一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌GB99的制作方法

一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌gb99
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌gb99。


背景技术：

2.便秘是临床当中一种非常常见的症状，多长期持续存在，症状扰人，严重影响了人们的身体健康和生活质量。大量的研究发现便秘主要是因肠道菌群失调，肠道功能紊乱而引起。动物研究和临床研究都显示，乳杆菌有助于预防和治疗便秘等胃肠道疾病。
3.鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)，细菌分类学属于乳杆菌属，是健康人体肠道中的优势菌，肠道黏着率高，定植能力强，具有拮抗致病菌、调节肠道菌群、改善肠道功能、增强免疫、预防癌症等益生功能。
4.由于人体胃肠道的特殊环境，一般的有益菌往往会由于对胃肠液耐受性不强而被杀死，不能进入肠道，导致无法真正达到调节肠道菌群，实现通便的效果。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明采用了以下技术方案：
6.一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌gb99，鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)gb99，于2021年8月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61893。
7.本发明的有益效果：鼠李糖乳杆菌gb99可用于发酵乳、膳食补充剂等产品中；鼠李糖乳杆菌gb99对胃肠液具有较好的耐受性；鼠李糖乳杆菌gb99对排便功能具有良好的改善效果，并且不会对人体产生不良影响。
具体实施方式
8.本发明实施例中，一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌gb99，鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)gb99，于2021年8月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:61893。
9.该鼠李糖乳杆菌gb99可用于发酵乳、膳食补充剂等产品中；
10.鼠李糖乳杆菌gb99的生物学特征：
11.(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
12.(2)菌落特征：呈乳白色、圆形凸起、不透明、边缘整齐，表面光滑湿润。
13.(3)生长特性：在37℃恒温条件下，在mrs培养基培养约14h到达对数末期。
14.实施例1：本实施例为上述一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌gb99的主要分离、鉴定方式，主要包括以下步骤：
15.s1：选用添加有1％制霉菌素的lbs培养基备用；对健康人员的新鲜粪便进行采样，用粪便取样器对样品进行取样取1g粪便，取样过程戴手套消毒操作，避免接触样品以防污染；并在梯度稀释后涂于添加有1％制霉菌素的lbs培养基上；并置于37℃的恒温培养箱中，
培养48h；
16.s2：培养后，根据lbs培养基上菌落的颜色、大小、边缘形状，用接种环挑取菌落划线纯化；
17.s3：将划线纯化后所得的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶分析；保留革兰氏染色阳性杆菌和过氧化氢酶阴性菌；
18.s4：保留的革兰氏染色阳性杆菌和过氧化氢酶阴性菌经16srdna序列分析与api鉴定系统鉴定为鼠李糖乳杆菌。
19.实施例2：鼠李糖乳杆菌gb99对模拟胃肠液的耐受性实验：
20.将冷冻保存的鼠李糖乳杆菌gb99接种于mrs平板中，在温度37℃培养48h，再经mrs培养液传代培养2～3次；
21.取1ml鼠李糖乳杆菌gb99的培养液，与9.0ml ph 2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、ph＝2.5的mrs培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、1h、2h时取样，用mrs琼脂培养基倾注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
22.取1ml鼠李糖乳杆菌gb99的培养液加入9ml人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、ph＝8.0的mrs培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、1h、2h、3h和4h时取样，用mrs琼脂培养基倾注进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
23.存活率是以该培养液在取样时的活菌数与在第0h时活菌数的比值计算，以％表示。
24.试验结果如表1和表2所示。结果表明，鼠李糖乳杆菌gb99对人工胃肠液具有较好的耐受性。
[0025][0026]
表1为鼠李糖乳杆菌gb99在人工模拟胃液中的耐受性
[0027][0028][0029]
表2为鼠李糖乳杆菌gb99在人工模拟肠液中的耐受性。
[0030]
实施例3：鼠李糖乳杆菌gb99无毒副作用检验：
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取体重29～32g左右的健康雄性km小鼠12只，适应环境一周后，每日给予鼠李糖乳杆菌gb99(菌数大于109cfu/ml)灌胃一次(每次灌胃0.2ml)，观察一周，记录死亡和体重情
况。
[0032]
试验结果见表3。结果表明，喂食浓度大于109cfu/ml的鼠李糖乳杆菌gb99未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
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表3为小鼠体重变化及死亡情况。
[0035]
实施例4：鼠李糖乳杆菌gb99对通便功能的影响试验——对小鼠排便功能的影响：
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试验动物：km雄性小鼠，spf级；
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试验地点：广东省医学实验动物中心；
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试验方法：50只km小鼠检疫合格后，按体重随机分为阴性对照组、模型对照组、鼠李糖乳杆菌gb99低、中、高剂量组，共5组，每组10只。动物分组后按20ml/kg体重灌胃给予受试物，各受试物组分别灌胃相应浓度鼠李糖乳杆菌gb99，阴性对照组、模型对照组灌胃去离水子，1次/日，连续7天(d1～d7)，动物分组及计量设计见表4；给受试样品7天后，各组小鼠禁食不禁水约16小时；模型对照组、鼠李糖乳杆菌gb99低、中、高剂量组按10ml/kg体重灌胃给予0.7mg/ml的洛哌丁胺溶液，剂量为7mg/kg体重，阴性对照组灌胃给予等体积的去离子水；给予洛哌丁胺后0.5小时后，鼠李糖乳杆菌gb99低、中、高剂量组分别按20ml/kg体重给予含相应受试样品的墨汁，阴性对照组和模型对照组灌胃给予等体积的墨汁(浓度为25％)。从灌墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时间、6小时内排黑便粒数及重量。试验期间每天观察动物的一般临床情况1次，至试验结束。
[0039][0040]
表4为动物分组及剂量设计。
[0041]
试验结果
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一般状态：试验期间，各组小鼠观察均未见异常。
[0043]
粪便(见表5)：与阴性对照组比较，模型对照组小鼠排黑便时间延长、黑便粒数减少、黑便重量降低，均具有统计学差异(p《0.01)。与模型对照组比较，鼠李糖乳杆菌gb99高
剂量组小鼠首粒排黑便时间缩短、黑便粒数增加、黑便重量升高，均具有统计学差异(p《0.01或0.05)；鼠李糖乳杆菌gb99低、中剂量组首粒排黑便时间、黑便粒数和黑便重量均无统计学差异(p》0.05)。
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表5为鼠李糖乳杆菌gb99对小鼠粪便的影响
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注：与阴性对照组相比，**p《0.01；与模型对照组比较，
▲
p《0.05，
▲▲
p《0.01。
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试验结论：模型对照组小鼠较阴性对照组排黑便时间延长、黑便粒数减少、黑便重量降低，提示便秘模型成功。鼠李糖乳杆菌gb99高剂量组小鼠首粒排黑便时间明显短于模型对照组，黑便粒数、黑便重量明显高于模型对照组，可判定此三项结果指标阳性，进而可判定鼠李糖乳杆菌gb99对小鼠排便功能的影响试验结果阳性。
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对所公开的实施例的上述说明，使本领域技术人员能够实现或使用本技术。对这些实施例的多种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌gb99，其特征在于，鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)gb99，于2021年8月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61893。

技术总结
本发明公开了一株具有通便功能的鼠李糖乳杆菌GB99，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GB99，于2021年8月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61893，鼠李糖乳杆菌GB99可用于发酵乳、膳食补充剂等产品中；鼠李糖乳杆菌GB99对胃肠液具有较好的耐受性；鼠李糖乳杆菌GB99对排便功能具有良好的改善效果，并且不会对人体产生不良影响。响。


技术研发人员：陈淑珺
受保护的技术使用者：广东辉阳生物科技有限公司
技术研发日：2022.10.13
技术公布日：2023/8/5