一种基于双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用

1.本发明属于生物医药
技术领域：
：。更具体地，涉及一种双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用。
背景技术：
：：2.细胞外囊泡(extracellular，ev)是指从细胞膜上脱落或由细胞主动分泌的具有双层膜结构的纳米级囊泡小体，又称外泌体，其广泛存在于血液、尿液、唾液和脑脊液等几乎所有体液中；而有的细胞外囊泡携带来自其亲代肿瘤细胞的各种生物成分，包括核酸、蛋白质、脂质以及跨膜蛋白，参与细胞间通讯和信息传递，能动态反应肿瘤的发生、发展、转移和预后等，并且，与循环肿瘤细胞和游离dna相比，ev丰度和稳定性都相对较高，只需采集少量体液即可获得，因此，肿瘤衍生的ev被认为是最有前景的癌症早期精准诊断的无创生物标志物。ev在细胞间信息传递、肿瘤转移和侵袭等各个环节中发挥重要作用，已成为肿瘤“液体活检”最具潜力的生物标志物之一。3.尽管肿瘤来源的外泌体作为疾病标志物展现出巨大的临床应用潜力，但是其在实际应用中依然存在亟待解决的问题。首先，生物体液环境复杂，其含有的细胞碎片和其它类型的囊泡容易干扰特定疾病ev的检测。因此，对ev进行定量分析前首先需要进行有效的纯化和分离。传统的ev分离方法包括差速离心法、尺寸排阻色谱法、共沉淀法等。其中，差速离心法是目前分离ev的金标准，但其操作步骤繁琐、耗时且需要借助昂贵的设备。其他方法如尺寸排阻色谱法和共沉淀法等存在提纯效率低和完整性丢失等缺点。其次，目前ev的定量检测方法的灵敏度还有待进一步提高。直接粒子计数法、microrna检测法和基于ev特定膜蛋白检测的策略是目前ev定量检测常用的方法。直接粒子计数法包括纳米粒子追踪分析、流式分析和可调谐脉冲等方法。然而，直接粒子计数法是基于ev的尺寸进行分析，无法实现ev的亚群鉴定；ev的mirna检测需要破膜才能实现，容易产生假阳性结果。而ev的膜表面具有种类丰富的蛋白质，对ev表面特定蛋白进行分析具有操作简便、快速且特异性强的优势，同时，基于蛋白识别的酶联免疫、微流控技术、比色法和荧光等方法能够实现特异类型的ev膜蛋白检测。但是这些方法存在操作复杂、环境要求高和稳定性差等缺点。因此，如何实现体积小、密度低的ev的有效分离，如何提高复杂生物样品中ev标志物分析的灵敏度仍然是极具挑战的两大难题。4.适配体是通过指数富集(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)技术在体外选择性合成的寡核苷酸，长度大约为25-80个碱基序列，与抗体相比，它易于合成和化学修饰，稳定性高，对靶标蛋白具有高亲和力和特异性，更重要的是其可与核酸的扩增策略相结合，实现信号放大，达到对ev膜蛋白的灵敏检测在基于适配体特异性识别ev膜蛋白的检测中，ev膜蛋白的表达含量往往极低。因此，近年来，通过适配体探针结合核酸扩增策略实现ev膜蛋白的高灵敏分析受到了科研工作者极大的关注。其中，滚环扩增(rca)是一种体外恒温扩增技术，具有高特异性、高灵敏度和高保真度等优点尤其受到关注。rca是利用dna或rna作为引物，在环状单链dna模板上扩增出长单链核酸分子，其长链产物含有与环状模板互补的重复序列，因此，可以通过控制模板序列达到对产物序列进行定制，rca已被应用于各种疾病标志物的分析。5.虽然基于适配体识别细胞外囊泡表面蛋白的技术已经取得了很大的进步，但是这些方法中整个检测过程大多仅涉及单个蛋白质的识别，肿瘤来源的细胞外囊泡之间存在异质性，通过识别单一蛋白识别的策略无法实现特定肿瘤的准确分析。并且由于癌症细胞外囊泡在生物流体中的浓度较低，样品中的蛋白质碎片也会干扰检测的准确度，对细胞外囊泡分离和识别效果较差，其检测限灵敏度也还有待提升。因此，实现外泌体的准确高灵敏分析仍然是一个挑战。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是解决上述问题的缺陷和不足，实现体积小、密度低的ev的有效分离，以及提高复杂生物样品中ev标志物分析的灵敏度，提供一种基于金属有机骨架联合双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用。7.本发明的目的是提供一种双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒。8.本发明另一目的是提供所述试剂盒的应用。9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：10.本发明提供一种联合双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒，包括表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1的金属有机骨架，特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2。11.本发明试剂盒中的金属有机骨架通过其表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1来与ev膜表面蛋白cd63特异性结合，再结合金属有机骨的ev分离特性，从而识别并捕获ev，实现对ev的富集；在进一步离心实现ev的纯化后，再利用特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2与ev膜蛋ptk7特异性结合锚定在捕获的ev表面并作为滚环扩增引物，再进行rca反应，从而实现对ev特异性识别分离和信号放大以实现ev灵敏准确检测。12.优选地，所述表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1的金属有机骨架的制备方法为将金属有机骨架与特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1共同孵育，即得。13.优选地，所述金属有机骨架为uio-66-nh2，uio-66-nh2能够通过常规方法合成得到或直接购买合成产。14.特别地，特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1及特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2通过常规的寡核苷酸合成手段即可得到。本发明选择针对急性淋巴细胞白血病细胞来源的外泌体作为检测模型，急性淋巴细胞白血病来源的ev能够表达cd63蛋白并且高表达ptk7蛋白(shangguan,d.；cao,z.；meng,l.；mallikaratchy,p.；sefah,k.；wang,h.；li,y.；tan,w.,cell-specificaptamerprobesformembraneproteinelucidationincancercells.journalofproteomeresearch2008,7(5),2133-2139.)；因此在细胞外囊泡上具有高度表达的表面蛋白cd63和ptk7都适用于本发明。15.优选地，所述特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1为cd63-apt，其核酸序列为：ttttttcaccccacctcgctcccgtgacactaatgctatt。16.优选地，所述特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2为ptk7-apt，其核酸序列为：atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagaccccgctctgcgagggta。17.优选地，试剂盒还包含rca反应所需试剂。18.更优选地，试剂盒还包含dna聚合酶、扩增原料(dntps)。19.本发明提供上述试剂盒在非疾病诊断治疗目的分离并检测细胞外囊泡中的应用。20.本发明还提供一种非疾病诊断治疗目的识别分离并检测细胞外囊泡的方法，将表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1的金属有机骨架与待测样品共孵，富集待测样品中的细胞外囊泡，离心后取沉淀重悬，再加入特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2共同孵育，以适配体2为引物进行rca反应。21.优选地，所述金属有机骨架为uio-66-nh2。22.优选地，所述细胞外囊泡为表面特异性表达蛋白cd63和ptk7的细胞外囊泡。23.作为一种优选地可实施方式，检测细胞外囊泡的方法包含以下步骤：24.s1.合成细胞外囊泡特异性表达蛋白的适配体cd63-apt和ptk7-apt；25.s2.将合成的适配体cd63-apt修饰到金属有机骨架uio-66-nh2上，得到mof@cd63-apt；再将获得的mof@cd63-apt与细胞外囊泡共孵，富集细胞外囊泡，离心后取沉淀重悬，得mof@cd63-apt@ev；26.s3.将步骤s1合成的适配体ptk7-apt与步骤s2的mof@cd63-apt@ev共同孵育，进行rca反应。27.优选地，所述cd63-apt的核酸序列为：ttttttcaccccacctcgctcccgtgacactaatgctatt，ptk7-apt的核酸序列为：atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttagaccccgctctgcgagggta。28.优选地，所述细胞外囊泡为急性淋巴细胞白血病细胞来源的细胞外囊泡。29.优选地，步骤s2中uio的浓度为1～21.5mg/ml，cd63-apt和ptk7-apt的浓度为10μm。30.更优选地，步骤s2中uio的浓度为1.5mg/ml。31.优选地，步骤s3中rca反应采用的模板浓度25～200nm，聚合酶为1.0～3.0uphi29，反应时间1～3h。32.本发明具有以下有益效果：33.本发明提供一种能够识别和分离并检测细胞外囊泡的试剂盒，包括表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd63的适配体1的金属有机骨架，特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2。本发明通过双适配体结合ev表面膜蛋白，利用mof的优点与适配体1结合实现对ev的分离，在成功分离的基础上，利用适配体2作为引物进行rca扩增，进行信号放大，实现对ev的检测。本发明提供的试剂盒分离效率高、准确度高、灵敏度高，其检测限达：2.2×104particles/μl，与本领域现有技术的检测限：》105particles/μl相比，检测限更低，提高了一个数量级，为分离和超灵敏检测ev膜蛋白提供了一个新的策略，有望作为一个有效的工具进一步应用到其他疾病来源ev的分离与标志物检测，在早期临床诊断疾病方面具有很大的潜力。34.同时，本发明基于金属有机框架材料、双适配体识别和滚环扩增技术，建立了一种基于金属有机骨架联合两种核酸适配体分别与ev膜表面蛋白特异性结合，分别实现对ev特异性识别分离和信号放大以实现ev灵敏准确检测的新方法，该方法简化了ev的分离富集步骤且效率高，当两种适配体同时锚定在外泌体上，消除了样品中其他杂质带来的污染，提高检测的准确度，实现ev的高灵敏分析。附图说明35.图1为uio-66-nh2和mof@aptcd63的表征结果图(uio-66-nh2(a)和mof@cd63-apt(b)的sem图像；uio-66-nh2(c)和mof@cd63-apt(d)的tem图像；mapping下分析uio-66-nh2所含zr元素(e)；uio-66-nh2(f红色)和mof@cd63-apt(f蓝色)的zeta电位)；36.图2为ccrf-cem细胞分泌ev的表征(a)和tem(b)下mof@cd63-apt分离ev的效果图(比例尺：100nm)；37.图3为rca反应可行性验证结果图(a不同反应条件下rca反应聚丙烯凝胶电泳分析，b存在引物(绿色线)和不存在引物(橙色线)条件下的荧光光谱图)；38.图4为rca反应条件的优化结果图(a加入环形模板浓度的优化，b加入聚合酶量的优化，c反应时间的优化)；39.图5为对不同ev浓度的性能检测结果图(a不同外泌体浓度的荧光强度，b荧光强度与ev浓度的线性关系)。具体实施方式40.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
：常规试剂、方法和设备。41.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。42.实施例1细胞外囊泡载体及核酸适配体的制备43.1、金属有机骨架uio-66-nh2(mof)的制备44.首先我们合成含有丰富zr金属的纳米级mof材料uio-66-nh2作为分离ev的载体，合成方法：首先将四氯化锆(42mg)和二氨基对苯二甲酸(33mg)分别溶于2.5ml和1ml的dmf中，将上述溶液超声混合后，再加入1.5mlch3cooh作为调节剂，在120℃下反应12h，得到uio纳米颗粒。将得到的uio纳米颗粒用dmf和ch3ch2oh分别洗涤2次，最后分散在ch3ch2oh中，每次使用前重新定量至1.5mg/ml。45.2、核酸适配体的合成46.根据现有文献报道(xia,y.k.；liu,m.m.；wang,l.l.；yan,a.；he,w.h.；chen,m.；lan,j.m.；xu,j.x.；guan,l.h.；chen,j.h.,avisibleandcolorimetricaptasensorbasedondna-cappedsingle-walledcarbonnanotubesfordetectionofexosomes.biosensors&bioelectronics2017,92,8-15.；luo,y.l.；shiao,y.s.；huang,y.f.,releaseofphotoactivatabledrugsfromplasmonicnanoparticlesfortargetedcancertherapy.acsnano2011,5(10),7796-7804.)设计合成针对急性淋巴细胞白血病细胞(ccrf-cem细胞)ev表面两种特异性表达蛋白cd63和ptk7的适配体cd63(cd63-apt)和适配体ptk7(ptk7-apt)，其中使用的序列如下表1所示。47.表1合成适配体cd63-apt和ptk7-apt的序列表[0048][0049]3、ccrf-cem细胞培养及外泌体提取[0050]ccrf-cem细胞用ccrf-cem细胞专用培养基培养，所有细胞均在5％co2、37℃条件下培养，当细胞培养至70％时，为了让细胞产生ev，先将细胞转移至1640基础培养基中12h，再将细胞转移至含有去除ev的1％fbs培养基中继续培养36-48h。之后，分别以300g的离心力离心10min、2000g离心20min、10000g离心30min去除细胞碎片及杂质，再以13w5kg离心70min，最后将收集的ev重悬在pbs中并储存在-80℃以备后续实施例2-4中使用。[0051]实施例2uio-66-nh2和mof@cd63-apt、mof@cd63-apt@ev的性能表征[0052]1、uio的性能表征[0053]将实施例1中所制备的细胞外囊泡载体uio-66-nh2的形貌和结构分别通过扫描电镜(sem)、透射电子显微镜(tem)和元素分析(mapping)进行了表征。[0054]结果如图1a和图1c所示，显示uio-66-nh2纳米粒子的八面体形状均匀，尺寸约为100nm；在元素分析可显示zr元素的存在，在其八面体结构表面含有有丰富的zr4+(图1e)。表明uio-66-nh2具有良好的稳定性，其八面体结构表面含有有丰富的zr4+，鉴于zr4+与po43-之间强的结合能力，我们成功制备uio-66-nh2并对其进行核酸适配体功能化以捕获ev。[0055]2、mof@cd63-apt的性能表征[0056]将制备好的uio-66-nh2与cd63-apt寡核苷酸序列共同孵育12h，使末端修饰磷酸盐的适配体(cd63-apt)与uio-66-nh2中的zr共价结合从而固定在uio-66-nh2表面，通过扫描电镜(sem)和透射电子显微镜(tem)对功能化后的uio-66-nh2形态进行表征，并检测zeta电位。[0057]结果如图1b和图1d所示，扫描电镜和透射电子显微镜显示uio-66-nh2的形态进行表征较功能化之前，形态稳定未发生变化，在适配体功能化uio-66-nh2之后，由于带负电的dna的存在，zeta电位由正变为负(图1f)。以上结果表明，适配体探针1已被成功修饰到uio-66-nh2材料上。[0058]3、mof@cd63-apt@ev的性能表征[0059]将适配体与uio-66-nh2结合构建平台，目的使通过适配体与ev表面跨膜膜蛋白cd63的特异性结合来识别、富集并分离ev，为了验证这种方法的可行性，我们将mof@cd63-apt与ev混合15min后离心洗涤，重悬后制备样品，通过透射电子显微镜(tem)观察该平台结合ev的效果。[0060]结果如图2所示，可以通过tem观察到ev的存在(图2a)，证实ev被cd63-apt捕获富集并被成功分离(图2b)，可以进行下游的扩增及荧光检测。[0061]实施例3rca反应的可行性验证及反应条件优化[0062]1、可行性验证[0063]使用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证采用引物链(ptk7-apt)进行rca反应的可行性。实验设置条件以及具体方法如下：[0064]对一系列反应体系进行非变性10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)以观察rca反应产物的生成。其中实验的体系为：环形模板+dntps+phi29聚合酶+ptk7-apt，环形模板+dntps+phi29聚合酶，dntps+phi29聚合酶+ptk7-apt，其中环形模板浓度为50nm，dntps为1μl，phi29聚合酶浓度为1u/μl，ptk7-apt浓度为100nm，总反应体积为10μl。将上述各反应体系在37℃条件下孵育2小时后，各取10μl(其中含有1×loadingbuffer)的溶液分别加样至聚丙烯酰胺凝胶中，在250v、20min的反应条件下进行电泳后将胶转移至含有1×4sgelred的生理盐水中染色20min后，在凝胶成像仪上进行成像观察结果。[0065]结果如图3a所示，仅仅孵育环形模板、聚合酶、扩增原料没有引物链存在时，可以观察到微弱的迁移率低的扩增产物条带，表明被封闭的环形模板并不能很好地引发rca扩增，其信号主要来自于rca的非特异性扩增。然而当引物链和环形模板、聚合酶、扩增原料同时存在时，可以明显地观察到一个明亮迁移率很低的扩增产物条带，表明引物链(ptk7-apt)可以驱动产生rca扩增。[0066]同时rca产物链上存在大量g四倍体产生信号的策略通过荧光实验进一步证明(图3b)，当存在环形模板、扩增原料和聚合酶而缺乏引物时，有少量荧光信号出现，只有当环形模板、引物链、扩增原料、聚合酶同时存在时，才可以发生rca扩增反应产生明显的荧光信号。[0067]2、反应条件优化[0068]在rca反应原理可行的基础上，为提高检测的性能，我们对环形模板浓度、phi29聚合酶量、反应时间进行了条件优化，以期达到最佳的检测效果。[0069]首先是环形模板浓度的优化，在rca反应体系中固定其它反应条件用荧光实验验证，(图4a：1-5)表示环形模板浓度分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm，可以看到第2组信噪比(f/f0)最高，f是指目标物存在时的荧光强度，f0是没有目标物时的空白信号强度，f/f0的值越高则表明检测的效果越好。同样固定反应体系中其它反应条件，加入不同量的phi29聚合酶，如图4b所示，当phi29加入量达到2.0u时，f/f0达到最大值，因此，2.0uphi29被选为最适酶量。另外，rca的反应时间对于单链dna产物的长度起决定性作用。如图4c在反应进行2h时f/f0达到最大，而过长的反应时间使得背景扩增增多，导致信噪比下降，因此选择最佳的反应时间为2h。[0070]实施例4方法的可行性及相对于ev浓度的检测性能[0071]1、可行性分析[0072]在实施例3的最优扩增条件下，为了验证该方法对ev检测的可行性，在溶液水平逐步完成：1.mof共轭cd63-apt，利用适配体与ev表面跨膜蛋白cd63的特异性结合富集分离ev；2.进一步ptk7-apt与ev表面的另一跨膜蛋白ptk7特异性结合，使其作为引物；3.在环形模板、聚合酶和扩增原料存在的条件下，进行rca扩增反应；4.扩增反应所得到的产物链含有大量的g四倍体重复单元，该单元能够结合tht后产生荧光，使用荧光分光光度计进行测量。[0073]结果显示，当ev不存在时，荧光背景低没有明显变化，但加入目标ev后，可以观察到在483nm处荧光明显增强，这表明ev被成功分离并结合了ptk7-apt引发了rca反应，tht与扩增产物链的g四倍体结合有荧光产生，结果表明该方法可以用于外泌体的检测。[0074]2、对不同ev浓度的性能检测[0075]为了评估该方法对于不同ev浓度的检测性能，将该方法用于检测pbs缓冲溶液中不同浓度的外泌体，实验条件：分别在1.5ml的ep管中加入200μl浓度为1.5mg/ml的uio-66-nh2与100μl浓度为10μm的cd63-apt，室温条件下在摇床上反应12h后，经12800g离心并用水重悬洗涤三次后，获得mof@cd63-apt，将其重新分散在100μldepc水中；分别加入终浓度为0、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、1.5×107、2×107partiles/μl的ccrf-cem外泌体，室温条件下置于摇床上共同孵育15min，通过12800g离心形成的mof@cd63-apt@ev，并用depc水洗涤12800g离心三次以去除未结合的ev；将所得产物重悬至100μldepc水中，加入4μlptk7-apt(1μm)在摇床上孵育15min，用depc水洗涤12800g离心三次以去除未结合的ptk7-apt，得到mof@cd63-apt@ev@ptk7-apt。进行rca反应体系包括：cd63-apt@mof@ev@ptk7-apt，2μl环形模板(2μm)、2μldntp(0.01mm)，4μlphi29polymerase(2uμl-1)，8μlphi29reactionbuffer(10×)，用缓冲液补充至总体加为80μl，在37℃反应2小时，随后加热至80℃持续20min使酶失活，终止反应。温度恢复至室温后，加入2μltht(1m)及缓冲溶液，配置成总体积100μl的反应液，在37℃孵育30min。反应结束后，使用荧光分光光度计进行测量，以430nm为激发光，收集455至600nm的发射光谱。激发光和发射光的狭缝值均为3.0nm。[0076]在rca反应的最佳条件下测定荧光随ccrf-cem分泌的不同浓度的外泌体的变化情况。[0077]结果如图5a所示，随着外泌体浓度的从5×104particles/μl到2×107particles/μl的增加荧光强度也增加，荧光强度与ev浓度之间存在线性关系(图5b)，线性回归方程是：y＝271530.466+0.165x，相关系数(r2)是：0.996。检测限为：2.2×104particles/μl，与本领域现有技术中的检测限：》105particles/μl相比，检测限更低，提高了一个数量级，本发明可实现ev的高灵敏分析。[0078]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种基于双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于，包括表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd 63的适配体1的金属有机骨架，特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk 7的适配体2。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd 63的适配体1的金属有机骨架的制备方法为将金属有机骨架与特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd 63的适配体1共同孵育，即得。3.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述金属有机骨架为uio-66-nh2。4.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd 63的适配体1为cd63-apt，其核酸序列为：ttt ttt cac ccc acc tcg ctc ccg tga cac taa tgc tat t。5.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk7的适配体2为ptk7-apt，其核酸序列为：atc taa ctg ctg cgc cgc cgg gaa aat act gta cgg tta gac ccc gct ctg cga ggg ta。6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包含rca反应所需试剂。7.权利要求1～6任一所述试剂盒在非疾病诊断治疗目的分离并检测细胞外囊泡中的应用。8.一种非疾病诊断治疗目的识别分离并检测细胞外囊泡的方法，其特征在于，将表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白cd 63的适配体1的金属有机骨架与待测样品共孵，富集待测样品中的细胞外囊泡，离心后取沉淀重悬，再加入特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白ptk 7的适配体2共同孵育，以适配体2为引物进行rca反应。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述细胞外囊泡为表面特异性表达蛋白cd 63和ptk 7的细胞外囊泡。10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述rca反应采用的模板浓度25～200nm，聚合酶为1.0～3.0u phi 29，反应时间1～3h。

技术总结
本发明公开一种基于双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用。本发明基于金属有机骨架联合双适配体识别和分离并检测细胞外囊泡的试剂盒，包括表面修饰有特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白CD 63的适配体1的金属有机骨架，特异性识别细胞外囊泡表面特异性表达蛋白PTK 7的适配体2。本发明通过双适配体结合EV表面膜蛋白，利用MOF与适配体1结合实现对EV的分离，再利用适配体2作为引物进行RCA扩增，进行信号放大，实现对EV的检测。本发明提供的方法的分离效率、准确度和灵敏度均显著提高，检测限达2.2


技术研发人员：李珉珉 郭芳芳 陈俊 陈金香
受保护的技术使用者：暨南大学附属第一医院（广州华侨医院）
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/8/5