一种复制型高效引导编辑系统

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制型高效引导编辑(pe2)系统。


背景技术：

2.基因编辑技术是近年来发展起来的新兴技术，其能直接对生物基因组dna进行编辑，目前已广泛应用生命科学的各个领域，具有广阔的发展前景。随着技术的发展与实际应用的需求，人们对基因编辑技术的精准性、效率与安全性要求愈来愈高，如大部分基因治疗研究中，必须使用更精准、更高效、更安全的基因编辑系统才能实现，然而现有的基因编辑技术很难同时满足上述需求。
3.目前开发的精确编辑系统主要包括crispr系统介导的基因敲入技术、单碱基编辑技术与引导编辑系统。以上几种方法均具有许多不足，如crispr介导的基因敲入技术，其虽然能够实现dna的精确编辑，但是编辑效率较低且无法应用于原代细胞中。此外，由于该技术是基于dna双链断裂的修复系统，所以会产生大量的非目标突变，进而引起安全风险；单碱基编辑技术是美国david liu课题组开发的一种基于crispr系统的碱基编辑工具，该种技术可在不造成dna双链断裂的情况下实现碱基编辑，但是该方法可改变的碱基种类有限，编辑窗口较大，无法实现特定碱基的精确突变，此外由于受到sgrna设计所需pam序列的限制，大部分位点不能被该方法编辑；prime editing基因编辑系统同样是david liu课题组开发的一种新型编辑系统，该系统通过将cas9切刻酶与逆转录酶融合表达，在prime editing guide rna(pegrna)的引导下最终实现靶位点的精确编辑。该技术可实现包括12种碱基替换、小片段插入和缺失等的不同编辑类型，然而目前研究显示，其仍然具有效率较低等缺点。
4.但鉴于pe编辑系统的巨大潜力，科学家尝试采用多种方法改进pe编辑系统的效率，主要方法包括：pe1利用cas9切刻酶(h840a)和moloney murine leukemia virus(m-mlv)逆转录酶构成，虽可以精确实现设计的基因组编辑，但在哺乳动物细胞上的编辑效率较低。因此，研究人员构建了pe2，主要是通过在m-mlv逆转录酶中引入5个氨基酸改变进而提高靶向位点的编辑效率。然而研究显示，这两种方法提高效率仍然有限；随后研究人员构建了pe3/pe3b，该系统通过共表达新的sgrna靶向非编辑链进而提高编辑效率。相较pe2系统，pe3虽然具有较高的效率，但是其需要额外转入1条sgrna，会增加表达载体的递送难度.此外，pe3系统会形成更多的非目标突变进而为未来的应用带来安全风险。综上可见，目前基因编辑领域仍然缺乏一种同时兼备效率高、非目标突变少，精准性强的基因编辑系统。
5.此前研究表明，人类疱疹病毒(ebv)可以在宿主细胞中以附加体的形式存在，这种在细胞的维持主要依赖ebna1蛋白和orip组合与dna形成的加合物。因此，当把ebna1-orip元件用于载体构建后，所构建载体可以在细胞中以游离体的形式稳定存在，并随着细胞周期进行复制，这显著增加了外源基因的表达时间和强度。
6.目前尚未有将附加体元件用于引导编辑系统表达的相关报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种附加体元件介导的复制型高效引导编辑(pe2)系统。
8.第一方面，本发明要求保护一种用于基因编辑的载体。
9.本发明所要求保护的用于基因编辑的载体，为附加体引导编辑系统载体，所述载体能够表达如下(a1)和(a2)，并含有如下(a3)和(a4)；
10.(a1)由a1)和a2)融合而成的融合蛋白；a1)cas9切刻酶或其变体；a2)反转录酶或其变体；
11.(a2)ebna1蛋白或其突变体ebna1
mut
；
12.(a3)orip元件；
13.(a4)用于插入pegrna编码序列的区域；所述用于插入pegrna编码序列的区域含有插入位点和位于所述插入位点上游的启动子。所述启动子启动所述pegrna编码序列的转录。
14.所述载体可为环形载体。
15.在(a1)中，所述cas9切刻酶可为cas9(h840a)。所述反转录酶可为m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)。
16.进一步地，所述cas9(h840a)的氨基酸序列如seq id no.1的第1-1367位所示。所述m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)的氨基酸序列如seq id no.1的第1401-2091位所示。
17.在(a1)中，在所述融合蛋白中，a1)和a2)之间可由linker连接。
18.进一步地，所述linker的氨基酸序列如seq id no.1的第1368-1400位所示。
19.在(a1)中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
20.在(a2)中，所述ebna1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述ebna1
mut
蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
21.在(a4)中，所述用于插入pegrna编码基因的区域中的所述启动子为ⅱ型启动子或ⅲ型启动子。
22.进一步地，所述ⅲ型启动子如u6启动子；所述ⅱ型启动子如ef1α启动子。
23.在本发明的具体实施方式中，所述u6启动子的序列如seq id no.3的第14634-14874位所示。
24.在(a4)中，所述pegrna与sgrna相比，在3’端多出两段序列(即rt序列和pbs序列)，依次由间隔序列(spacer)、grna骨架序列、rt序列和pbs序列组成。所述间隔序列(spacer)用于识别靶基因上的靶点。所述rt序列为基因组上靶点后的一段反向互补序列，且在其中引入目标突变，作为反转录酶的反转录模板，反转录出dna序列，然后作为修复模板，对基因组dna进行修复。所述pbs序列为引物结合位点，可与断裂的靶dna链3’末端互补以起始逆转录过程。所述rt序列和所述pbs序列的设计方法或原理可参照现有技术中已报道的有关于引导编辑技术(prime editing,pe)中与pegrna的rt序列和pbs序列相关的设计方法或原理。
25.在(a1)中，所述cas9(h840a)的编码基因可如seq id no.3的第715-4815位所示。所述m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)的编码基因可如seq id no.3的第4915-6987位所示。
26.进一步地，所述融合蛋白的编码基因可如seq id no.3的第715-6987位所示。
27.更进一步地，所述融合蛋白的编码基因存在于表达盒1中，所述表达盒1的序列可如seq id no.3的第1-7287位所示。
28.在(a2)中，所述ebna1蛋白的编码基因为seq id no.3的第12136-14241位的反向互补序列。所述ebna1
mut
蛋白的编码基因如seq id no.5所示。
29.在(a3)中，所述orip元件的序列可如seq id no.3的第10224-12013位所示。
30.在(a4)中，所述用于插入pegrna编码序列的区域的序列可如seq id no.3的第14883-15707位所示。
31.通常情况下，所述载体中还含有药物筛选基因和/或报告基因；
32.进一步地，所述药物筛选基因和所述报告基因存在于同一表达盒中，记为表达盒2。
33.在所述表达盒2中，所述药物筛选基因和所述报告基因之间由自切割寡肽编码基因连接。
34.所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2a自切割寡肽。如来自于口蹄疫病毒(fmdv)的f2a肽、来自于马a型鼻炎病毒(erav)的e2a肽、来自于明脉扁刺蛾β四体病毒(thosea asigna virus)的t2a肽、来自于猪捷申病毒-1(ptv-1)的p2a肽、来自于泰勒病毒2a肽或者来自心肌炎病毒的2a肽。
35.在本发明的具体实施方式中，所述自切割寡肽具体为t2a肽。
36.在本发明的具体实施方式中，所述药物筛选基因为puromycin抗性基因(简称puror基因)。所述报告基因为zsgreen报告基因。
37.进一步地，所述puror基因的序列如seq id no.3的第16262-16858位所示。所述zsgreen报告基因的序列如seq id no.3的第16937-17632位所示。
38.更进一步地，所述表达盒2的序列如seq id no. 3的第15723-17632位所示。在本发明的具体实施方式中，所述载体的全序列如seq id no.3所示，或者为将seq id no.3的第13546-13956位删除后的序列。
39.第二方面，本发明要求保护含有前文第一方面所述载体的重组菌或转基因细胞系。
40.第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述载体在如下任一中的应用：
41.(b1)对生物体或生物细胞进行基因编辑；
42.(b2)制备用于对生物体或生物细胞进行基因编辑的产品；
43.(b3)提高对生物体或生物细胞的基因编辑效率；
44.(b4)制备用于提高对生物体或生物细胞的基因编辑效率的产品。
45.第四方面，本发明要求保护一种对生物体或生物细胞进行基因编辑的方法。
46.本发明要求保护的对生物体或生物细胞进行基因编辑的方法，可包括如下步骤：
47.(c1)将针对靶基因的pegrna编码序列插入到前文第一方面所述载体的所述用于插入pegrna编码序列的区域中的所述插入位点处，得到重组载体；
48.(c3)将所述重组载体导入生物体或生物细胞，从而实现对生物体或生物细胞基因组中所述靶基因的编辑。
49.在上述各方面中，所述基因编辑具体可为碱基的定点替换、缺失或插入。包括单碱
基的替换、多碱基的替换、单碱基的缺失、多碱基的缺失、单碱基的插入、多碱基的插入。
50.在本发明中，所述基因编辑具体为针对单基因的编辑。插入到前文第一方面所述载体的所述用于插入pegrna编码序列的区域中的所述插入位点处的pegrna为单一pegrna。
51.本发明提供了一种基于ebna1和orip元件的附加体引导编辑系统的载体构建方法及其在基因组编辑中的应用。此附加体引导编辑系统载体是将u6启动子元件、药物筛选基因puror和荧光蛋白zsgreen以及附着体元件ebna1、orip通过同源重组的方法重组到pcmv-pe2质粒上而构建的。附加体介导的引导编辑系统载体以游离体的形式存在于细胞核外，且可以随着真核生物细胞复制而复制并分配给子代细胞，以非整合的形式稳定长期表达外源基因，实现了在基因组中精确高效进行基因编辑。本发明构建的附加体引导编辑系统载体通过延长编辑时间提高了编辑效率，且避免了外源基因的整合。相比于已有其他系统，其综合了其他系统很难同时兼备的高效，安全，精准特点，为利用引导编辑系统在基因组精准编辑、疾病模型构建和基因治疗等领域的应用奠定基础。
附图说明
52.图1为epipe2载体图谱。
53.图2为pegrna结构组成示意图。
54.图3为epipe2质粒转染hek293t细胞图片。左侧为明场，右侧为荧光图。
55.图4为epipe2载体和pe2载体在rnf2位点不同编辑类型效率随转染时间变化统计和比较折线图。
56.图5为epipe2
mut
载体在hek3位点不同编辑类型效率随转染时间变化统计折线图。del表示碱基缺失，point表示碱基突变，ins表示碱基插入。
具体实施方式
57.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
58.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
59.实施例1、基于ebna1和orip元件的附加体引导编辑系统的单基因编辑载体的构建
60.1、利用限制性内切酶nru1(neb，#r3192v)酶切质粒pcmv-pe2(addgene，#132775)，产生线性化的pcmv-pe2载体作为克隆载体骨架。
61.2、以pcep4(invitrogen，v044-50)质粒作为模板，设计并合成特异性扩增引物orip-f/r和ebna1-f/r，并在引物的5’端添加相对应的20bp的同源臂，同时在orip-f引物上添加nhe1识别位点，在ebna1-r引物上添加asc1识别位点，便于后期改造载体。利用2
×
a8 fasthifi pcr mastermix(艾德莱，pc8201)高保真酶扩增后得到orip片段和ebna1片段。引物序列如表1所示：
62.表1、引物序列
[0063][0064]
注：阴影部分为同源臂，划线部分为酶切位点
[0065]
orip片段pcr反应体系如表2所示：
[0066]
表2、orip片段pcr反应体系
[0067]
试剂体积2
×
a8 fasthifi pcr master mix25μlorip-f1μlorip-r1μlpcep4质粒1ngddh2o补足到50μl
[0068]
pcr程序：98℃3min；98℃10s，58℃15s，72℃100s，30个循环；72℃3min，8℃2min。
[0069]
扩增产物含有orip片段(约2400bp)的序列如seq id no.3的第9708-12129位所示(pcr产物含有orip并且两端带有酶切位点或同源臂序列)。
[0070]
ebna1片段的pcr反应体系如表3所示：
[0071]
表3、ebna1片段的pcr反应体系
[0072]
试剂体积2xa8 fasthifi pcr mastermix25μlebna1-f1μlebna1-r1μlpcep4质粒1ngddh2o补足到50μl
[0073]
pcr程序：98℃3min；98℃10s，58℃15s，72℃100s 30个循环；72℃3min；8℃2min。
[0074]
扩增产物ebna1片段(约2500bp)的序列含有seq id no.3的第12111-14633位所示(pcr产物含有ebna1且两端带有酶切位点或同源臂序列)。
[0075]
3、根据clonexpressmultis one step cloning kit(vazyme，c113-01)重组克隆试剂盒说明将步骤1线性化的pcmv-pe2载体和步骤2扩增得到的orip片段、ebna1片段混合后在37℃反应30min，反应后的产物转化至化学感受态fast-t1(vazyme，c505-02)中，挑取单克隆菌液送至武汉擎科生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，将构建成功的载体命名为pcmv-pe2-pcep4。
[0076]
pcmv-pe2-pcep4的结构描述为：在pcmv-pe2载体的nrui位点处插入seq id no.3的第9708-14633位所示dna片段(orip和ebna1)的重组载体。
[0077]
4、利用asc1(neb，#r0558s)酶切pcmv-pe2-pcep4质粒，产生线性化的pcmv-pe2-pcep4载体作为克隆载体骨架。
[0078]
5、以pu6-pegrna-gg-acceptor(addgege，#132777)质粒作为模板，设计特异性引物pegrna-f1/r1和引物pegrna-f2/r2，在引物5’端添加相对应的20bp的同源臂。以pklv2-u6grna5(bbsi)-pgkpuro2azsg-w(addgene，#67975)质粒作为模板，设计特异性引物pklv2-f/r，同样添加相对应的20bp同源序列。其中，pegrna-r1、pegrna-f2/r2以及pklv2-f引物同源臂上都包含aar1(thermo scientific，er1581)识别位点，用于后期酶切连接pegrna；pegrna-f1引物上保留了asc1酶切切点。利用kapa hifi hotstartreadymix pcr kit(roche，kk2602)高保真酶扩增获得u6启动子片段、mrfp1片段以及pgk-puro-t2a-zsgreen片段。引物序列如表4所示：
[0079]
表4、引物序列
[0080][0081]
注：阴影部分为同源臂，划线部分为酶切位点。
[0082]
u6启动子片段和mrfp1的pcr反应体系如表5所示：
[0083]
表5、u6片段和mrfp1的pcr反应体系
[0084]
试剂体积kapa hifi hotstartreadymix pcr kit25μl正向引物f1μl反向引物r1μlpu6-pegrna-gg-acceptor质粒1ngddh2o补充到50μl
[0085]
注：表4中的引物pegrna-f1/r1用于扩增u6启动子片段，引物pegrna-f2/r2用于扩增mrfp1片段。
[0086]
pcr程序：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃15s 30个循环；72℃1min；16℃1min。
[0087]
扩增产物含有u6启动子的片段(约290bp)的序列如seq id no.3的第14608-14898位所示(pcr产物含有u6启动子且两端带有酶切位点或同源臂序列)。
[0088]
扩增产物含mrfp1的片段(约840bp)的序列如seq id no.3的第14879-15722位所示(pcr产物含有mrfp1且两端带有酶切位点或同源臂序列)。
[0089]
pgk-puro-t2a-zsgreen片段的pcr反应体系如表6所示：
[0090]
表6、pgk-puro-t2a-zsgreen片段的pcr反应体系
[0091]
试剂体积kapa hifi hotstartreadymix pcr kit25μlpklv2-f1μl
pklv2-r1μlpklv2-u6grna5(bbsi)-pgkpuro2azsg-w质粒1ngddh2o补充到50μl
[0092]
pcr程序：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃15s 30个循环；72℃1min；16℃1min。
[0093]
扩增产物含pgk-puro-t2a-zsgreen的片段(约1950bp)的序列如seq id no.3的第15703-17653位所示。
[0094]
6、根据clonexpressmultis one step cloning kit(vazyme，c113-01)重组克隆试剂盒说明将步骤4线性化的pcmv-pe2-pcep4载体和步骤5扩增得到的u6启动子片段、mrfp1片段、pgk-puro-t2a-zsgreen片段混合后在37℃反应30min，反应后的产物转化至化学感受态fast-t1(vazyme，c505-02)中，挑取单克隆菌液送至武汉擎科生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，将构建成功的载体命名为epipe2。载体图谱见图1。
[0095]
epipe2载体全序列如seq id no.3所示。其中，第715-7287位为融合蛋白的编码基因(第715-4815位为cas9(h840a)的编码基因，第4915-6987位为m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)的编码基因)；第10224-12013位为orip元件；第12136-14241位为ebna1蛋白的编码基因的反向互补序列；第14883-15707位为用于插入pegrna编码序列。
[0096]
cas9(h840a)与m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0097]
ebna1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0098]
7、从david liu文章“search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor dna”中选择rnf2-+6gtoa、rnf2-+1gtains、rnf2-del3-5gag编辑的pegrna(编码序列如表7所示)，pegrna结构组成如图2所示。
[0099]
表7、pegrna的编码序列
[0100][0101][0102]
注：表中各pegrna均是针对rnf2位点。各pegrna具体编码序列中三个
“‑”
用于间隔pegrna结构的四个组成部分。
[0103]
将上述pegrna编码序列送至江苏南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到epipe2载体aar1多克隆位点之间(由u6启动子启动pegrna的转录)，分别构建附着体引导编辑系统单基因编辑载体epipe2-rnf2-+6gtoa、epipe2-rnf2-+1gtains、epipe2-rnf2-del3-5gag，
并经测序验证正确。
[0104]
另外，将上述pegrna编码序列送至江苏南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pcmv-pe2(addgene:132775)载体aar1多克隆位点之间(由u6启动子启动pegrna的转录)，分别构建传统单基因编辑载体pe2-rnf2-+6gtoa、pe2-rnf2-+1gtains、pe2-rnf2-del3-5gag，并经测序验证正确。
[0105]
实施例2、基于ebna1和orip元件的附加体引导编辑系统的在hek293t细胞中的应用
[0106]
1、转染前一天，将状态良好的hek293t细胞铺板于6孔板中，加入新鲜培养基培养至细胞汇合度为80-90％时可用于转染。
[0107]
2、按照polyplus公司jetprime转染说明书进行转染，每个六孔板细胞转染2.5μg的质粒，根据表8实验设计转染相应载体，其中epipe2为改进载体，pe2组为传统载体。转染时使用2％的fbs/dmem完全培养基，转染4h后更换为正常的含有10％fbs的培养基。
[0108]
表8、实验组和对照组设计
[0109][0110][0111]
注：对照组的3个载体构建方法具体参见实施例1。
[0112]
3、转染24h后可通过荧光显微镜观察zsgreen荧光蛋白的表达来测试转染效率，之后都使用含有2μg/ml puromycin的10％fbs培养基进行培养，加入puromycin的目的一方面是杀死未成功转染的细胞，起到富集的作用，另一方面是为防止附加体质粒丢失。分别在第3天、第6天、第10天、第15天、第20天和第25天收集部分各组细胞，利用ncbi在线网站设计特异性引物扩增上述位点，所用引物为：rnf2-f和rnf2-r：
[0113]
rnf2-f：5
’‑
tcaggctgtgcagacaaacg-3’；
[0114]
rnf2-r：5
’‑
gccaacatacagaagtcaggaatg-3’。
[0115]
pcr产物送深度测序检测编辑效率，并对结果进行总结分析。
[0116]
4、实验结果
[0117]
结果显示：第15天仍能检测到gfp的高效表达(图3)，说明质粒在15天仍能稳定存在，此外针对rnf2位点的精准编辑效率，随着编辑时间的推移稳步提升，针对碱基精确替换在第25天效率达到67％，对照组编辑效率为20％；针对碱基精确缺失在第25天最高效率达到了61％，而对照组仅有10％；针对碱基精确插入在第25天最高效率达到了72％，而对照组仅有19％(图4)。同时深度测序结果显示未检测到非目标突变，这些结果说明该方法安全可靠，可显著增加基因精确编辑效率。
[0118]
实施例3、基于ebna1
mut
和orip元件的附加体引导编辑系统的在hek293t细胞中的应用
[0119]
一、于ebna1
mut
和orip元件的附加体引导编辑系统的单基因编辑载体的构建
[0120]
1、参照实施例1构建得到epipe2
mut
载体，其余epipe2载体相比，序列差别仅在于将
其中的ebna1基因编码序列替换为ebna1
mut
基因编码序列(seq id no.5)，即epipe2
mut
载体全序列为将seq id no.3的第13546-13956位删除后所得序列。
[0121]
2、从文章“search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor dna”中选择hek3-+1ctt、hek3-del1-3、hek3-+1his6ins编辑的pegrna(编码序列如表9所示)。
[0122]
表9、pegrna的编码序列
[0123][0124][0125]
注：表中各pegrna均是针对hek3位点。
[0126]
二、基于ebna1
mut
和orip元件的附加体引导编辑系统的在hek293t细胞中的应用
[0127]
1、转染前一天，将状态良好的hek293t细胞铺板于6孔板中，加入新鲜培养基培养至细胞汇合度为80-90％时可用于转染。
[0128]
2、按照polyplus公司jetprime转染说明书进行转染，每个六孔板细胞转染2.5μg的质粒，根据表10实验设计转染相应载体，转染时使用2％的fbs/dmem完全培养基，转染4h后更换为正常的含有10％fbs的培养基。
[0129]
表10、实验设计
[0130]
实验组(epipe2
mut
)epipe2
mut-hek3-+1cttinsepipe2
mut-hek3-del1-5epipe2
mut-hek3-+2gtoc
[0131]
3、转染24h后可通过荧光显微镜观察zsgreen荧光蛋白的表达来测试转染效率，之后都使用含有2μg/ml puromycin的10％fbs培养基进行培养，加入puromycin的目的一方面是杀死未成功转染的细胞，起到富集的作用，另一方面是为防止附加体质粒丢失。分别在第3天、第6天、第10天、第15天、第20天和第25天收集部分各组细胞，利用ncbi在线网站设计特异性引物扩增上述位点，所用引物为：
[0132]
hek3-f：5
’‑
ccaaacttgtcaaccagtatccc-3’；
[0133]
hek3-r：5
’‑
agggatcccagggaaacgc-3’。
[0134]
pcr产物送深度测序检测编辑效率，并对结果进行总结分析。
[0135]
4、实验结果
[0136]
结果显示：从转染后至第20天，三种类型的编辑效率都在不断提升(图5)，说明质粒在20天仍能稳定存在。此外针对hek3位点的精准编辑效率，随着编辑时间的推移稳步提升，在第20天时，碱基突变效率达到37.3％、碱基插入效率达到68.3％、碱基删除效率达到71.85％。同时深度测序结果显示未检测到非目标突变，这些结果说明该方法安全可靠，可显著增加基因精确编辑效率。
[0137]
本发明将pe2编辑系统与ebna1-orip序列的附加体载体相结合，构建出一种新型的附加体元件介导的prime editing高效编辑系统，结果显示经改造后的系统可大幅度提高基因精确编辑效率。此外该系统未检测到非目标突变。相比于已有其他系统，其综合了其他系统很难同时兼备的高效，安全，精准特点，具有极大的应用前景。
[0138]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种用于基因编辑的载体，其特征在于：所述载体能够表达如下(a1)和(a2)，并含有如下(a3)和(a4)；(a1)由a1)和a2)融合而成的融合蛋白；a1)cas9切刻酶或其变体；a2)反转录酶或其变体；(a2)ebna1蛋白或其突变体ebna1
mut
；(a3)orip元件；(a4)用于插入pegrna编码序列的区域；所述用于插入pegrna编码序列的区域含有插入位点和位于所述插入位点上游的启动子。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述cas9切刻酶为cas9(h840a)；进一步地，所述cas9(h840a)的氨基酸序列如seq id no.1的第1-1367位所示；和/或所述反转录酶为m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)；进一步地，所述m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)的氨基酸序列如seq id no.1的第1401-2091位所示；和/或在所述融合蛋白中，a1)和a2)之间由linker连接；进一步地，所述linker的氨基酸序列如seq id no.1的第1368-1400位所示；和/或所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；和/或所述ebna1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述ebna1
mut
蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示；和/或所述用于插入pegrna编码基因的区域中的所述启动子为ⅱ型启动子或ⅲ型启动子；进一步地，所述ⅲ型启动子为u6启动子；所述ⅱ型启动子为ef1α启动子。3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述cas9(h840a)的编码基因如seq id no.3的第715-4815位所示；和/或所述m-mlv rt(d200n,t306k,w313f,t330p,l603w)的编码基因如seq id no.3的第4915-6987位所示；和/或所述融合蛋白的编码基因如seq id no.3的第715-6987位所示；和/或所述ebna1蛋白的编码基因如seq id no.3的第12136-14241位的反向互补序列；所述ebna1
mut
蛋白的编码序列如seq id no.5所示；和/或所述orip元件的序列如seq id no.3的第10224-12013位所示；和/或所述用于插入pegrna编码基因的区域的序列如seq id no.3的第14883-15707位所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的载体，其特征在于：所述载体中还含有药物筛选基因和/或报告基因；进一步地，所述药物筛选基因和所述报告基因存在于同一表达盒中。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述药物筛选基因为puromycin抗性基因；进一步地，所述puromycin抗性基因的序列如seq id no.3的第16262-16858位所示；和/或所述报告基因为zsgreen报告基因；进一步地，所述zsgreen报告基因的序列如seq id no.3的第16937-17632位所示。6.根据权利要求1-5中任一所述的载体，其特征在于：所述载体的全序列如seq id no.3所示，或者为将seq id no.3的第13546-13956位删除后所得序列。7.含有权利要求1-6中任一所述载体的重组菌或转基因细胞系。8.权利要求1-6中任一所述载体在如下任一中的应用：(b1)对生物体或生物细胞进行基因编辑；(b2)制备用于对生物体或生物细胞进行基因编辑的产品；(b3)提高对生物体或生物细胞的基因编辑效率；(b4)制备用于提高对生物体或生物细胞的基因编辑效率的产品。9.一种对生物体或生物细胞进行基因编辑的方法，包括如下步骤：(c1)将针对靶基因的pegrna编码序列插入到权利要求1-6中任一所述载体的所述用于插入pegrna编码序列的区域中的所述插入位点，得到重组载体；(c3)将所述重组载体导入生物体或生物细胞，从而实现对生物体或生物细胞基因组中所述靶基因的编辑。10.根据权利要求1-9中任一所述的载体或应用或方法，其特征在于：所述基因编辑为定点替换、缺失或插入。

技术总结
本发明公开了一种复制型高效引导编辑编辑系统。本发明提供了一种用于基因编辑的载体，其能够表达由Cas9切刻酶或其变体和反转录酶或其变体融合而成的融合蛋白和EBNA1蛋白或其突变体EBNA1


技术研发人员：阮进学 赵书红 韩晓松 李新云 赵广兴 熊友才 苏寅钰 谢胜松
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/5