及其应用。


背景技术：

2.骨折和骨缺损是医学上常见的骨损伤，通常需要通过外科手术来进行组织固定，从而实现组织修复，例如使用金属板、螺钉或钢钉对骨骼进行固定。虽然这类方法对骨折有一定的治疗效果，但是容易出现松动和感染，导致其它并发症的发生。随着技术的进步，聚甲基丙烯酸甲酯、磷酸钙和硫酸钙骨水泥等骨粘合剂得到了广泛的应用。作为一种新型的替代品，使外科手术变得更加简单且快捷。然而，这些产品存在着生物相容性差，无促骨生长能力的缺陷。因此，需要开发具有良好生物相容性，粘附性且促成骨性能的骨粘合剂。近年来，尽管基于水凝胶的新型骨粘合剂被广泛研发，但是目前所见制备的水凝胶粘合剂存在制备复杂，生物相容性低，凝胶时间和粘附强度不能调控，促成骨修复能力不足等问题。有必要开发具有优异的生物相容性和降解性，良好的骨粘附性能，以及可控凝胶时间与粘附强度的骨粘合剂，以解决临床过程中一次性粘骨失败的问题。
3.针对以上问题，本发明提出了一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法及其应用。此外，该方法制备的水凝胶以天然高分子为主体，具有良好的生物相容性和可降解性，以满足植入的需求。因此，设计一种用于超声调控水凝胶聚合和促成骨修复的生物医用材料，拟克服现有产品的细胞相容性差，粘附强度缺乏控制的缺陷，使其具有良好的临床价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法及其应用，利用超声刺激调控水凝胶的聚合时间及促进骨修复，使水凝胶材料具有良好的生物降解性、生物相容性和骨粘附性能；并且可通过超声调控水凝胶的粘骨性能和时间，加速成骨细胞的增殖与分化，实现骨折的愈合。
5.本发明的另一个目的是使所述水凝胶适用于外伤性骨裂、骨折损伤，骨粘接及促进骨缺损修复的应用。
6.实现本发明目的之技术措施如下：
7.一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤1：将明胶溶解于ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐进行修饰，透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐化明胶。
9.步骤2：将壳聚糖溶解于ph＝5的酸性水溶液，加入二氢咖啡酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc，调节溶液ph＝5进行反应，透析、冻干得到二氢咖啡酸改性的壳聚糖。
10.步骤3：将硝酸钙、氨水和磷酸氢二胺溶液混合后反应过夜、离心、洗涤得到羟基磷
灰石纳米颗粒，将羟基磷灰石纳米颗粒分散在tris-hcl缓冲溶液中，加入多巴胺搅拌6-12h，得到多巴胺修饰的羟基磷灰石，将多巴胺修饰的羟基磷灰石分散在水溶液中，加入甲基丙烯酸酐，搅拌3-6h，得到甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石。
11.步骤4：将碳材料分散在水溶液中，加入多酚类化合物，并加入碱性溶液调节混合液的ph值为碱性，温度25-40℃，搅拌反应6-24h，得到多酚功能化的碳材料。
12.步骤5：将步骤4得到的多酚功能化的碳材料分散于水溶液中，加入六水合氯化铁，利用碳材料表面的多酚还原六水合氯化铁，得到多酚功能化碳-铁材料。
13.步骤6：将甲基丙烯酸酐化明胶溶解于水溶液中，加入甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石纳米颗粒和多酚功能化的碳-铁材料形成混合溶液，然后加入二氢咖啡酸改性的壳聚糖水溶液，加入引发剂过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶下面施加超声，超声强度为1-3w/cm2,超声时间为1-10min，即可形成所需的水凝胶。
14.上述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，所述步骤1中5g明胶中加入2-6ml甲基丙烯酸酐。
15.所述步骤2中1g壳聚糖中加入0.5-1.5g的二氢咖啡酸，edc的质量百分比浓度为2-3wt％。
16.所述步骤3中多巴胺的质量百分比浓度为0.1-0.5wt％；15g多巴胺修饰的羟基磷灰石加1-4ml甲基丙烯酸酐。
17.所述步骤4中的碳材料包括氧化石墨烯，单壁碳纳米管，多壁碳纳米管的一种或多种。
18.所述步骤4中所述多酚类化合物包括单宁酸、二氢咖啡酸、儿茶素、没食子酸、没食子酚、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯的一种或多种。
19.所述步骤4的具体过程如下，
20.s1：将碳材料分散在水溶液中，形成质量百分比浓度为0.1-50.0％；
21.s2:再向步骤s1中加入质量百分比浓度为0.05-10.0％的多酚类化合物；
22.s3：再向步骤s2中加入碱性溶液，调节溶液至碱性；
23.s4：所述步骤s2反应温度为20-50℃，反应时间为0.1-2h；
24.s5：所述步骤s3溶液ph＞7，反应温度为20-50℃，反应时间为1-24h。
25.所述本发明制备方法步骤6中的甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分比浓度为10-15wt％；二氢咖啡酸改性的壳聚糖溶解于水溶液中，形成质量百分比浓度为1-4％，甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石的质量百分比浓度为0.5-3％；多酚功能化碳材料-铁材料质量百分比为0.01-0.1％；引发剂的浓度为0.05-1％。
26.如所述的方法制备得到的水凝胶的应用，适用于外伤性骨裂、骨折损伤，骨粘接及促进骨缺损修复的应用。
27.一种抗可控粘骨和促成骨修复水凝胶，是按照以上任一项所述的可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法制备得到。
28.如所述的方法制备得到的水凝胶的应用，适用于骨组织的粘附，可调控粘附性能起到骨组织粘接，并起到骨修复的作用。
29.与现有技术比较本发明获得的有益技术效果：
30.1、本发明通过多酚化合物对碳材料进行表面修饰可更好的分散在水凝胶中，并
31.实现表面多酚基团与铁离子螯合，形成具有声动力效应的碳材料；在水凝胶网络中不仅形成导电网络，而且在施加超声时，可控制水凝胶凝胶时间。
32.2、本发明利用甲基丙烯酸酐对多巴胺修饰的羟基磷灰石进行修饰，甲基丙烯酸
33.酐功能化的羟基磷灰石在水凝胶体系中作为交联剂，提高水凝胶的内聚力，通过调节甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石的浓度可得到不同力学性能的水凝胶。
34.3、本发明采用生物可降解材料作为水凝胶基材，材料中大量的多酚基团使水凝
35.胶具有较好的骨组织粘附能力；并且，通过超声调控水凝胶粘附时间，初次超声可实现重复粘骨，防止临床过程中一次性粘骨失败。再次超声，可以加强粘附力，实现骨粘接固定。
附图说明
36.图1a、图1b、图1c为本发明中实施案例1制备得到的水凝胶的应用黑白照片图。
37.图2a、图2b为本发明中实施案例1制备得到的水凝胶的sem图。
38.图3为本发明中实施案例1制备得到的水凝胶粘附新西兰白兔桡骨骨碎片一个月后的三点弯曲实验(图表中显示的图中曲线a、b、c)。
39.图4、本发明通过调节所述羟基磷灰石的浓度得到不同粘附性能的水凝胶比较试验示意图。
40.图5、本发明水凝胶在施加超声时加快水凝胶凝胶时间后效果比较示意图。
具体实施方式
41.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
42.本发明引入多酚改性壳聚糖和多酚功能化碳材料用于制备具有可生物降解的粘附性骨胶水凝胶，具有良好的的生物相容性，且凝胶环境温和，不会对骨折损伤处造成二次损伤；通过超声调控水凝胶的粘骨性能；比现有产品具有更强的功能性和粘骨可控性，加速了骨折处的修复。
43.下面结合具体附图和实施案例对本发明做进一步说明。
44.图1a、图1b、图1c为本发明制备的水凝胶用于新西兰白兔桡骨骨片粘附，用超声进行刺激成胶，观察到水凝胶能很好的粘附骨片，显示水凝胶具有优良的体内骨粘附性能。
45.图2为本发明制备的水凝胶的sem图，图2a观察到水凝胶的多孔结构，并通过放大后得到图2b，观察到水凝胶的微观结构，孔壁上有褶皱和纳米颗粒。显示加入的甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石纳米颗粒和多巴胺功能化的氧化石墨烯-铁材料分布于水凝胶中。
46.图3为本发明制备的水凝胶粘附新西兰白兔桡骨骨碎片一个月后的三点弯曲实验。图中曲线a、b、c依次为新西兰白兔桡骨骨折未治疗，桡骨骨折通过传统固定、水凝胶粘附骨折碎片一个月后桡骨的三点弯曲实验。观察到水凝胶粘附后比其他治疗方法显示能承受更高的负荷。如下图表1：
47.图表1
48.该图表的数据是根据三次平行试验，以三种不同方式对桡骨骨折处理的三点弯曲实验；这是其中一组数据从而形成图3。
49.图4的结果显示本发明通过试验调节甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石的浓度而得到不同粘附力学性能的水凝胶。
50.图5试验证实了通过多酚化合物对碳材料进行表面修饰，可更好的分散在水凝胶中形成并实现表面多酚基团与铁离子螯合，形成具有声动力效应的碳材料；可以通过施加不同频率与时间的超声时，可控制水凝胶凝胶时间。
51.实施例1：
52.一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
53.步骤1：将10g明胶完全溶解于60℃下100ml磷酸盐缓冲液中，将8ml甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度滴加进去。随后，在温度为50℃条件下搅拌反应3h。加入200ml磷酸盐缓冲液进去终止反应，置于透析袋(mw＝14000)中，透析7天，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐化明胶。
54.步骤2：将0.5g壳聚糖溶解在ph＝5的100ml酸性水溶液中，加入用10ml乙醇溶解的1.182g二氢咖啡酸，继续加入用40ml无水乙醇于水体积比为1:1溶剂溶解的2.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，维持ph一直为5，并搅拌反应12h后，置于透析袋(mw＝3500)中，ph为5的水溶液中透析3天，冷冻干燥得到二氢咖啡酸改性壳聚糖。
55.步骤3：将11.9g硝酸钙溶解在100ml水溶液中，滴加磷酸氢二胺和氨水溶液，搅拌反应12h，离心水洗后烘干得到羟基磷灰石。将得到的羟基磷灰石再次分散在100ml去离子水中，加入0.1g多巴胺，搅拌过夜后离心水洗，得到多巴胺修饰的羟基磷灰石，将多巴胺修饰的羟基磷灰石再次分散在100ml水溶液中，缓慢加入8ml甲基丙烯酸酐反应3h，离心，水洗后得到甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石。
56.步骤4：将氧化石墨烯分散在水中形成浓度为50mg/ml,加入0.02g多巴胺搅拌0.5h,再加入0.15g氢氧化钠搅拌反应6h,离心水洗，干燥备用。将得到的材料分散于200ml水溶液中，加入0.5g六水合氯化铁，然后加入氨水调节ph为碱性环境，在温度为25℃条件下反应6h，离心水洗，干燥得到多巴胺功能化的氧化石墨烯-铁材料。
57.步骤5：将步骤1得到的1.2g甲基丙烯酸酐化明胶溶解于10ml水溶液中，加入步骤3
得到的甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石0.2g和步骤4得到的多巴胺功能化的氧化石墨烯-铁材料0.05g,形成混合溶液。并向混合溶液中加入0.3g步骤2得到的二氢咖啡酸改性的壳聚糖,加入0.02g过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶下面施加超声(1.0mhz,1w/cm2)刺激2min，即可形成所需的水凝胶。
58.实施例2：
59.步骤1：将10g明胶完全溶解于60℃下100ml磷酸盐缓冲液中，将8ml甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度滴加进去。随后，在温度为50℃条件下搅拌反应3h。加入200ml磷酸盐缓冲液进去终止反应，置于透析袋(mw＝14000)中，透析7天，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐化明胶。
60.步骤2：将1g壳聚糖溶解在ph＝5的100ml酸性水溶液中，加入用10ml乙醇溶解的1.182g二氢咖啡酸，继续加入用40ml无水乙醇于水体积比为1:1溶剂溶解的2.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，维持ph一直为5，并搅拌反应12h后，置于透析袋(mw＝3500)中，ph为5的水溶液中透析3天，冷冻干燥得到二氢咖啡酸改性壳聚糖。
61.步骤3：将11.9g硝酸钙溶解在100ml水溶液中，滴加磷酸氢二胺和氨水溶液，搅拌反应12h，离心水洗后烘干得到羟基磷灰石。将得到的羟基磷灰石再次分散在100ml去离子水中，加入0.1g多巴胺，搅拌过夜后离心水洗，得到多巴胺修饰的羟基磷灰石，将多巴胺修饰的羟基磷灰石再次分散在100ml水溶液中，缓慢加入8ml甲基丙烯酸酐反应3h，离心，水洗后得到甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石。
62.步骤4：将单壁碳纳米管分散在水中形成浓度为10mg/ml,加入0.02g没食子酸1h,再加入0.15g氢氧化钠搅拌反应6h,离心水洗，干燥备用。将得到的材料分散于水溶液中，加入0.5g六水合氯化铁，然后加入氨水调节ph为碱性环境，在温度为25℃条件下反应12h，离心水洗，干燥得到没食子酸功能化的单壁碳纳米管-铁材料。
63.步骤5：将步骤1得到的甲基丙烯酸酐化明胶1g溶解于10ml水溶液中，加入步骤3得到的甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石0.4g和步骤5得到的没食子酸功能化的单壁碳纳米管-铁材料0.05g,形成混合溶液。并向混合溶液中加入0.4g步骤2得到的二氢咖啡酸改性的壳聚糖,加入0.02g过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶下面施加超声(1.0mhz,0.5w/cm2)刺激5min，即可形成所需的水凝胶。
64.实施例3：
65.步骤1：将10g明胶完全溶解于60℃下100ml磷酸盐缓冲液中，将8ml甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度滴加进去。随后，在温度为50℃条件下搅拌反应3h。加入200ml磷酸盐缓冲液进去终止反应，置于透析袋(mw＝14000)中，透析7天，冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐化明胶。
66.步骤2：将0.5g壳聚糖溶解在ph＝5的100ml酸性水溶液中，加入用10ml乙醇溶解的1.182g二氢咖啡酸，继续加入用40ml无水乙醇于水体积比为1:1溶剂溶解的2.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，维持ph一直为5，并搅拌反应12h后，置于透析袋(mw＝3500)中，ph为5的水溶液中透析3天，冷冻干燥得到二氢咖啡酸改性壳聚糖。
67.步骤3：将11.9g硝酸钙溶解在100ml水溶液中，滴加磷酸氢二胺和氨水溶液，搅拌反应12h，离心水洗后烘干得到羟基磷灰石。将得到的羟基磷灰石再次分散在100ml去离子水中，加入0.1g多巴胺，搅拌过夜后离心水洗，得到多巴胺修饰的羟基磷灰石，将多巴胺修
饰的羟基磷灰石再次分散在100ml水溶液中，缓慢加入8ml甲基丙烯酸酐反应3h，离心，水洗后得到甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石。
68.步骤4：将氧化石墨烯分散在水中形成浓度为1mg/ml,加入0.02g表儿茶素没食子酸酯搅拌0.5h,再加入0.15g氢氧化钠搅拌反应6h,离心水洗，干燥备用。将得到的材料分散于200ml水溶液中，加入0.5g六水合氯化铁，然后加入氨水调节ph为碱性环境，在温度为25℃条件下反应6h，离心水洗，干燥得到表儿茶素没食子酸酯功能化的氧化石墨烯-铁材料。
69.步骤5：将步骤1得到的1g甲基丙烯酸酐化明胶溶解于10ml水溶液中，加入步骤3得到的甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石0.2g和步骤4得到的表儿茶素没食子酸酯功能化的氧化石墨烯-铁材料0.05g,形成混合溶液。并向混合溶液中加入0.3g步骤2得到的二氢咖啡酸改性的壳聚糖,加入0.02g过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶下面施加超声(1.5mhz,1w/cm2)刺激2min，即可形成所需的水凝胶。
70.本发明引入多酚改性壳聚糖和多酚功能化碳材料用于制备具有可生物降解的粘附性骨胶水凝胶。筛选不同的组分与采用不同的方法从而形成所需水凝胶。使其具有良好的的生物相容性，凝胶环境温和，克服了现有产品存在的缺陷；相比而言，在应用上具有更强功能性和粘骨可控性，加速了骨折处的修复。适用于外伤性骨折、骨裂、骨缺损等多种骨组织的修复。

技术特征：
1.一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将明胶溶解于ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐进行修饰，透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酸酐化明胶。步骤2：将壳聚糖溶解于ph＝5的酸性水溶液，加入二氢咖啡酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc，调节溶液ph＝5进行反应，透析、冻干得到二氢咖啡酸改性的壳聚糖。步骤3：将硝酸钙、氨水和磷酸氢二胺溶液混合后离心、洗涤得到羟基磷灰石纳米颗粒，将羟基磷灰石纳米颗粒分散在tris-hcl缓冲溶液中，加入多巴胺搅拌6-12h，得到多巴胺修饰的羟基磷灰石，将多巴胺修饰的羟基磷灰石分散在水溶液中，加入甲基丙烯酸酐，搅拌3-6h，得到甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石。步骤4：将碳材料分散在水溶液中，加入多酚类化合物，并加入碱性溶液调节混合液的ph值为碱性，温度25-40℃，搅拌6-24h搅拌反应得到多酚功能化的碳材料。步骤5：将步骤4得到的多酚功能化的碳材料分散于水溶液中，加入六水合氯化铁，利用多酚原位在碳材料表面还原六水合氯化铁，得到多酚功能化碳-铁纳米材料。步骤6：将甲基丙烯酸酐化明胶溶解于水溶液中，加入甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石纳米颗粒和多酚功能化的碳-铁纳米材料形成混合溶液，然后加入二氢咖啡酸改性的壳聚糖水溶液，加入引发剂过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶下面施加超声，超声强度为1-3w/cm2,超声时间为1-10min，即可形成所需的水凝胶。2.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中5g明胶中加入2-6ml甲基丙烯酸酐。3.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中1g壳聚糖中加入0.5-1.5g的二氢咖啡酸，edc的质量百分比浓度为2-3wt％。4.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中多巴胺的质量百分比浓度为0.1-0.5wt％；15g多巴胺修饰的羟基磷灰石加1-4ml甲基丙烯酸酐。5.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的碳材料包括氧化石墨烯，单壁碳纳米管，多壁碳纳米管的一种或多种。6.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中所述多酚类化合物包括单宁酸、二氢咖啡酸、儿茶素、没食子酸、没食子酚、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯的一种或多种。7.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4的具体过程如下，s1：将碳材料分散在水溶液中，形成质量百分比浓度为0.1-50.0％；s2:再向步骤s1中加入质量百分比浓度为0.05-10.0％的多酚类化合物；s3：再向步骤s2中加入碱性溶液，调节溶液至碱性；s4：所述步骤s2反应温度为20-50℃，反应时间为0.1-2h；s5：所述步骤s3溶液ph＞7，反应温度为20-50℃，反应时间为1-24h。8.根据权利要求1所述的一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤6中的甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分比浓度为10-15wt％；二氢咖啡酸改性的壳
聚糖溶解于水溶液中，形成质量百分比浓度为1-4％，甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石的质量百分比浓度为0.5-3％；多酚功能化碳材料-铁纳米材料质量百分比为0.01-0.1％；引发剂的浓度为0.05-1％。9.一种抗可控粘骨和促成骨修复水凝胶，其特征在于，按照权利要求1—8任一项所述的可控粘骨和促成骨修复水凝胶的制备方法制备得到。10.如权利要求9所述水凝胶在适用于外伤性骨裂、骨折损伤，骨粘接及促进骨缺损修复的应用。

技术总结
一种可控粘骨和促成骨修复水凝胶制备方法及其应用，涉及生物材料制备技术领域。本发明引入多酚改性壳聚糖和多酚功能化碳材料用于制备具有可生物降解的黏附性骨胶水凝胶。将甲基丙烯酸酐化明胶溶解于水溶液中，加入甲基丙烯酸酐功能化的羟基磷灰石纳米颗粒和多酚功能化的碳-铁纳米材料形成混合溶液，再加入二氢咖啡酸改性的壳聚糖水溶液，加入引发剂过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；对水凝胶施加超声，超声强度1-3W/cm2、时间为1-10min，可形成所需水凝胶。其具有良好的的生物相容性，凝胶环境温和；比现有产品应用上具有更强功能性和粘骨可控性，加速了骨折处的修复。适用于外伤性骨折、骨裂、骨缺损等多种骨组织的修复。骨缺损等多种骨组织的修复。骨缺损等多种骨组织的修复。


技术研发人员：鲁雄 杨璐 谢超鸣 郭小川
受保护的技术使用者：西南交通大学深圳研究院
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/8/5