治疗纤维化和伤口愈合的方法与流程

治疗纤维化和伤口愈合的方法


背景技术：

1.纤维化是细胞外基质(ecm)的过度积累，可导致组织结构扭曲和器官功能丧失。无论潜在的病因如何，这种病状通常是由慢性或反复的组织损害(damage)或损伤(injury)产生的伤口愈合反应引起的，并且实际上可以发生在任何器官或实体组织中。多种流行性慢性疾病可导致纤维化，包括糖尿病、高血压、病毒性和非病毒性肝炎、心力衰竭和心肌病、特发性肺病、硬皮病和癌症。这些和其它疾病导致的纤维化可导致肝、肺、肾、心脏或其它重要器官衰竭，这是因为过量的ecm替代并破坏薄壁组织(parenchymal tissue)。结果，在发达国家中，严重纤维化估计占所有死亡的高达45％。目前用于纤维化的治疗方法很少，而且疗效有限。因此，迫切需要了解如何可以消退纤维化，并确定潜在的新治疗方法。(jun ji,lau lf.j clin invest.2018；128(1):97-107.
2.皮肤是体内最大的器官系统。因此，它在保护免于机械力和感染、体液失衡和热失调中起到关键作用。同时，它具有柔性以允许身体一些区域中的关节功能，并且具有更坚固的固定以使得手掌或脚底难以移动。许多情况导致伤口愈合不充分，需要医疗干预。慢性疾病如糖尿病或周围血管疾病会导致伤口愈合不良。急性创伤，例如皮肤撕裂或大面积热损伤，随后是丧失皮肤器官的功能，这使得身体易受到感染、热失调和体液流失。(sorg h,等.eur surg res.2017；58(1-2):81-94)。
3.伤口愈合疗法可以大致分为传统疗法和现代疗法，具有不同的功效水平、临床接受度和副作用。许多世纪以来，传统疗法主要被发展中国家的农村人口所使用。这些疗法通常涉及使用来自草药和动物、活生物体、银和传统敷料(dressing)的化合物。另一方面，现代疗法包括使用移植物、现代敷料、生物工程皮肤替代物和细胞敷料/生长因子疗法。然而，健康和功能性皮肤的再生由于其多层结构和细胞外基质中不同类型的细胞以有组织的方式的存在而仍是一个巨大的挑战(pereira rf,b
á
rtolo pj.adv wound care(new rochelle).2016；5(5):208-229)。
4.皮肤衰老有两个主要过程：内在的和外在的。个体遗传背景的差异内在地控制随着时间流逝而发生的衰老。按照定义，这种形式的衰老是不可避免的，因此，显然不会通过改变人类行为而进行操控。相反地，外在的衰老是通过引入人体的外源因素而产生的，例如吸烟、过量酒精消耗、营养不良和长期暴露于阳光。在这些外部因素中，日晒被认为是迄今为止对皮肤最严重的损害。事实上，80％的面部衰老被认为是由于长期暴露于阳光。内在的和外在的衰老过程也被认为受到自由基(也称为活性氧类(reactive oxygen specie))的形成的影响。胶原蛋白的丧失被认为是衰老皮肤的特征性组织学发现。皱纹和色素变化与光老化直接相关，并且被认为是最明显的皮肤临床表现。这样的光损害代表了皮肤过早衰老的征象。此外，长期日晒的有害后果，特别是各种形式的光诱导的皮肤癌，也与急性和长期日晒有关。唯一已知的旨在预防光老化的策略包括避免阳光，使用防晒霜来阻断或减少皮肤暴露于紫外线辐射，使用类视黄醇以抑制胶原酶合成和促进胶原蛋白生产，以及使用抗氧化剂、尤其是组合使用抗氧化剂以减少和中和自由基。(bauman l.jpathol 2007；211:241
–
251)。
5.对于纤维化的预防或治疗有不同的尝试，例如：专利ep 2 566 967 b1公开了钙粘蛋白-11拮抗剂用于治疗表现钙粘蛋白-11活性的纤维化。专利ep 2010 551b1中公开了gba2抑制剂的用途，其中所述抑制剂可以是n-[5
’‑
(金刚烷-1
’‑
基-甲氧基)-戊]-1-脱氧野尻霉素(n-[5'-(adamantan-1'-yl-methoxy)-pentan]-1-deoxynojirimycin)、n-[5
’‑
(金刚烷-1
’‑
基-甲氧基)-戊]-l-艾杜-1-脱氧野尻霉素、n-[5
’‑
新戊氧基-戊基]-1-脱氧野尻霉素和n-[5
’‑
新戊氧基-戊基]-l-艾杜-1-脱氧野尻霉素，其中所述抑制剂用于制备治疗囊性纤维化的药物。专利文献ep 1 997 507 a2中公开了一种用于治疗环状纤维化缺陷的组合物，所述组合物包含血管生成因子和转运蛋白。所述组合物刺s激血管生成和再血管化。美国专利9,937,133b2公开了一种用于治疗纤维化的醛脱氢酶抑制剂。美国专利10,106,603b2公开了抑制白细胞介素11的作用的药剂的用途。


技术实现要素：

[0006]
提供了一种用于治疗有需要的哺乳动物中的纤维化的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体(tbrii-se)的融合蛋白。所述可溶性受体可以是seq id no.1的可溶性tgf-βii型、或者是与seq id no.1具有85％、86％、87％；88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的肽。稳定剂可以是使融合蛋白稳定的任何肽。在优选实施方案中，稳定剂是免疫球蛋白(ig)的fc结构域。在另一更优选的实施方案中，稳定剂是人类免疫球蛋白g(igg)的fc结构域。纤维化可以是任何来源的任何纤维化，在优选实施方案中，纤维化是肝纤维化、肺纤维化或皮肤纤维化。如果所述哺乳动物是人类，纤维化可以是由于但不限于以下病症和/或疾病引起的：非酒精性脂肪性肝炎(nash)、硬皮病/系统性硬化症(ssc)、特发性肺纤维化、和原发性胆汁性胆管炎(pbc)。
[0007]
还提供了一种用于治疗纤维化的组合物，所述组合物包含与稳定剂连接的可溶性tgf-βii型受体融合蛋白(seq id no.1)；和药学上可接受的赋形剂。在优选实施方案中，稳定剂是免疫球蛋白fc结构域，例如人类igg的fc结构域。在优选实施方案中，融合蛋白包含与seq id no.2中所示的序列为85％、86％、87％；88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
[0008]
提供了一种用于愈合有需要的哺乳动物中的伤口的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白。所述可溶性受体可以是seq id no.1的可溶性tgf-βii型、或者是与seq id no.1具有85％、86％、87％；88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的肽。稳定剂可以是使融合蛋白稳定的任何肽。在优选实施方案中，稳定剂是免疫球蛋白(ig)的fc结构域，例如但不限于，稳定剂是人类igg的fc结构域。
[0009]
提供了一种伤口愈合组合物，所述组合物包含具有与稳定剂结合的内源性可溶性tgf-βii型受体(tβrii-se)的融合蛋白；和药学上可接受的赋形剂。
[0010]
提供了一种用于减少人类皮肤衰老的方法，其中所述方法包括向所述人类施用有效量的含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白。在优选实施方案中，稳定剂是免疫球蛋白的fc结构域，例如人类igg的fc结构域。在优选实施方案中，融合蛋白包含与seq id no.2中所示序列为85％、86％、87％；88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
[0011]
提供了一种用于减少人类皮肤衰老的化妆品组合物，所述组合物包含含有与稳定剂连接的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白；和可接受的赋形剂。
[0012]
本发明的组合物可以通过任何已知的途径施用，例如皮内、皮下、静脉内、肌内、原位、皮肤、沉积在表面例如皮肤上。本发明的组合物可以配制成霜剂、凝胶剂、液体、丸剂、胶囊剂、注射剂、洗剂、控释组合物、贴剂或其它已知形式。
附图说明
[0013]
图1：用tβrii-se/fc融合蛋白、尼达尼布(nintedanib)和溶媒(对照)处理的小鼠的每日体重测定。尼达尼布vs溶媒*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
[0014]
图2：用h&e染色的皮肤组织的代表性显微照片显示出，在具有博莱霉素(bleomycin)诱导的皮肤纤维化的小鼠中，用融合蛋白tβrii-se/fc和尼达尼布的处理对真皮厚度(白色箭头)和真皮白色脂肪组织(dwat)(黑色箭头)的影响(a)。真皮厚度(b)和dwat厚度(c)的定量。#p《0.1；**p《0.01。
[0015]
图3：masson三色染色的皮肤组织的代表性显微照片显示出，在具有博莱霉素诱导的皮肤纤维化的小鼠中，用tβrii-se/fc融合蛋白和尼达尼布的处理的抗纤维化效果(a)。纤维化区域的定量(b)。#p《0.1；n.s.：不显著。
[0016]
图4：masson三色染色的肺组织的代表性显微照片显示出，用溶媒、tβrii-se/fc融合蛋白、和尼达尼布处理的动物中的博莱霉素诱导的肺纤维化(a)。作为ashcroft指数评价的肺纤维化的定量表明，与溶媒组(对照)相比，用tβrii-se/fc融合蛋白和尼达尼布的处理趋于减少纤维化(b)。#p《0.1。
[0017]
图5：在用tβrii-se/fc融合蛋白处理两周后，具有ccl
4-诱导的肝纤维化的大鼠中的转氨酶水平；alt(a)和ast(b)。*p《0.05；**p《0.01。
[0018]
图6：大鼠ccl
4-诱导的肝纤维化模型中，用tβrii-se/fc融合蛋白处理四周的组织学影响。用tβrii-se/fc的处理减少纤维化指数(a)和非酒精性脂肪肝病(nafld)的活动指数(b)、减少肝炎症(c)和卵圆细胞数(d)，表明对改善肝组织的积极效果。#p《0.1；*p《0.05；**p《0.01。
[0019]
图7：显示出tβrii-se/fc融合蛋白对人类皮肤外植体中的伤口修复的影响。处理4天后用masson三色染色溶液染色代表性切片。箭头表示新表皮(neoepidermis)的长度(a)。tβrii-se/fc在处理4天后对新表皮的生长的影响(b)。显示出在处理的第8天伤口完全闭合的外植体的定量(c)。受损皮肤外植体中tβrii-se/fc融合蛋白对新表皮的分化的影响(d)。*p《0.05。
[0020]
图8：tβrii-se/fc融合蛋白的抗衰老效果显示为增加人类皮肤外植体中i型胶原蛋白的生产。通过用tβrii-se/fc融合蛋白处理4天后的免疫荧光证实的胶原蛋白i表达的增加的代表性显微照片(a)。由于在用溶媒(对照)或tβrii-se/fc处理4和8天的外植体中胶原蛋白的存在而导致的荧光的定量(b)。***p《0.001。
[0021]
图9：肺纤维化模型中的肺取样的代表图。
[0022]
图10：使用3.5mm直径的活检穿孔器在矩形人皮肤外植体上实现机械性损伤(lesion)的代表图。
具体实施方式
[0023]
术语“tβrii-se/fc”和“tβrii-se/fc融合蛋白”具有相同的含义并且可以互换。在优选但不限制的实施方案中，融合蛋白具有与seq id no.1中所示的序列为85％、86％、87％；88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
[0024]
在一个实施方案中，人类免疫球蛋白的fc结构域是人类igg的fc结构域。在另一优选实施方案中，人类igg的fc结构域可以具有点突变以消除n-糖基化位点，从而获得去糖基化的fc结构域，例如igg1重链中的asn297gly变化。
[0025]
伤口被理解为，但不限于，作为切割、射击、挤压、摩擦、手术、糖尿病等的结果发生于身体的外部组织中的可以出血或可以不出血的损伤。
[0026]
治愈被理解为组织修复的生物学过程。
[0027]
皮肤衰老被理解为两个过程：内在过程，其随着时间的流逝而发生在皮肤中，或者外在过程，其通过引入人体的外源因素而产生，例如吸烟、过量饮酒、不良饮食、和长期暴露于阳光。衰老过程，内在的和外在的，都受到自由基(也称为活性氧类)的形成的影响。胶原蛋白的丧失被认为是衰老皮肤的特征性组织学发现。皱纹和色素变化与光老化直接相关，并且被认为是最明显的皮肤临床表现。这样的光损害代表了皮肤过早衰老的征象。此外，长期日晒的有害后果，特别是各种形式的光诱导的皮肤癌，也与急性和长期日晒有关。理解的是，通过减缓皮肤衰老来逆转这些皮肤临床表现。
[0028]
稳定剂可以是通过增加受体介导的蛋白质再循环、防止肾清除和减少酶促降解来增加融合蛋白的体内半衰期的任何稳定剂。
[0029]
融合蛋白可以在两部分之间包含配体。
[0030]
在皮肤纤维化的情况中，从第18天至第22天以及在第26天和第28天，尼达尼布组的平均体重显著低于溶媒组(对照)的体重(图1)。在溶媒组和tβrii-se/fc融合蛋白处理组之间，在研究期间的任何一天，平均体重没有显著差异。在饲养期间，所有组均没有动物死亡。没有动物的一般情况出现恶化。
[0031]
定量的h&e染色的皮肤切片的代表性显微照片(图2)显示出，与溶媒组相比，在用tβrii-se/fc融合蛋白处理的组中，真皮厚度统计学上的显著降低以及真皮白色脂肪组织(dwat)层的显著扩张。
[0032]
masson三色染色的皮肤的代表性显微照片和定量(图3)显示出，与溶媒组相比，tβrii-se/fc融合蛋白处理组中的纤维化面积趋于减少。在溶媒组和尼达尼布治疗组之间，纤维化面积没有显著差异。
[0033]
在肺纤维化的情况下，代表masson三色染色的肺切片的显微照片显示出用tβrii-se/fc融合蛋白处理的动物中的肺纤维化减少(图4)。与溶媒组相比，tβrii-se/fc和尼达尼布组的ashcroft评分趋于降低(图4)。
[0034]
如通过h&e染色和masson三色染色所证实的，溶媒处理组中形成了表皮肥大和皮肤纤维化。
[0035]
与溶媒处理组(对照组)相比，用tβrii-se/fc的处理显示出真皮厚度显著减少和纤维化面积减少的趋势。此外，tβrii-se/fc处理显示出dwat层显著增加。
[0036]
总之，这些结果表明tβrii-se/fc融合蛋白具有抑制皮肤纤维化和再生dwat层的
潜力。
[0037]
如通过masson三色染色试验和ashcroft评分所表明的，在溶媒组(对照组)中观察到肺纤维化的形成。
[0038]
与溶媒组相比，用tβrii-se/fc和尼达尼布的处理显示出ashcroft评分下降的趋势。
[0039]
总之，与溶媒组相比，用tβrii-se/fc的处理显示出ashcroft评分下降的趋势，表明tβrii-se/fc在肺纤维化中具有抗纤维化作用。
[0040]
在肝纤维化模型中进行的试验中，显示出在用ccl4的处理中，大鼠的血清中的alt和ast水平显著增加(图5)。在用tβrii-se/fc融合蛋白处理仅2周后(ccl4处理后4周)，通过双向anova分析，与模型组或对照组相比，接受5mg/kg或1mg/kg的动物显示出alt/ast的统计学上的显著差异(图5)。在最后一剂ccl4后24小时取样。
[0041]
纤维化评分、非脂肪性肝病指数(nafld)、炎性细胞浸润和卵圆细胞增生的统计学上的显著差异(#p《0.1，*p《0.05，**p《0.01)(图6)。
[0042]
h&e染色的肝切片的分析允许评价各组织学参数。kruskal-wallis分析以及随后的dunn检验表明纤维化评分、炎性细胞浸润和卵圆细胞增生的统计学上的显著差异(*p《0.05，**p《0.01)(图6)。
[0043]
用ccl4的处理显著增加alt/ast水平并促进肝纤维化。在每周2剂的处理2周后(4剂)，用tβrii-se/fc的处理显著减少alt/ast水平。
[0044]
用tβrii-se/fc的处理显著降低纤维化评分、炎性细胞浸润和卵圆细胞增生，表明肝纤维化的改善和肝结构的部分恢复。
[0045]
分析了活人类皮肤外植体中伤口修复和抗衰老模型的试验结果。结果显示，在以5和200μg/ml处理4和8天后，tβrii-se/fc被人类皮肤外植体很好地耐受。
[0046]
另一方面，在第4天，tβrii-se/fc融合蛋白显著增加伤口愈合31％(5μg/ml)和44％(200μg/ml)(图7a)。在第8天，用tβrii-se/fc(5或200μg/ml)处理的6个外植体中的5个显示完全的伤口愈合，而6个对照外植体中仅有2个闭合伤口(图7)。此外，在第8天，tβrii-se/fc显示出对新表皮的分化的显著效果(图7)。
[0047]
在处理4天和8天后刺激胶原蛋白i生产时，tβrii-se/fc融合蛋白也表现出统计学上显著的抗衰老活性(p《0.001)(图8)。
[0048]
tβrii-se/fc诱导受损皮肤外植体中的新表皮的形态、迁移、增殖、细胞粘附和分化的显著增加。
[0049]
tβrii-se/fc还诱导真皮中的胶原蛋白i生产的显著增加。
[0050]
实施例1：tβrii-se/fc生产和tβrii-se/fc用于治疗皮肤和肺纤维化的用途。tβrii-se/fc根据marcela bertolio,等,frontiers in cell and developmental biology.9:690397.doi:10.3389/fcell.2021.690397(2021)中所述的方法来生产。
[0051]
根据研究方案，将tβrii-se/fc(5.2mg/ml)稀释于pbs ph 7.4中。尼达尼布购自chemexpress co.,ltd.(china)。为了制备给药溶液(dosing solution)，称重尼达尼布并重悬浮于1％甲基纤维素中。
[0052]
组合物的施用途径和剂量：在肺纤维化模型中从第7天至第20天(第7、10、14和17天)(4剂)和在皮肤纤维化模型中直至第28天(6剂)，每周两次以5ml/kg(5mg/kg)的体积静
脉内施用tβrii-se/fc。在肺纤维化模型中从第7天至第20天和在皮肤纤维化模型中直至第28天，以10ml/kg(100mg/kg)的体积、每天一次口服施用尼达尼布。
[0053]
动物：三十只6周龄雌性c57bl/6j小鼠获得自japan slc,inc.(japan)。这些小鼠在受控条件下圈养并喂以正常饮食(ce-2；cleajapan)。本研究中使用的所有动物都按照以下指南进行护理：1)动物福利和处理法(日本环境省，1973年10月1日第105号法律)；2)与实验动物的护理和处理以及疼痛缓解有关的标准(日本环境省第88号通告，2006年4月28日)；3)适当进行动物实验的指南(日本科学委员会，2006年6月1日)。
[0054]
在温度(23
±
3℃)、湿度(50
±
20％)、光照(12小时人造光和黑暗循环；8:00至20:00光照)和空气交换的受控条件下，将动物置于spf设施中。实验室内保持高压以避免设施的污染。
[0055]
将动物圈养在tpx笼子(clea japan)中，最多每个笼子5只小鼠。清洁无菌纸(japan slc)用作动物的垫料，每周更换一次。通过耳朵穿孔来识别小鼠。每个笼子给予一个特定的识别码。
[0056]
任意提供普通无菌饮食，置于笼子的顶部的金属盖中。ro水也由装有橡胶塞和吸管的水瓶任意供给。水瓶每周更换一次，清洗，高压灭菌，并重复使用。
[0057]
blm诱导的肺纤维化小鼠模型的诱导：在第0天，通过使用微型喷雾器(penn-century,usa)，以3.0mg/kg的剂量、每只动物50μl的体积单次气管内施用盐水中的盐酸博莱霉素(blm,nippon kayaku,japan)，在30只小鼠中诱导了肺纤维化的发展。
[0058]
blm诱导的皮肤纤维化模型的诱导：基于blm施用前一天的小鼠的体重，将小鼠随机分为3组，每组10只。在第0天，每隔一天(第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26)以50μl的体积、以50μg/小鼠的剂量对30只小鼠皮下施用盐水中的blm(lot#391870,nippon kayaku,japan)。
[0059]
动物检测和处死：每天监测生存能力、临床症状和行为。从第0天开始每天记录体重。基于最后一次体重调整剂量。每次施用后约60分钟，观察小鼠的毒性、发病率和死亡率的显著临床征象。在第21天(肺纤维化模型)和第28天(皮肤纤维化模型，在美托咪定(0.75mg/kg)、咪达唑仑(4mg/kg)和布托啡诺(5mg/kg)的混合物麻醉下，通过经腹部腔静脉放血处死动物。记录给药和结束的时间。记录所有小鼠的左叶和下腔叶(post-cava lobe)的重量。
[0060]
样本收集：结扎左叶和下腔的支气管以避免固定剂的泄漏。将永久针插入气管并连接到注射器的滴注路径。注射器装有10％中性缓冲福尔马林，并保持在20cm的高度。然后用10％中性缓冲福尔马林灌注上(a)、中(b)和下(c)叶，并在膨胀后结扎。获取三个固定的叶，未固定的左肺(e)和未固定的下腔叶(d)。用冷盐水洗涤两个未固定的叶，并测量重量。
[0061]
将三个叶在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。固定后，将这些样品包埋在石蜡中用于masson三色染色。下腔叶(d)在液氮中快速冷冻并储存在-80℃用于进一步分析。左肺(e)立即在液氮中冷冻并储存在-80℃用于进一步分析(参见图9)。
[0062]
对于皮肤样品，收集预先剃毛的背部样品，并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。固定后，将这些样品包埋在石蜡中用于组织病理学分析。
[0063]
组织病理学分析：使用轮转式切片机(leica microsystems)将来自预先固定在10％中性缓冲福尔马林中的皮肤和右肺组织的石蜡块切成4μm的切片。
[0064]
对于h&e染色，在10％中性缓冲福尔马林中切割预先固定的皮肤组织石蜡块切片，并用lillie-mayer的苏木精(muto pure chemicals co.,ltd.,japan)和曙红溶液(fujifilm wako pure chemical corporation,japan)染色。对于真皮厚度的定量分析，用数码相机(dfc295；leica,germany)以100倍放大率捕捉he染色的切片的明视野图像，并使用imagej软件(美国国立卫生研究院(national institute of health,usa))在5个视野/切片中测量真皮厚度。
[0065]
对于皮肤和肺二者的masson三色染色，将切片脱蜡并再水合，然后用bouin溶液再次固定15分钟。切片在魏格特氏铁苏木精工作液(weigert's iron hematoxylin working solution,sigma-aldrich)、猩红-紫红色biebrich溶液(sigma-aldrich)、磷钨酸/磷钼酸溶液、苯胺蓝溶液和1％的乙酸溶液(acetic acid solution al 1％)(sigma-aldrich)中染色。对于肺纤维化面积的定量分析，使用数码相机(dfc295)以100倍放大率随机捕捉masson三色染色切片的明视野图像，并捕捉20个视野/小鼠的胸膜下区域，根据肺纤维化的分类标准进行评价(aschcroft t.等,j clin pathol,1988；41:467-70)。所有切片都由实验人员盲分析。
[0066]
肺纤维化等级(aschcroft评分)：
[0067]
0-1正常肺、或者肺泡或支气管壁轻微纤维化增厚。
[0068]
2-3壁中度增厚，但对肺结构无明显损害。
[0069]
4-5纤维化增加，对肺结构有明显损害，并且形成纤维带或小纤维块
[0070]
6-7结构严重变形，纤维化面积大；“蜂窝状”肺。
[0071]
8视野完全纤维化闭塞。
[0072]
对于ashcroft评分，将原始数据计算为整数。将每个切片(叶，上部、中部和下部)中的20个视野的平均值取作每个个体动物的ashcroft评分，并计算至小数点后一位。每个组的平均值和标准差四舍五入至小数点后两位，并计算至小数点后一位。
[0073]
使用graphpad prism 7(graphpad software inc.,usa)上的anova方法或bonferroni多重比较检验进行统计学分析。模型组用作对照组用于多重比较(dunnett检验)。p《0.05的值被认为是统计学上显著的。当p值《0.1时，假设有趋势。结果表示为平均值
±
sd。
[0074]
设计和处理方案
[0075]
皮肤纤维化模型：
[0076]
第1组：溶媒
[0077]
从第0天至第27天，对具有blm诱导的皮肤纤维化的10只小鼠，每周两次(星期一和星期五)以5ml/kg的体积静脉内施用磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph7.4(总计8剂)。
[0078]
第2组：tβrii-se/fc
[0079]
从第0天至第27天，对具有blm诱导的皮肤纤维化的10只小鼠，每周两次(星期一和星期五)以5ml/kg的体积、以5.0mg/kg的剂量静脉内施用补充有tβrii-se/fc的溶媒(总计8剂)。
[0080]
第3组：尼达尼布
[0081]
从第0天至第27天，对具有blm诱导的皮肤纤维化的10只小鼠，每天一次以10ml/kg的体积、以100mg/kg的剂量口服施用补充有尼达尼布的1％甲基纤维素。
[0082]
肺纤维化模型：在施用博莱霉素(blm)一周后，根据体重变化，将动物随机分为三个实验组：
[0083]
第1组：溶媒
[0084]
从第0天至第20天，对具有blm诱导的肺纤维化的10只小鼠，每周两次以5ml/kg的体积静脉内施用磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph 7.4(4剂)。
[0085]
第2组：tβrii-se/fc
[0086]
从第7天至第20天，对具有blm诱导的肺纤维化的10只小鼠，每周两次以5ml/kg的体积、以5.0mg/kg的剂量静脉内施用补充有tβrii-se/fc的溶媒(4剂)。
[0087]
第3组：尼达尼布
[0088]
从第7天至第20天，对具有blm诱导的肺纤维化的10只小鼠，每天一次以10ml/kg的体积、以100mg/kg的剂量口服施用补充有尼达尼布的1％甲基纤维素。
[0089]
实施例2：tβrii-se/fc用于治疗肝纤维化的用途
[0090]
以1和5mg/kg试验tβrii-se/fc。将储存在-80℃的5.2mg/ml储备溶液在冰上解冻并保持在4℃。在给药前，用无菌pbs将储备溶液稀释成1mg/ml或0.2mg/ml工作液。
[0091]
组合物的施用途径和剂量：从第3周至第6周，每周两次以5ml/kg的体积、以1和5mg/kg静脉内施用tβrii-se/fc(8剂)。
[0092]
动物：42只雄性sprague dawley大鼠，spf级，来自中国科学院的上海实验动物中心(shanghai laboratory animal center(slac)of the chinese academy of sciences)，体重为180-200克。在研究期间，任意提供正常食物，并且动物可以自由获得饮用水。
[0093]
到达后，动物在特定无病原体(spf)设施中圈养以适应环境。圈养条件为温度20-26℃、湿度40-70％、和12小时光照/12小时黑暗的循环。7天后，收集血液，并通过以5,000rpm离心10分钟来制备血清，然后用于alt/ast测量。
[0094]
大鼠中通过ccl4诱导肝纤维化：每周三次(tiw)通过口服管饲来施用橄榄油中的25％四氯化碳(ccl4)，从而诱导肝纤维化。适应环境后，32只大鼠通过口服管饲以0.5ml/kg(795mg/kg)的剂量、以1ml的体积接受ccl4，每周3次(tiw)，持续2周。相反，10只大鼠接受溶媒(橄榄油)(对照组)。处理两周后，处死2只对照动物，通过天狼星红染色来证实纤维化。
[0095]
动物监测和处死：每天监测生存能力、临床征象和行为。每周记录体重。在6周的研究后，处死动物。
[0096]
样本收集：在第0周和第2周采集血液用于alt/ast测量。通过以5,000rpm离心10分钟来制备血清样品。
[0097]
完成后，通过心脏穿刺抽取血液，如前所述制备血清。解剖肝脏并称重。拍照后，在福尔马林中固定左叶，然后转移至组织病理学实验室用于h&e染色。
[0098]
alt/ast测量：用全自动生化分析仪(mindray bs-380)测量血清alt和ast。
[0099]
组织病理学分析：使用轮转式切片机(leica microsystems)以4μm对来自在10％中性缓冲福尔马林中预先固定的肝组织的石蜡块进行切片。
[0100]
对于h&e染色，将切片脱蜡并再水合，然后用苏木精溶液染色，置于0.25％hcl-酒精中，在曙红中复染，脱水并安装在盖玻片上。一位专家对切片进行如下盲分析；纤维化程度、炎性细胞浸润、脂肪变性、肝细胞的变性/坏死。
[0101]
如下进行评分：
[0102]
纤维化的程度
[0103]
0-无纤维化。
[0104]
1-纤维化扩张，具有短纤维隔膜。
[0105]
2-大部分小叶中心区域的纤维化扩张，具有或不具有短纤维隔膜。
[0106]
3-纤维化扩张，偶尔在小叶中心和/或门区(portal area)之间桥接纤维化。
[0107]
4-纤维化扩张，在小叶中心和/或门区之间桥接纤维化。
[0108]
5-在小叶中心和/或门区之间桥接纤维化，偶尔有结节(不完全肝硬化)。
[0109]
6-肝纤维化(可能的或确定的)，具有结节的严重的桥接纤维化。
[0110]
一般组织病理学分类方案：
[0111]
0-无显著发现；1-最小；2-轻微；3-中度；4-显著；5-严重；
[0112]
使用graphpad prism 7(graphpad software inc.,usa)、根据需要使用anova(参数)或kruskal-wallis(非参数)检验进行统计学分析。模型组用作对照组用于多重比较(dunnett或dunn检验)。p《0.05的值被认为是统计学上显著的。当p值《0.1时，假设有趋势。结果表示为平均值
±
sd。
[0113]
设计和处理方案：在ccl4处理2周后，基于大鼠血清alt/ast水平，将30只大鼠随机分为3组。连续施用ccl4或溶媒直至第6周。在用ccl4处理前2小时由的，通过静脉内注射以5ml/kg每周两次(biw)施用tβrii-se/fc，如下所述：
[0114]
第1组(溶媒)：从第3周至第6周biw以5ml/kg的体积向10只健康动物静脉内施用溶媒(pbs ph 7.4)。继续施用通过口服管饲tiw的橄榄油直至结束。
[0115]
第2组(ccl4模型)：具有ccl4诱导的肝纤维化的10只大鼠从第3周至第6周biw静脉内接受5ml/kg的体积的溶媒(pbs ph 7.4)(8剂)。通过tiw口服管饲继续施用795mg/kg ccl4直至完成。
[0116]
第3组(高剂量)：具有ccl4诱导的肝纤维化的10只大鼠从第3周至第6周，biw以5ml/kg的体积、以5mg/kg的剂量静脉内施用tβrii-se/fc(8剂)。通过tiw口服管饲继续施用795mg/kg ccl4直至完成。
[0117]
第4组(低剂量)：具有ccl4诱导的肝纤维化的10只大鼠从第3周至第6周biw以5ml/kg的体积、以1mg/kg的剂量静脉内施用tβrii-se/fc(8剂)。通过tiw口服管饲继续施用795mg/kg ccl4直至完成。
[0118]
实施例3：tβrii-se/fc用于治疗和修复伤口；以及用于减少活人类皮肤外植体的衰老的用途
[0119]
研究的目的在于使用活人类皮肤外植体评价两种浓度的tβrii-se/fc对伤口愈合和皮肤衰老的影响。
[0120]
伤口愈合效果通过以下来评价：分析受伤区域和非受伤区域的一般形态，关注于生长芽(growth bud)，
[0121]
分析生长芽的长度。
[0122]
通过以下来评价抗衰老效果：胶原蛋白i免疫染色。
[0123]
以5(p1)和200(p2)μg/kg检验tβrii-se/fc。将储存在-80℃的5.2mg/ml储备溶液在冰上解冻并保持在4℃。给药前，将储备溶液稀释于培养基中。每次重新开始处理时，所有
稀释液都是临时制备的。
[0124]
外植体准备：在来自一名55岁白人女性(参考：p2422-ab55)的腹部整形手术(tummy tuck)中，制备21个圆形皮肤外植体(直径12mm)和21个矩形皮肤外植体(10x15mm)。外植体在37℃、在5％ co2的潮湿气氛中、在bem培养基(bio-ec外植体培养基)中保持存活。
[0125]
外植体的分布：如下表1所述，将外植体分为8组。
[0126]
机械性损伤的表现：在每个矩形外植体中，对于批次b0、b、bp1和bp2，用3.5mm直径活检穿孔器在第0天进行两次机械性损伤(参见图10)。
[0127][0128]
处理：在第0天(d0)、d2、d4和d6，将产物p1和p2混入至讨论中的批次的培养基中。将一半的培养基(1ml)更新至d2、d4和d6。对照外植体未接受处理。
[0129]
抗衰老活性的取样和测量：在d0，收集来自t0批次的3个外植体，并切成两部分。一半在缓冲福尔马林中固定，另一半在-80℃下冷冻。在d4和d8，收集来自批次t、p1和p2的3个外植体，并以相同方式处理。
[0130]
伤口修复活性的评价：在d0，收获批次b0的3个外植体，并切成三部分。第一部分在缓冲福尔马林中固定，第二部分在-80℃冷冻，第三部分作为rna储存用于最终的转录组分析。在d4和d8，收集来自批次b、bp1和bp2的3个外植体，并以相同方式处理。
[0131]
组织学研究：在缓冲福尔马林中固定24小时后，使用leica tp 1010自动脱水设备将样品脱水并包埋在石蜡中。然后使用leica包埋站eg 1160将样品包埋。使用leica rm 2125minot型切片机制备5μm厚切片，然后固定在组织学载玻片上。使用leica dmlb或olympus bx43显微镜进行显微镜观察。用带有celld存储软件的olympus dp72数码相机将这些图像数字化。
[0132]
一般形态学：表皮和真皮结构以及生长芽的一般形态学观察在根据masson三色染色、goldner变体染色石蜡切片后进行。
[0133]
胶原蛋白i免疫染色：胶原蛋白i免疫染色是对冷冻皮肤切片进行的，用多克隆抗胶原蛋白i抗体(monosan,ref.ps047)，在pbs-0.3％ bsa中1:50稀释，并在室温下孵育1小时。通过alexafluor 488(life technologies,ref.a11008)显示染色。随后用碘化丙啶染色细胞核。人工进行染色并通过显微镜观察进行评价。

技术特征：
1.一种治疗有需要的哺乳动物中的纤维化的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性tgf-βii型受体与seq id no.1中所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述稳定剂包含人类免疫球蛋白的fc结构域。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维化选自由肝纤维化、肺纤维化和皮肤纤维化组成的组。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述人类患有非酒精性脂肪性肝炎(nash)、硬皮病/系统性硬化症(ssc)、特发性肺纤维化、和原发性胆汁性胆管炎(pbc)中的选定病症或疾病。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与seq id no.2中所示的序列具有至少85％同一性。8.一种用于治疗纤维化的组合物，其中所述组合物包含与稳定剂连接的可溶性ii型tgf-β受体、和药学上可接受的赋形剂；其中纤维化选自由肝纤维化、肺纤维化和皮肤纤维化组成的组。9.一种用于愈合有需要的哺乳动物中的伤口的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述可溶性tgf-βii型受体与seq id no.1中所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述稳定剂包含人类免疫球蛋白的fc结构域。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与seq id no.2中所示的序列具有至少85％同一性。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。14.一种用于伤口愈合的组合物，其中所述组合物包含含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体；和药学上可接受的赋形剂。15.一种用于减缓人类皮肤衰老的方法，其中所述方法包括向所述人类施用有效量的含有与稳定剂结合的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述可溶性tgf-βii型受体氨基酸序列与seq id no.1中所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述稳定剂包含免疫球蛋白的fc结构域。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与seq id no.2中所示的序列具有至少85％同一性。19.一种用于减少人类皮肤衰老的化妆品组合物，其中所述组合物包含含有与稳定剂连接的可溶性tgf-βii型受体；和可接受的赋形剂。20.含有与稳定剂连接的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白用于制备用于治疗纤维化的药物的用途。21.含有与稳定剂连接的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白用于制备用于伤口愈合的药物的用途。
22.含有与稳定剂连接的可溶性tgf-βii型受体的融合蛋白用于制备化妆品组合物来减少人类皮肤衰老的用途。

技术总结
公开了一种通过施用含有与稳定剂结合的可溶性II型TGF受体的融合蛋白来治疗不同纤维化如肝纤维化、肺纤维化或皮肤纤维化、伤口愈合和皮肤再生的方法。合和皮肤再生的方法。合和皮肤再生的方法。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：美国伯乐有限公司
技术研发日：2021.10.04
技术公布日：2023/8/8