具有固定抗凝剂的膜及其生产处理的制作方法

1.本公开涉及示出了降低的血栓形成性的涂有抗凝剂的微孔中空纤维膜。本公开还涉及用于生产该膜的方法以及包括该膜的过滤和/或扩散装置。


背景技术：

2.在体外血液循环中，全身抗凝通常用于防止血液的凝固，即微血栓的形成和血液凝固。肝素是最常用的抗凝剂。使用肝素的全身抗凝与增加的出血风险相关联，而且肝素的价格相当昂贵。因此，非常需要能够固定肝素的膜，因为它们减少甚至消除了对全身剂量的肝素的需要。
3.us2003/0021826a1提出了将抗凝剂以稳定的方式结合到半透性支撑膜的表面，该半透性支撑膜主要由丙烯腈和至少一种阴离子或可阴离子化单体的共聚物组成。抗凝剂可以在体外循环治疗过程中发挥其抗凝活性，而不会浸出到血液或血浆中，并减少患者在体外血液治疗过程中全身使用的抗凝剂的量。旨在与血液或血浆接触的半透性支撑膜的表面连续地涂有携带阳离子基团的阳离子聚合物和抗凝剂，该阳离子基团能与聚丙烯腈(例如聚乙烯亚胺(pei))的阴离子或阴离子基团形成离子键，该抗凝剂携带能够与所述阳离子聚合物(例如肝素)的阳离子基团形成离子键的阴离子基团。
4.us5840190a公开了一种表面改性的生物相容性膜。该膜包含聚砜、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺(pei)。膜的表面通过与生物活性化合物和偶联剂反应进行改性。在工作示例中，使用氰基硼氢化钠作为偶联剂，将被亚硝酸部分降解的肝素共价偶联到膜的表面。
5.ep1024886a1公开了一种复合膜的制造方法，该复合膜在疏水支撑膜上具有亲水涂层，其中疏水支撑膜用反应剂水溶液浸渍，以将反应剂分散在疏水支撑膜的表面上和孔中；并且亲水聚合物通过亲水聚合物和反应剂之间的反应，薄薄地涂覆在疏水支撑膜上。疏水支撑膜包括聚砜或聚醚酰亚胺；亲水聚合物包括藻酸钠、壳聚糖或聚乙烯醇。当壳聚糖用作亲水聚合物时，反应剂是硫酸；反应剂在水溶液中的浓度在0.5％-20％的范围内。
6.us10500549b2公开了一种多层复合透析膜，其包含基于聚砜和至少一种成孔亲水添加剂的基膜，该成孔亲水添加剂是聚乙烯吡咯烷酮、短链二醇、三乙二醇、丙二醇或聚乙二醇/聚环氧乙烷；以及功能层，所述功能层布置在基膜上并且由聚阳离子粘合剂层形成，该聚阳离子粘合剂为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸、聚精氨酸或聚鸟氨酸；和另一聚合聚阴离子层，该聚合聚阴离子是羧基化多糖或硫酸化多糖，该硫酸化多糖选自分子量(mw)为15kda至1mda的硫酸葡聚糖、分子量(mw)为30kda至750kda的硫酸壳聚糖、分子量(mw)为20kda至1mda的硫酸纤维素及其混合物。
7.us2019/076787a1公开了一种形成微孔中空纤维膜的方法，该方法包括通过喷丝头的外环导管挤出聚合物掺合溶液，同时使沉淀流体穿过喷丝头的内部中空芯。该聚合物掺合溶液包含成膜聚合物和可选的亲水聚合物，该成膜聚合物选自聚砜、聚芳基砜、聚芳基醚砜、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈或其共聚物，该亲水聚合物诸如是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇。沉淀流体包含具有有限水溶性的添加剂，诸如聚氨酯、壳聚糖或具有含氧部分的其它含
氮聚合物。如果壳聚糖用作添加剂，则在引入沉淀流体之前，可使用弱酸(诸如乙酸、乙酸酐、乳酸、甲酸或以上的组合)使其质子化。
8.wo2020/144244a1公开了示出了降低的血栓形成性的涂有抗凝剂的微孔中空纤维膜。该中空纤维膜包含以下物质的混合物：i)聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜；ii)聚乙烯吡咯烷酮；和iii)至少一种含铵基团的聚合物，该含铵基团的选自：含铵基团的聚乙烯基吡啶和含铵基团的乙烯吡啶和苯乙烯这两者的共聚物。抗凝剂被接枝到膜的至少一个表面上。
9.wo2007/069983a1涉及用于从哺乳动物血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白的方法。该方法使用包含固定在固体基质上的肝素的装置。制备示例4公开了肝素与胺化聚合物表面上的共价连接。用氧化剂蚀刻聚合物表面，并且用聚胺、聚乙烯亚胺(pei)或壳聚糖处理，并且通过与肝素的离子交联进一步稳定。
10.林哈特
·
罗伯特等：“肝素的固定化：方法和应用”，《药物化学》的当前主题，第8卷，第2期，2008-01-01，第80-100页，研究和比较了已被用于肝素固定化的各种技术以及这些固定化肝素的应用。公开了壳聚糖作为存在于基质表面上的反应性基团和肝素分子之间的连接体的用途。首先用臭氧处理聚砜膜的表面，然后用含fesc4的丙烯酸(aa)水溶液处理，使其在表面上产生羧基，用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)将壳聚糖分子偶联到羧基上，随后用戊二醛(ga)将肝素偶联到壳聚糖分子。
11.现在已经发现，像肝素这样的抗凝剂可以固定在由包含聚醚砜、聚乙烯吡咯烷酮和壳聚糖的纺丝溶液制备的膜上。所得的涂有肝素的微孔中空纤维膜呈现出降低的血栓形成性。包括涂有肝素的膜的过滤和/或扩散装置减少或甚至消除了体外血液循环中全身抗凝的需要。


技术实现要素：

12.本公开提供了其上固定有抗凝剂的多孔中空纤维膜。该膜包含i)聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜；ii)聚乙烯吡咯烷酮；和iii)壳聚糖。本公开还提供了一种制备其上固定有抗凝剂的多孔中空纤维膜的方法。本公开还提供了包括其上固定有抗凝剂的多孔中空纤维膜的过滤和/或扩散装置。过滤和/或扩散装置(例如血液透析器)可用于血液的体外处理(例如血液透析、血液透析过滤和血液过滤)。
具体实施方式
13.在本发明一方面，提供了其上固定有抗凝剂的多孔中空纤维膜。该膜包含以下物质的混合物：i)聚砜(psu)、聚醚砜(pesu)或聚芳醚砜(pesu)；ii)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，和iii)壳聚糖。
14.合适的聚砜的示例包括重均分子量mw(通过gpc测定)为约40,000da至80,000da的聚砜。在一个实施方式中，使用重均分子量mw在45kda至65kda范围内的聚砜。一个示例是重均分子量mw为52kda(通过gpc测定)且多分散性mw/mn为3.5的聚砜。另一个示例是重均分子量mw为60kda(通过gpc测定)且多分散性mw/mn为3.7的聚砜。
15.合适的聚醚砜的示例包括重均分子量mw(通过gpc测定)为约40,000kda至10,0000da的聚醚砜。在一个实施方式中，使用重均分子量mw在50kda至60kda范围内的聚醚砜。一个示例是重均分子量mw为58kda(通过gpc测定)且多分散性mw/mn为3.3的聚醚砜。在另一
个实施方式中，使用重均分子量mw在65kda至80kda范围内的聚醚砜。一个示例是重均分子量mw为75kda(通过gpc测定)且多分散性mw/mn为3.4的聚醚砜。在再一个实施方式中，使用重均分子量mw在80kda至100kda范围内的聚醚砜。一个示例是重均分子量mw为92kda(由gdc测定)且多分散性mw/mn为3.0的聚醚砜。
16.合适的聚乙烯吡咯烷酮包括重均分子量mw在50kda至2,000kda范围内的乙烯基吡咯烷酮的均聚物。这些均聚物的数均分子量mn通常在14kda至375kda的范围内。用于制备本发明的膜的合适的聚乙烯吡咯烷酮的示例分别是k30，k85，k90，和k90hm，它们均可从巴斯夫公司获得。
17.本公开的多孔中空纤维膜的一个实施方式包括重均分子量mw为约1,100kda；数均分子量mn为约250kda的聚乙烯吡咯烷酮均聚物。
18.本公开的多孔中空纤维膜的进一步的实施方式还包括重均分子量mw为约1,400kda；数均分子量mn为约325kda的聚乙烯吡咯烷酮均聚物。
19.壳聚糖是由随机分布的β-(1
→
4)-连接d-氨基葡萄糖(脱乙酰化单元)和n-乙酰基-d-氨基葡萄糖(乙酰化单元)组成的线性多糖。壳聚糖是通过甲壳素的脱乙酰化而商业化生产的，甲壳素是甲壳动物(诸如蟹和虾)外骨骼和真菌的细胞壁的结构元素。脱乙酰度(％dd)可通过nmr光谱测定，市售壳聚糖的脱乙酰度范围为60％至100％。商业生产的壳聚糖的重均分子量mw通常在3kda和400kda之间的范围中。
20.本公开的多孔中空纤维膜的一个实施方式包括脱乙酰度为至少75％的壳聚糖，即壳聚糖的羟基至多25％被乙酰化。另一个实施方式包含脱乙酰度为至少80％，例如至少90％，或甚至至少95％的壳聚糖。
21.本公开的多孔中空纤维膜的一个实施方式包含具有重均分子量mw(通过gpc分析测定)在5kda至375kda，例如50kda至190kda范围内的壳聚糖。
22.在一个实施方式中，本公开的多孔中空纤维膜包含相对于多孔中空纤维膜的总重量为0.1wt.％至5wt.％的壳聚糖。在进一步的实施方式中，本公开的多孔中空纤维膜包含相对于多孔中空纤维膜的总重量为0.5wt.％至3wt.％的壳聚糖。
23.本公开的中空纤维膜具有对称壁结构或非对称壁结构。在一个实施方式中，膜壁具有对称的海绵结构。在另一个实施方式中，膜壁具有非对称的海绵结构，即中空纤维壁中的孔的尺寸从膜的内表面向外表面增加。在该处理的另一个实施方式中，膜壁具有非对称的壁结构，并且包括具有指状结构的层，即具有体积当量直径大于5μm的大孔隙的特征。
24.在一个实施方式中，本公开的中空纤维膜具有150μm至250μm，例如180μm至250μm的内径。在另一个实施方式中，内径在185μm至195μm的范围内。在再一个实施方式中，内径在195μm至205μm的范围内。在又一个实施方式中，内径在210μm至220μm的范围内。
25.在一个实施方式中，中空纤维膜的壁厚在15μm至60μm的范围内。在一个实施方式中，壁厚为33μm至37μm。在另一个实施方式中，壁厚为38μm至42μm。在又一个实施方式中，壁厚为43μm至47μm。在再一个实施方式中，壁厚为48μm至52μm。
26.在一个实施方式中，根据en1283在37℃下，在蛋白质含量为60g/l的牛血浆中测量下，膜的筛分系数对于维生素b
12
为1.0，对于菊粉为1.0，对于β
2-微球蛋白为至少0.7，对于白蛋白小于0.01。
27.在一个实施方式中，膜在全血中的截留分子量(mwco)为10kda至40kda的范围内。
在进一步的实施方式，膜的选择层中的平均孔径在2nm至5nm的范围内。
28.在一个实施方式中，该膜呈现出对于水的液体渗透率(lp)，其在从10
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)至280
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)的范围内，例如从15
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)至130
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)的范围内，或从20
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)至80
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)的范围内。
29.本公开的中空纤维膜具有接枝到其表面上的抗凝剂。在一个实施方式中，抗凝剂被接枝到中空纤维膜的管腔表面上。在另一个实施方式中，抗凝剂被接枝到中空纤维膜的外表面上。在又一个实施方式中，抗凝剂被接枝到中空纤维膜的管腔表面、外表面和孔通道的表面上。抗凝剂与质子化壳聚糖的铵基团形成离子键。抗凝剂可以包含至少一种具有抗凝活性的糖胺聚糖家族的化合物，并且优选地选自普通肝素、分级肝素、达那肝素、肝素衍生物和该产品的混合物。在一个实施方式中，使用普通肝素。沉积的抗凝剂的表面浓度通常在1,000iu/m2至30,000iu/m2的范围内，例如在1,000iu/m2至10,000iu/m2的范围内，或在1,000iu/m2至5,000iu/m2的范围内。
30.本公开还提供了一种过滤和/或扩散装置，其包括本公开的多个多孔中空纤维膜。过滤和/或扩散装置是用于血液体外净化的装置，例如血液透析器。包括本公开的中空纤维膜的血液透析器的表面积可以变化，但是通常在1.0m2至2.3m2的范围内。包括本公开的膜的血液透析器可以如本领域已知的那样组装。
31.装置的灭菌通常通过蒸汽灭菌、伽马射线照射或使用eto进行。在一个实施方式中，使用121℃的蒸汽对装置消毒至少20分钟。在另一个实施方式中，使用的伽马辐射剂量在25kgy至50kgy的范围内，例如25kgy。在又一个实施方式中，该装置用eto灭菌。
32.本公开还提供了本公开的多孔中空纤维膜在血液透析、血液透析过滤或血液过滤中的用途。
33.本公开还提供了一种制备表面接枝有抗凝剂的中空纤维膜的处理。该处理包括制备微孔中空纤维支撑膜，随后将抗凝剂接枝到支撑膜的至少一个表面上。
34.在一个实施方式中，多孔中空纤维支撑膜通过连续溶剂相位反转纺丝处理来制备，该处理包括以下步骤：
35.a)形成包括至少一种聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜的聚合物溶液；至少一种聚乙烯吡咯烷酮；至少一种壳聚糖；和n-甲基-2-吡咯烷酮；
36.b)将聚合物溶液通过具有两个同心开口的喷嘴的外环狭缝挤出到沉淀浴中；同时
37.c)通过喷嘴的内部开口挤出中心流体；
38.d)洗涤获得的膜；并且随后
39.e)干燥该膜；
40.其中该聚合物溶液包含相对于聚合物溶液的总重量为10wt.％至15wt.％的聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜；以及相对于聚合物溶液的总重量为1wt.％至10wt.％的聚乙烯吡咯烷酮；以及相对于溶液的总重量为0.05wt.％至0.6wt.％的壳聚糖。
41.聚醚砜在聚合物溶液中的浓度通常在10wt.％至15wt.％，例如12wt.％至14wt.％的范围内。
42.在该处理的一个实施方式中，聚合物溶液包含重均分子量mw在90kda至95kda范围内的聚醚砜。一个示例是重均分子量mw为92kda、多分散性mw/mn为3的聚醚砜。在另一个实施
方式中，聚合物溶液包含重均分子量mw为70kda-80kda的聚醚砜。一个示例是重均分子量mw为75kda、多分散性mw/mn为3.4的聚醚砜。
43.聚合物溶液中聚乙烯吡咯烷酮的浓度通常在1wt.％至10wt.％，例如2wt.％至8wt.％的范围内。
44.在该处理的一个实施方式中，聚合物溶液包含1wt.％至5wt.％的、重均分子量mw为1,100kda的聚乙烯吡咯烷酮。
45.在该处理的进一步的实施方式，聚合物溶液包含3wt.％至6wt.％的、重均分子量mw为50kda的聚乙烯吡咯烷酮。
46.在该处理的一个实施方式中，聚合物溶液包含相对于溶液的总重量为0.05wt.％至0.6wt.％，例如0.1wt.％至0.5wt.％，或0.2wt.％至0.4wt.％的壳聚糖。
47.在一个实施方式中，壳聚糖的脱乙酰度为75％至100％，通过gpc测定的重均分子量mw在5kda至375kda的范围内。
48.在特定的实施方式中，壳聚糖的脱乙酰度为85％至95％，例如90％，并且通过gpc分析测定的重均分子量mw在50kda至190kda的范围内。
49.在该处理的一个实施方式中，聚合物溶液的制备包括通过将壳聚糖溶解在弱有机酸的水溶液中来制备壳聚糖的酸性水溶液。在一个实施方式中，有机酸是乳酸。在进一步的实施方式，使用90％w/w的乳酸水溶液来溶解壳聚糖。在另一个实施方式中，有机酸是柠檬酸。在另一个实施方式中，有机酸是乙酸。在又一个实施方式中，有机酸是酒石酸。
50.在该处理的另一个实施方式中，聚合物溶液的制备包括通过将壳聚糖溶解在纯乳酸中来制备壳聚糖的酸性溶液。
51.已经发现，乳酸比其他弱有机酸(如乙酸、柠檬酸或酒石酸)更有优势。由于乳酸在室温下为液体，因此无需添加水来制备壳聚糖溶液。已经发现，使用柠檬酸生产的聚合物溶液呈现出差的长期稳定性，并且使用聚合物溶液生产的纤维在旋转过程中倾向于破裂。加入聚乙烯吡咯烷酮后，壳聚糖在乙酸水溶液中形成凝胶；而聚乙烯吡咯烷酮不溶于酒石酸水溶液中的壳聚糖溶液。
52.在一个实施方式中，壳聚糖在乳酸溶液中的浓度在0.2wt.％至5wt.％，例如1％至4wt.％，或1.5％至3wt.％的范围内。
53.将壳聚糖溶液与n-甲基-2-吡咯烷酮混合，并加入聚乙烯吡咯烷酮。在聚乙烯吡咯烷酮溶解后，加入聚醚砜，并搅拌混合物，直至形成透明溶液。
54.在一个实施方式中，聚合物溶液包含相对于溶液的总重量为1至4wt.％，例如1.5wt.％至3wt.％的水。在另一个实施方式中，聚合物溶液不包含添加的水。
55.在制备膜的处理的一个实施方式中，中心流体包含相对于中心流体的总重量为40wt.％至60wt.％的水和40wt.％-60wt.％的nmp，例如50wt.％至60wt.％的水和40wt.％至50wt.％的nmp，或52wt.％至55wt.％的水和45wt.％至48wt.％的nmp，例如54wt.％的水和46wt.％的nmp。
56.在该处理的一个实施方式中，沉淀浴包含水。在该处理的一个实施方式中，沉淀浴的温度在10℃至30℃的范围内，例如15℃至25℃。
57.在制备膜的处理的一个实施方式中，喷丝头的温度在40℃至60℃，例如52℃至56℃的范围内。
58.在该处理的一个实施方式中，喷嘴开口和沉淀浴之间的距离在10cm至120cm，例如90cm至110cm的范围内。
59.在该处理的一个实施方式中，旋转速度在20m/min至80m/min，例如30m/min至50m/min的范围内。
60.然后清洗膜以除去残留溶剂和低分子量组分。在用于生产膜的连续处理的特定实施方式中，该膜被引导通过数个水浴。在该处理的一些实施方式中，单独的水浴具有不同的温度。例如，每一个水浴的温度可能比前一个水浴更高。
61.随后，将抗凝剂接枝到膜的至少一个表面上。在一个实施方式中，该表面是膜的管腔表面，即其内壁表面。在另一个实施方式中，该表面是膜的外表面，即其外壁表面。在又一个实施方式中，内壁表面和膜内的孔通道的表面都接枝有抗凝剂。在再一个实施方式中，外壁表面和膜内的孔通道的表面都接枝有抗凝剂。在又一个实施方式中，用抗凝剂接枝膜的内壁表面、膜内的孔通道和外壁表面。
62.抗凝剂与存在于膜表面的铵基团形成离子键。抗凝剂通过带负电荷的抗凝剂和带正电荷的膜表面之间的静电相互作用而附着在膜表面。在一个实施方式中，抗凝剂包含具有抗凝活性的糖胺基因家族的至少一个成员。在进一步的实施方式中，抗凝剂选自普通肝素、分级肝素、达那肝素、肝素衍生物和所述产物的混合物。在一个实施方式中，抗凝剂是普通肝素。在一个实施方式中，在接枝步骤后，膜表面上的抗凝剂的浓度在1,000iu/m2至30,000iu/m2的范围内，例如1,000iu/m2至10,000iu/m2的范围内，或1,000iu/m2至5,000iu/m2的范围内，例如1,500iu/m2至3,500iu/m2的范围内。
63.可通过使抗凝剂的水溶液与支撑膜表面接触来进行接枝。在一个实施方式中，用抗凝剂的水溶液冲洗支撑膜，并随后用水或盐水漂洗以除去过量的抗凝剂。在另一个实施方式中，用抗凝剂的水溶液冲洗支撑膜，并随后干燥以蒸发溶剂。在又一个实施方式中，利用中空纤维产生的毛细作用力，用抗凝剂的水溶液浸泡支撑膜。
64.接枝可以在膜被并入扩散和/或过滤装置之前或之后进行。换句话说，接枝也可以在包括本公开的带有正电荷的多孔中空纤维膜的扩散和/或过滤装置上进行。例如，扩散和/或过滤装置，例如包括带有正电荷的多孔中空纤维膜束的血液透析器，可以用抗凝剂的水溶液冲洗以实现接枝；并且随后用水或盐水漂洗该装置以除去过量的抗凝剂。在另一个实施方式中，用抗凝剂的水溶液冲洗该装置以实现接枝；并且随后对装置中的膜干燥并蒸发溶剂。
65.接枝后，可对膜进行后处理。后处理的示例包括大量漂洗膜以去除松散结合的抗凝剂；对膜进行辐射处理以使抗凝剂与膜中存在的其它聚合物交联；对膜进行干燥；通过加热膜来使膜中存在的聚合物的聚合物链交联。
66.因此，本公开提供了一种用于生产涂有抗凝剂如肝素的膜的简单处理。本公开的膜的优点在于，在基材和抗凝剂涂层之间不存在中间层或底漆层，并且制造该膜的处理不需要用于形成这种底漆层的额外步骤。本公开的处理也不涉及用于将抗凝剂共价偶联到膜表面的额外化学反应步骤，因此也不涉及偶联剂的使用。本公开提供了一种用于低成本制造涂有肝素的膜的简单、可扩展的过程。
67.本公开的主题将在以下工作示例中进一步描述。
68.方法
69.小型模块的制备
70.小型模块[＝壳体中的纤维]通过将纤维切割成20cm的长度来制备，在40℃和＜100mbar下将该纤维干燥1h，随后将该纤维转移到壳体中。纤维的末端由聚氨酯灌封。在聚氨酯硬化后，切割灌封膜束的端部以重新打开纤维。小型模块确保对纤维的保护。在本实施例中，使用了具有360cm2的有效膜(管腔)表面a的小型模块。
[0071]
小型模块的液体渗透率(lp)
[0072]
小型模块的液体渗透率是通过在压力下将规定体积的水压过密封在一侧的小型模块并测量所需时间来测定的。根据等式(1)，根据测定的时间t、有效膜表面积a、施加的压力p和压过膜的水量v来计算液体渗透率：
[0073]
lp＝v/[p
·a·
t](1)
[0074]
根据等式(2)，有效膜表面积a由纤维长度和纤维内径计算得出
[0075]
a＝π
·di
·
l
·
[cm2](2)
[0076]
其中
[0077]di
＝纤维的内径[cm]
[0078]
l＝有效纤维长度[cm]
[0079]
进行lp测试前三十分钟，将小型模块浸湿。为了这个目的，将小型模块放入装有500ml超纯水的盒子中。30分钟后，小型模块被转移到测试系统中。测试系统包括保持在37℃的水浴和可以安装小型模块的装置。水浴的填充高度必须确保小型模块位于指定装置的水面下方。
[0080]
为了避免膜的泄漏导致错误的测试结果，预先进行小型模块和测试系统的完整性测试。通过将空气压过一侧封闭的小型模块来进行完整性测试。气泡表明小型模块或测试装置泄漏。必须检查泄漏是否是由于测试装置中小型模块安装不正确或者膜泄漏造成的。如果检测到膜泄漏，则必须丢弃小型模块。完整性测试中施加的压力必须与测定液体渗透率期间施加的压力值至少相同，以确保液体渗透率测量期间不会因施加的压力过高而发生泄漏。
[0081]
小型模块中的中空纤维的肝素涂层
[0082]
i)制备浓度为200iu/ml的等渗盐水溶液中(0.9％)的肝素溶液(肝素钠194iu/mg，塞尔萨斯试验室有限公司(celsuslaboratoriesinc)，辛辛那提，美国)。关闭小型模块的透析液侧，以确保不会发生从血液侧到透析液侧的过滤。25ml肝素溶液以1ml/min的流速通过小型模块的血液侧再循环30分钟。涂覆后，随后用300ml等渗盐水和100ml水以20ml/min的流速漂洗小型模块。然后用压缩空气冲洗小型模块的血液侧80分钟，以干燥模块。
[0083]
ii)制备浓度为200iu/ml的超纯水(advantagea10，默克公司，达姆施塔特，德国)中的肝素溶液(肝素钠194iu/mg，celsus实验室公司，辛辛那提，美国)。关闭小型模块的透析液侧，以确保不会发生从血液侧到透析液侧的过滤。25ml肝素溶液以1ml/min的流速通过小型模块的血液侧再循环120分钟。涂覆后，随后用300ml等渗盐水和100ml水以20ml/min的流速漂洗小型模块。然后用压缩空气冲洗小型模块的血液侧80分钟，以干燥模块。
[0084]
固定化肝素的定量测定
[0085]
甘氨酸缓冲液由3.84g/l的甘氨酸(默克公司(merckkgaa)，达姆施塔特，德国)，
2.8g/lnacl(默克公司，达姆施塔特，德国)和水制备。用30％naoh溶液(vwr，达姆施塔特，德国)将ph值调节至11
±
0.1。用甘氨酸缓冲液以2.3ml/min的流速漂洗小型模块。10分钟后，将小型模块完全排空。从10分钟后的提取物中采集样本，并使用天青a(azure a)分析法测定样本中的肝素浓度。
[0086]
天青a是一种蓝色的变色染料，当与诸如肝素的硫酸化多糖结合时，颜色会从蓝色变为紫红色。这种颜色变化是在630nm波长下用光度测量的。基于覆盖从0mg/l至12mg/l肝素浓度范围的标准曲线，测定肝素浓度。每一次同时测量已知浓度为1.2mg/l.6mg/l和10.8mg/l的肝素的对照样本。在微孔板井中，将200μl的天青a浓度为25mg/l的天青a水溶液(染料含量～80％，西格玛奥德里奇化学有限公司(sigma-aldrichchemie gmbh)，施泰因海姆，德国)分别添加到100μl的标准样本、对照样本和待测样本。将微孔板在暗处储存15分钟后，使用微孔板光度计(el808超级酶标仪，伯腾仪器公司(biotekinstrumentsinc)，汪诺斯基，美国)进行测量。
[0087]
肝素释放的测定
[0088]
首先，在37℃下，用约150ml等渗盐水溶液(0.9％)漂洗小型模块。然后用30ml溶剂/洗涤剂处理过的混合人血浆(包含45g/l至70g/l的人血浆蛋白、4.4g/l至7.4g/l的柠檬酸钠二水合物、0.3g/l至1.2g/l的磷酸二氢钠二水合物和4.0g/l至6.0g/l的甘氨酸)，并呈现凝固因子活性为至少0.5iu/ml(lg，octapharmapharmazeutika produktionsgesellschaftmbh，a-1100维也纳，奥地利)的储液器，以9ml/min的流速在小型模块中再循环120分钟。在0分钟、60分钟和120分钟取样。使用肝素抗xa变色法(肝素；斯塔高(stago)德国有限公司，40474杜塞尔多夫，德国)测定样本中的肝素浓度。
[0089]
血液相容性的测定
[0090]
通过在体外用prp(富含血小板的人血浆，每μl血浆含有100,000个血小板细胞)灌注小型模块来研究膜的血液相容性。
[0091]
首先，在37℃下，用约250ml等渗盐水(0.9％)漂洗小型模块的血液侧；然后用约120ml等渗盐水溶液(0.9％)在37℃下漂洗小型模块的滤液侧，并随后用塞子封闭。将含有0.05iu/ml肝素的50mlprp储液器以9ml/min的流速通过小型模块再循环120分钟。在0分钟、10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟和120分钟时，采集两份450μl体积的样本。在每种情况下，将两个样本中的一个转移至微管中(microtube1，5mleasycap，sarstedtag&co.kg，宁布雷希特，德国)，其含有50μl10wt.％的柠檬酸三钠溶液，以抑制样本的进一步凝固，并储存在冰浴中。将另一份样本转移至微管中(microtube1，5mleasycap，sarstedtag&co.kg，宁布雷希特，德国)，其含有50μlctad(柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫)溶液，以抑制样本的进一步凝固，并储存在冰浴中。
[0092]
血小板滴数的测定
[0093]
使用细胞计数系统(xp-300，希森美康(sysmex)德国有限公司，22848诺德施泰特，德国)分析血浆样本中的血小板含量。所示数据与100.000thr/μl的起始浓度相关，其相当于100％。
[0094]
pf-4的测定
[0095]
使用夹心酶联免疫吸附试验(elisa)(pf4，斯塔高(stago)德国有限公司，40474杜塞尔多夫，德国)的手段检测人血小板因子4(pf-4)的形成。
[0096]
解冻后，将含有ctad的等分血浆样本用人血浆稀释。稀释因子为1：50。标准样本(范围为2μg/l至60μg/l)、对照样本和用于稀释的血浆以一式两份进行分析；而对于样本，单次测定就足够了。将50μl的稀释剂和50μl的样本转移到微孔板的孔中，并且pf-4与微孔板上的抗体结合。洗涤过程后，加入100μl第二酶偶联抗体，并在培养30分钟后通过洗涤除去。与3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)的反应采用450nm下的光度测量(el808超级酶标仪，伯腾(biotek)仪器公司，汪诺斯基/美国)。
[0097]
人类tat复合物的测定
[0098]
膜表面对凝血功能的激活是通过夹心酶联免疫吸附试验(elisa)(tatmicro，西门子医疗诊断产品有限公司，德国)的手段定量测定人血浆中的凝血酶iii复合物(tat)来进行的。
[0099]
解冻后，将含有柠檬酸三钠的等分血浆样本用人血浆稀释。根据预期的tat浓度选择稀释因子，稀释因子在1：1和1：40之间变化。标准样本(范围为2μg/l至60μg/l)、对照样本和用于稀释的血浆以一式两份进行分析；而对于样本，单次测定就足够了。将50μl的稀释剂和50μl的样本转移到微孔板的孔中，使tat复合物与微孔板上的抗体结合。洗涤处理后，加入100μl第二酶结合抗体，并在培养30分钟后通过洗涤除去。通过添加变色剂发生的酶促反应在1小时内以490nm进行光度测量(el 808超级酶标仪，伯腾仪器公司，汪诺斯基，美国)。
[0100]
示例
[0101]
比较示例1
[0102]
使用取自商用透析器(瑞典金宝(gambrolundiaab))的纤维来制备小型模块。纤维的内径为190μm，且壁厚为35μm，包含聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的混合物。
[0103]
如上所述，对膜的血液相容性进行了研究。90分钟后，观察到凝血。由于凝血，实验在110分钟后终止。如上所述地测定血小板减少量、pf-4和人类tat复合物的形成。结果汇总在表1中。t[分钟]01020406090110plt[％]100979796878857pf-4[iu/ml]1415140613481615236540413753tat[μg/l]119109104140213407592
[0104]
表1
[0105]
比较示例2
[0106]
使用取自商用透析器(gambrolundiaab)的纤维来制备小型模块，该透析器已用60wt.％的甘油和40wt.％的水的混合物以100ml/min的速度再循环60分钟来漂洗，然后用压缩空气干燥2小时。纤维的内径为210μm，且壁厚为42μm，且包含丙烯腈和甲基烯丙基硫酸钠共聚物，使用聚乙烯亚胺接枝，且涂有3,000iu/m2的普通肝素。
[0107]
如上所述地研究膜的血液相容性。如上所述地测定血小板减少量、pf-4的形成和人类tat复合物。结果汇总在表2中。
[0108]
表2
[0109]
聚合物溶液的制备
[0110]
对于4,500g(＝100％w/w)的聚合物溶液，将11.25g(0.25％w/w)的壳聚糖(壳聚糖90/100/a1，kraeber&co有限公司，25474埃勒贝克，德国)溶解在720g(16％w/w)的90％w/w的乳酸水溶液(gprvwr国际有限公司，64295达姆施塔特，德国)中。将壳聚糖溶液与3,048.75g(67.75％w/w)的n-甲基-2-吡咯烷酮混合，并加入90.00g(2％w/w)的重均分子量约为1,100kda的聚乙烯吡咯烷酮(k85，巴斯夫公司)。聚乙烯吡咯烷酮溶解后，加入630.00g(14％w/w)的聚醚砜(e6020，巴斯夫公司)，搅拌混合物直至形成透明溶液。也可以在nmp中溶解pvp和聚醚砜，然后在第二步中添加乳酸中的壳聚糖溶液。
[0111]
示例1
[0112]
将溶液通过具有两个同心开口的喷丝头的外环狭缝挤出(环狭缝的外边界直径：500μm；环狭缝的内边界直径：350μm；中心孔的直径：180μm)进入含有水的凝固浴，所述溶液包括：具有约为75kda的重均分子量(e6020，巴斯夫公司)的14.0％w/w的聚醚砜溶液；具有约为1,100kda的重均分子量(k85，巴斯夫公司)的2.0％w/w的pvp；0.25％w/w的壳聚糖(壳聚糖90/100/a1，kraeber&co有限公司，25474埃勒贝克，德国)；14.4％w/w的乳酸；1.6％的水和67.75％w/w的nmp。将含有50％w/w的水和50％w/w的nmp的溶液用作中心流体，并通过喷丝头的内孔挤出。喷丝头的温度为48℃，纺丝轴的温度为45℃，气隙为100cm，凝固浴为室温。纤维以40m/min的速度纺丝。纤维随后被引导通过一系列温度范围为50℃至75℃的含有软化水的水浴。
[0113]
获得的纤维具有190μm的内径和35μm的壁厚。膜呈现非对称海绵结构，平均孔径沿内壁表面向外壁表面方向增加。
[0114]
如上所述地制备小型模块，并如上所述地测试纤维的液体渗透率。测定小型模块的lp为(45
±
5)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝2)。
[0115]
将一些小型模块在121℃下用蒸汽灭菌20分钟。灭菌后，小型模块的lp测定为(70
±
3)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝2)。灭菌后的膜对于肌红蛋白的筛分系数为(31
±
1)％，对于白蛋白的筛分系数为(0.7
±
0.1)％(n＝2)。
[0116]
根据上述的过程i)用肝素涂覆三个小型模块的膜，并如上所述地测定固定在膜上的肝素的量。提取10分钟后，从每一个小型模块中提取出(92
±
4)iu的肝素(n＝3)。
[0117]
如上所述地检测三个小型模块(n＝3)的肝素释放量。血浆中的肝素浓度在0分钟时低于检测极限(＜0.1iu/ml)。提取60分钟后，对于第一小型模块和第二小型模块，血浆样
本中的肝素浓度低于检测极限(＜0.1iu/ml)，并且对于第三小型模块，血浆样本中的肝素浓度为0.1iu/ml。提取120分钟后，对于第一小型模块和第三小型模块，血浆样本中的肝素浓度低于检测极限(＜0.1iu/ml)，对于第二小型模块，血浆样本中的肝素浓度为0.3iu/ml。
[0118]
涂有肝素的小型模块的lp测定为(65
±
2)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝3)。涂有肝素的膜对于肌红蛋白的筛分系数为(33
±
1)％，对于白蛋白的筛分系数为(0.8
±
0.1)％(n＝3)。
[0119]
示例2
[0120]
将溶液通过具有两个同心开口的喷丝头的外环狭缝挤出(环狭缝的外边界直径：700μm；环狭缝的内边界直径：350μm；中心孔的直径：180μm)进入含有水的凝固浴，所述溶液包括：具有约为75kda的重均分子量(e6020，巴斯夫公司)的14.0％w/w的聚醚砜溶液；具有约为1100kda的重均分子量(k85，巴斯夫公司)的2.0％w/w的pvp；0.25％w/w的壳聚糖(壳聚糖90/100/a1，kraeber&co有限公司，25474埃勒贝克，德国)；14.4％w/w的乳酸；1.6％的水和67.75％w/w的nmp。将含有50％w/w的水和50％w/w的nmp的溶液用作中心流体，并通过喷丝头的内孔挤出。喷丝头的温度为49℃，纺丝轴的温度为45℃，气隙为100cm，且凝固浴为室温。纤维以30m/min的速度纺丝。纤维随后被引导通过一系列温度范围为50℃至75℃的含有软化水的水浴。
[0121]
获得的纤维具有190μm的内径和35μm的壁厚。膜呈现非对称海绵结构，平均孔径沿内壁表面向外壁表面方向增加。
[0122]
如上所述地制备小型模块，并如上所述地测试纤维的液体渗透率。测定小型模块的lp为(44
±
1)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝3)。膜对于肌红蛋白的筛分系数为(31
±
0.5)％，对于白蛋白的筛分系数为(1.5
±
0.0)％(n＝3)。
[0123]
将一些小型模块在121℃下用蒸汽灭菌20分钟。灭菌后，小型模块的lp测定为(82
±
4)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝3)。灭菌后的膜对于肌红蛋白的筛分系数为(39
±
2)％，对于白蛋白的筛分系数为(1.7
±
0.1)％(n＝3)。
[0124]
根据上述的过程i)用肝素涂覆小型模块的膜，并如上所述地研究膜的血液相容性。如上所述地测定血小板减少量、pf-4的形成和人类tat复合物。结果汇总在表3中。t[分钟]01020406090120plt[％]1001051119910695104pf-4[iu/ml]105999210881271132616401808tat[μg/l]29262520273030
[0125]
表3
[0126]
示例3
[0127]
将溶液通过具有两个同心开口的喷丝头的外环狭缝挤出(环狭缝的外边界直径：500μm；环狭缝的内边界直径：350μm；中心孔的直径：180μm)进入含有水的凝固浴，所述溶液包括：具有约为75kda的重均分子量(e6020，巴斯夫公司)的14.0％w/w的聚醚砜溶液；具有约为1100kda的重均分子量(k85，巴斯夫公司)的2.0％w/w的pvp；
0.1％w/w的壳聚糖(壳聚糖90/100/a1，kraeber&co有限公司，25474埃勒贝克，德国)；14.4％w/w的乳酸；1.6％的水和67.9％w/w的nmp。将含有50％w/w的水和50％w/w的nmp的溶液用作中心流体，并通过喷丝头的内孔挤出。喷丝头的温度为49℃，纺丝轴的温度为45℃，气隙为100cm，且凝固浴为室温。纤维以40m/min的速度纺丝。纤维随后被引导通过一系列温度范围为50℃至75℃的含有软化水的水浴。
[0128]
获得的纤维具有190μm的内径和35μm的壁厚。膜呈现非对称海绵结构，平均孔径沿内壁表面向外壁表面方向增加。
[0129]
小型模块的lp为(73
±
1)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝3)。蒸汽灭菌后，小型模块的lp测定为(91
±
1)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝2)。灭菌后的膜对于肌红蛋白的筛分系数为(44
±
1)％，对于白蛋白的筛分系数为(0.8
±
0.0)％(n＝2)。
[0130]
根据上述的过程ii)用肝素涂覆三个小型模块的膜，并如上所述地测定固定在膜上的肝素的量。提取10分钟后，从每一个小型模块中提取出(43
±
2)iu的肝素(n＝3)。
[0131]
涂有肝素的小型模块的lp测定为(82
±
2)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝2)。涂有肝素的膜对于肌红蛋白的筛分系数为(42
±
1)％，对于白蛋白的筛分系数为(0.8
±
0.0)％(n＝2)。
[0132]
示例4
[0133]
制备溶液，所述溶液包括：具有约为75kda的重均分子量(e6020，巴斯夫公司)的14.0％w/w的聚醚砜溶液；具有约为1100kda的重均分子量(k85，巴斯夫公司)的2.0％w/w的pvp；0.4％w/w的壳聚糖(壳聚糖90/100/a1，kraeber&co有限公司，25474埃勒贝克，德国)；14.4％w/w的乳酸；1.6％的水和67.6％w/w的nmp。为了降低聚合物溶液的粘度，添加相对于聚合物溶液总重量为30wt.％的nmp。稀释的聚合物溶液通过具有两个同心开口的喷丝头的喷丝头的外环狭缝挤出(环狭缝的外边界直径：500μm；环狭缝的内边界直径：350μm；中心孔的直径：180μm)进入含有水的凝固浴。将含有60％w/w的水和40％w/w的nmp的溶液用作中心流体，并通过喷丝头的内孔挤出。喷丝头的温度为45℃，纺丝轴的温度为42℃，气隙为100cm，且凝固浴为室温。纤维以40m/min的速度纺丝。纤维随后被引导通过一系列温度范围为50℃至75℃的含有软化水的水浴。
[0134]
获得的纤维具有190μm的内径和35μm的壁厚。膜呈现指状结构，即沿朝向外壁表面的方向延伸的大空隙。
[0135]
小型模块的lp为(91
±
6)
·
10-4
cm3/(cm2·
bar
·
sec)(n＝3)。膜对于肌红蛋白的筛分系数为(21
±
2)％，对于白蛋白的筛分系数为(0.5
±
0.0)％(n＝3)。
[0136]
根据上述的过程ii)用肝素涂覆三个小型模块的膜，并如上所述地测定固定在膜上的肝素的量。提取10分钟后，从每一个小型模块中提取出(18
±
1)iu的肝素(n＝3)。

技术特征：
1.一种多孔中空纤维膜，其上固定有抗凝剂；所述膜包含以下物质的混合物：i)聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜；ii)聚乙烯吡咯烷酮；和iii)壳聚糖。2.根据权利要求1所述的膜，其中，所述抗凝剂是糖胺聚糖。3.根据权利要求2所述的膜，其中，所述抗凝剂是普通肝素。4.根据权利要求1至3中任一项所述的膜，其中，所述多孔中空纤维上的所述抗凝剂的浓度在1000iu/m2至5000iu/m2的范围内。5.根据权利要求1至4中任一项所述的膜，包含相对于所述膜的总重量为0.1wt.％至5wt.％的壳聚糖。6.根据权利要求1至5中任一项所述的膜，其中，所述壳聚糖的重均分子量m
w
，通过gpc分析测定，在5kda至375kda的范围内。7.根据权利要求1至6中任一项所述的膜，其中，所述壳聚糖的脱乙酰度在85％至95％的范围内。8.一种制备多孔中空纤维膜的方法，在所述多孔中空纤维膜上固定有抗凝剂，所述方法包括生产微孔中空纤维支撑膜以及随后将抗凝剂接枝到所述支撑膜的至少一个表面上，其中，生产所述微孔中空纤维支撑膜包括以下步骤：a)形成聚合物溶液，该聚合物溶液包含：至少一种聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜；至少一种聚乙烯吡咯烷酮；至少一种壳聚糖；以及n-甲基-2-吡咯烷酮；b)将所述聚合物溶液通过具有两个同心开口的喷嘴的外环狭缝挤出到沉淀浴中；同时c)通过所述喷嘴的内部开口挤出中心流体；d)洗涤获得的所述膜；随后e)干燥所述膜；其中，所述聚合物溶液包含相对于所述聚合物溶液的总重量为10wt.％至15wt.％的聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜；以及相对于所述聚合物溶液的所述总重量为1wt.％至10wt.％的聚乙烯吡咯烷酮；以及相对于所述溶液的所述总重量为0.05wt.％至0.6wt.％的壳聚糖。9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述壳聚糖的脱乙酰度为75％至100％，并且通过gpc分析测定的重均分子量m
w
在5kda至375kda的范围内。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，形成所述聚合物溶液包含将所述壳聚糖溶解在乳酸中。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述壳聚糖溶解在90％w/w的乳酸水溶液中。12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，通过使所述抗凝剂的水溶液与所述支撑膜的所述至少一个表面接触，将所述抗凝剂接枝到所述支撑膜的所述至少一个表面上。13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中，所述抗凝剂是普通肝素。14.一种过滤和/或扩散装置，包括根据权利要求1至7中任一项所述的多个多孔中空纤维膜。15.根据权利要求1至7中任一项所述的多孔中空纤维膜在血液透析、血液透析滤过或血液过滤中的用途。

技术总结
本公开涉及示出了降低的血栓形成性的涂有抗凝剂的微孔中空纤维膜。本公开还涉及用于生产该膜的方法以及包括该膜的过滤和/或扩散装置。装置。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：甘布罗伦迪亚股份公司
技术研发日：2021.10.04
技术公布日：2023/8/5