一种抑制蛋白酶的天然活性组合物及在化妆品中的应用的制作方法

1.本发明属于化妆品原料领域，尤其涉及一种促进小分子蛋白稳定的天然活性组合物。


背景技术：

2.皮肤中存在各类水解酶，皮肤作为人体最大的组织器官，不仅具有屏障功能、抵御外界因素对人体造成的伤害，同时也具有自身的生理功能。人类皮肤中发现和提纯的肽链内切酶，有酪蛋白水解酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、白明胶酶和弹力蛋白酶、激肽释放酶、c1-酯酶、纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶、钙离子激活蛋白酶等。肽链外切酶有氨肽酶、羧肽酶、二肽基肽酶和二肽酶。细胞外基质（ecm）的降解，通过基质金属蛋白酶(mmp)、组织蛋白酶(cathepsin)、丝氨酸蛋白酶等，调节侵袭和迁移，特别是通过切割层粘连蛋白-5、il-6r，i型胶原蛋白，破坏组织结构。
3.小分子蛋白，主要指蛋白质经过水解后，富集水解产物获得1kd-80kd分子量的小分子蛋白，如水解乳清蛋白、纤连蛋白、水解胶原蛋白等。补充肌肤需要合成的蛋白质前体物质-氨基酸、蛋白片段；或者直接补充肌肤结构物质如i型、iii型、vii型、xvii型胶原；还可以参与信号通路，具有一定类生长因子的功效，调控角质形成细胞、成纤维细胞等参与组织的分化和增殖，加速细胞的迁移、增长代谢率，加速细胞的生长。从而可以实现保湿、抗皱、美白等功效，作为新兴的护肤品功效原料广泛使用各类剂型。化妆品应用时经过涂抹、促渗、仪器或配方联合，提高小分子蛋白类物质的渗透作用，进去皮肤的表皮层、基底层，进而深入至真皮层发挥功效。但是由于来源为蛋白质虽然经过水解或者改性，会失去原有的蛋白质三级螺旋交联结构，但是蛋白质的活性位点，依然存在，会受到皮肤中酶类特别是水解酶类的作用，被水解，失去初始结构，功效也会大打折扣。
4.天然活性成分主要来源于植物、动物和微生物等天然生物，经过提取、纯化、浓缩获得的具有结构多样性和生物活性，属于天然产物范畴，以植物来源为主，种类繁多。如何利用天然产物中的活性物质，对肌肤中能够水解蛋白的酶类进行抑制，同时实现小分子蛋白的功效，实现护肤品配方成分的有效协同作用是现在亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种抑制蛋白酶的天然活性组合物, 利用天然产物的活性物对肌肤中水解蛋白酶的有效抑制，提高小分子蛋白质在应用时的结构稳定性。
6.为解决上述技术问题，本发明的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物的具体技术方案如下：一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，由金缕梅、无患子、海茴香、燕麦、高山火绒草组成；进一步的，组合物由以下比例混合而成：金缕梅提取物15-35份，无患子提取物15-35份，海茴香提取物3-7份，燕麦提取物
10-20份，高山火绒草提取物10-20份；更进一步的，金缕梅提取物25份，无患子提取物25份，海茴香提取物5份，燕麦提取物12.5份，高山火绒草提取物12.5份；进一步的，金缕梅提取物为弗吉尼亚金缕梅（hamamelis virginiana l.）花提取物，无患子提取物为无患子（sapindus saponaria l.）果实提取物、高山火绒草（leontopodium brachyactis gandog）提取物为地上部分提取物、燕麦提取物为燕麦（avena sativa l.）果仁提取物、海茴香提取物为海崖芹（crithmum maritimum l.）全株提取物；本发明的第二个目的是提供一种抑制蛋白酶的天然活性组合物的制备方法如下:s1脱水：对无患子果、高山火绒草地上部分、金缕梅花、燕麦颗粒、海茴香全株，5种植物进行烘干脱水处理；s2粉碎：将干物质进行粉碎机粉碎，并过100-300目筛；s3醇提：利用水醇浸泡提取，70%乙醇与干物质按照10:1浸泡12小时；过300目滤网、滤纸过滤得到滤液；s4浓缩：对滤液进行水浴真空浓缩，获得浸提液；s5纯化：浸提液分别经过凝胶柱和活性炭进行纯化，获得样品待用。
7.本发明的第三个目的是本组合物作为天然护肤功效成分，建立体外抑制水解酶对小分子蛋白体外抑制模型。
8.进一步的，所述蛋白酶为皮肤中各类蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶。
9.进一步的，半胱氨酸蛋白酶最大的亚族为木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。哺乳动物中，木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶被称为硫醇依赖性组织蛋白酶。木瓜蛋白酶和组织蛋白酶b属于同系物。
10.进一步的丝氨酸蛋白酶指可以降解结构性蛋白的酶类，包括纤维蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、组织蛋白酶e。
11.进一步的半胱氨酸蛋白酶指可以降解胶原激活胶原酶的酶类，包括组织蛋白酶b、组织蛋白酶l、组织蛋白酶n、钙蛋白酶。
12.进一步的天冬氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶d、胃蛋白酶。
13.进一步的基质金属蛋白酶包括胶原酶、明胶酶、基质溶解酶。
14.进一步的，所述小分子蛋白包括纤连蛋白、乳清蛋白、胶原蛋白、大豆蛋白等活性物。
15.进一步的，小分子蛋白中的乳清蛋白，特别是牛乳的乳清蛋白，乳清蛋白含量≥20%。经过碱性蛋白酶水解后，获得分子量20-40k的蛋白混合物。
16.进一步的，纤连蛋白是通过微生物发酵获得与人体同源性高的纤连蛋白20-45k，含糖4.5-9.5%，具有v字型的二聚体的fn。
17.进一步的，胶原蛋白来自于鱼皮经过弹性蛋白水解后获得各种片段的胶原蛋白，分子量10-60k之间混合物。
18.进一步的，体外抑制模型，利用紫外分光光度计法筛选天然组分对酶活性影响，计算抑制率，可作为广泛筛选植物组分的方法。
19.进一步的，体外抑制模型，利用蛋白电泳检测蛋白及同时使用天然植物经过透皮后，蛋白的条带宽度、亮度，可作用指征植物提取物对蛋白的保护性。
20.本发明的第四个目的是本组合物作为天然护肤功效成分，抑制蛋白酶对小分子蛋白的水解在化妆品领域的应用。
21.进一步的，所述具有抑制蛋白酶的天然活性组合物，按质量比0.1%-10%添加至化妆品中。
22.进一步的，所述化妆品包括化妆水、面膜、啫喱、乳液和膏霜等各种护肤剂型。
23.本发明的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物具有以下优点：本发明提供了一种由患子果、高山火绒草地上部分、金缕梅花、燕麦颗粒、海茴香提取物复配而成的组合物，该组合物可以添加到不同类型的化妆品中，特别是添加有小分子蛋白的化妆品，不仅可以发挥组合物自身的作用，同时还可以安全有效的抑制皮肤中水解蛋白酶类特别是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，避免小分子蛋白的水解，让小分子蛋白尽可能保持添加时的结构与分子量，实现化妆品功效最大化。
附图说明
24.图1为本发明的电泳结果图；图中标记说明：1、空白（木瓜蛋白酶）；2、对照（纤连蛋白）；3、阳性对照（正常水解）；4、mark；5、实施例1；6、实施例2；7、实施例3；8、实施例4；9、实施例5；10、实施例6。
实施方式
25.为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种抑制蛋白酶的天然活性组合物做进一步详细的描述。
26.皮肤细胞的能量代谢会存在糖有氧氧化和无氧酵解的全套酶系，包括琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、丙酮酸脱氢酶、糖原合成酶、葡萄糖磷酸化酶等；脂质代谢表皮中有许多降解磷脂类物质的酶（如磷脂酶和碱性磷酸酶），可将底物降解成脂肪酸、甘油、磷酸和胆碱。
27.皮肤中涉及的蛋白酶类型主要包括半胱氨酸组织蛋白酶，如负责降解胶原的组织蛋白酶b、组织蛋白酶l、组织蛋白酶；丝氨酸蛋白酶，如能够降解结构蛋白的纤维蛋白、弹性蛋白和组织蛋白酶g、组织蛋白酶e;以及天冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶。木瓜蛋白酶属于广谱型水解酶，在化妆品中可以水解角质细胞间连接蛋白，剥脱角质。同样木瓜蛋白酶能够水解化妆品成分中的小分子蛋白类物质， 小分子蛋白主要指皮肤可用的，具有抗衰、紧致、去皱、提亮功能蛋白质经过或不经过酶水解，且分子量在1kd-80kd之间，如乳清蛋白、水解乳清蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、水解胶原蛋白。
28.为提高小分子蛋白稳定性，发挥功能针对的抑制的皮肤水解蛋白酶主要包括：能够水解细胞外基质（ecm）的酶类。半胱氨酸蛋白酶（组织蛋白酶b/l/n、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、钙蛋白酶）；基质金属蛋白酶（胶原酶、明胶酶、基质溶酶）；天冬氨酸蛋白酶（组织蛋白酶d、胃蛋白酶）；丝氨酸蛋白酶（纤维蛋白酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶g/e）。
29.抑制酶类优选半胱氨酸蛋白酶最大的亚族为木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。哺乳动物中，木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶被称为硫醇依赖性组织蛋白酶。木瓜蛋白酶和组织
蛋白酶b属于同系物。
30.天然活性成分化学结构复杂、数量繁多，既包括组成生物体的化学物质，也包含新陈代谢过程中一系列的产物，以及生命活性的作用物质，根据结构、生理活性、来源等常见的化学成分如：生物碱、糖及其苷、醌类、苯丙素类、黄酮类、萜类、甾体类、有机酸、鞣质、氨基酸和蛋白类。
31.天然产物中的活性天然产物本身就可以作为化妆品原料使用，同时利用其活性物质，对肌肤中能够水解蛋白的酶类进行抑制，属于可逆的抑制性质，非让酶失活，实现护肤品配方成分的有效协同作用。
32.金缕梅提取物，以其高水平的单宁和其他酚类物质而闻名，广泛用于治疗皮肤疾病，主要成分包括：没食子酸、山奈酚和槲皮素苷，羟基肉桂酸等。单宁单宁组分在树皮中所占比例高达12%。
33.海茴香(crithmum maritimum l.) 种兼生盐生植物，生长在海上悬崖上，有时也生长在沙土中。它广泛分布在地中海和大西洋沿岸地区，长期以来被用作食品配料和民间药物。次生代谢产物含量高，是一种具有多种经济价值的可食用盐生植物。海茴香叶含有丰富的酚类化合物，尤其是绿原酸。不同生长季节和不同生长环境绿原酸含量有差异，3mg-33mg/g。海茴香主要成分是绿原酸和酚酸也属于多酚类化合物。邻茶酚和没食子酚部分通过氢键、π相互作用、疏水相互作用、金属配位、共价键和静电相互作用促进了它们与蛋白质具有结合亲和力，蛋白质和多肽，具有氨基、羧基和羟基，它们可以作为多酚的结合单位可以用作组装和修饰多酚。多酚通过非共价键和(或)共价键与蛋白质具有很强的结合亲和力，从而改变其结构和性质。多酚也可能通过与消化酶形成复合物而消耗。金缕梅提取物、海茴香提取物分别与木瓜蛋白酶和纤连蛋白利用共价键或非共价键结合，影响木瓜蛋白酶的活性，同时与纤连蛋白以组合物形式进入皮肤，发挥作用。
34.无患子果皮中富含三萜皂苷，具有杀菌，消炎、抗氧化等药理功效。水浸提可获得皂苷得率56.84%。皂苷类物质可能会与蛋白的内源荧光发生猝灭，内源荧光猝灭过程既有静态猝灭又有动态猝灭联合过程，皂苷类物质与蛋白基态一起形成复合物，从而使得肽链松弛，蛋白的二级结构的改变。活性改变。另外可以通过非竞争性抑制，与蛋白酶活性位点附近区域结合并未形成皂苷与酶复合物，降低酶活性，避免纤连蛋白的结合。
35.木瓜样半胱氨酸蛋白酶，它是半胱氨酸蛋白酶类中最大的亚家族(ca族，c1族)。木瓜样半胱氨酸蛋白酶在动植物王国中广泛表达，在病毒和细菌中也被发现。哺乳动物类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶也被称为巯基依赖性组织蛋白酶。组织蛋白酶b/l是木瓜蛋白酶同系物，组织蛋白酶b与木瓜蛋白酶亲缘关系最近。 配体与巯基蛋白酶(木瓜蛋白酶和组织蛋白酶b)的相互作用模式，为组织蛋白酶b抑制剂的设计提供有用的信息。抑制木瓜蛋白酶活性天然提取物也为做光谱型抑制半胱氨酸类酶提供了可能性。
实施例
36.将无患子果、高山火绒草地上部分、金缕梅花、燕麦颗粒、海茴香5种植物的全株，分别按照如下步骤进行处理：脱水：将上述植物的全株进行烘干脱水处理；粉碎：将烘干后得到的干物质通过粉碎机粉碎，过100-300目筛；
醇提：将70%乙醇与干物质按照10:1的比例混合浸泡12小时，将浸泡后的混合物通过300目滤网，得到滤液；浓缩：对滤液进行水浴真空浓缩，获得浸提液；纯化：浸提液分别经过凝胶柱和活性炭进行纯化，获得天然产物样品待用。
37.将上述获得的无患子果、高山火绒草地上部分、金缕梅花、燕麦颗粒、海茴香5种植物浸提液，按照表1中的比例进行混合制成样品进行后续实验。
38.表1
39.体外抑制模型建立将表2中酶液，提取物/edta/磷酸盐缓冲溶液2ml，40℃水浴10分钟；空白组加入三氯乙酸4ml,对照组、阳性对照组加入酪蛋白2m, 40℃水浴10分钟；空白组加入酪蛋白2ml，其余组均加入三氯乙酸4ml，摇晃均匀，静止1小时；取上清2ml，进行14kg/min，5分钟离心，取上清进行275nm 吸光度检测。
40.表2
41.抑制率=（测试组od-提取物/5 od-对照组od）/对照组od表3
42.根据体外模型检测所得抑制率结果（如表3所示），阳性对照表明实验过程具有可行性。实施例组合物均有一定的抑制木瓜蛋白酶效应。优选实施例6组合物。
43.底物过量体外模型建立表4
44.按照表4的量，将酶液与缓冲液混合，40℃反应10分钟，去反应液30μl，加入5μl蛋白变性剂，电热板95℃加热5分钟，进行电泳检测。
45.根据底物过量体外模型试验（图1），木瓜蛋白酶由于浓度低在电泳条带上未显示，阳性对照组表明实验可行性，根据纤连蛋白主要条带做参照系对比，实施例3、4、5、6均具有一定的抑制效率，主要条带蛋白有所保留，未完全抑制，根据主条带颜色与宽度分析抑制效率最高优选实施例6。
46.裁剪适当大小的猪腹部皮肤（未经开水烫，去除毛发），皮肤角质层朝上,固定在franz-type扩散池中。 取待测样品适量均匀涂布于皮肤上，在接受池中加生理盐水，37℃恒温水浴，用磁力搅拌器搅拌。分别于涂布后定时（2h、4h、8h、16h、24h）吸取接受液1ml，用bca法测定纤连蛋白浓度。
47.使用franz扩散池进行透皮吸收试验，能够较为客观地反映透皮制剂的药物释放过程。
48.待测样品为：对照组0.2mg/ml纤连蛋白600微升,2ml缓冲溶液；测试组为0.2mg/ml纤连蛋白600微升,实施例1-6 2ml。
49.表5（单位：mg）
50.结果显示实施例3、4、5、6在扩散池的浓度每个时间节点的纤连蛋白浓度均高于对照组在扩散池中的纤连蛋白浓度，说明组合物有助于提高纤连蛋白扩散池的浓度。
51.分别取自46岁和54岁女性捐献者，作为皮肤外植体的研究。外植体在生理条件下
培养，局部加入待测样品，2h、8h、24h后，组织固定后使用拉曼光谱评估样品的渗透和组织分布。
52.3d皮肤测试纤连蛋白到达真皮的浓度。
53.待测样品为：对照组0.2mg/ml纤连蛋白600微升,2ml缓冲溶液；测试组为0.2mg/ml纤连蛋白600微升,实施例1-6 2ml。
54.基于辐射（光）-介质（样品）的相互作用，拉曼光谱提供了定量和半定量数据，可以显示样品到达组织的深度。
55.表6（单位：μm）
56.结果显示3、4、5、6 在外植体中可到达的组织深度，每个时间节点均高于对照组在外植体的深度，说明组合物有助于提高纤连蛋白的渗透。尤其是实施例6具有明显的提高纤连蛋白在真皮层浓度的作用。
57.分别取自46岁和54岁女性捐献者，作为皮肤外植体的研究。外植体在生理条件下培养，局部加入待测样品， 24h后，组织破碎后bca测定纤连蛋白浓度。
58.待测样品为：对照组0.2mg/ml纤连蛋白600微升,2ml缓冲溶液，测试组为0.2mg/ml纤连蛋白600微升,实施例1-6 2ml。
59.表7（单位：mg）
60.结果显示未经过外植体培养的纤连蛋白总物质为0.12mg，对照组经过渗透浓度明显降低，说明纤连蛋白在渗透的过程存在一定的渗透率，且部分被水解。实施例3、4、5、6 在外植体中可浓度高于样品对照组在外植体的浓度，尤其是实施例6明显高于对照组。说明组合物有助于提高纤连蛋白透皮吸收。
61.测试例将本发明的提取物按照表8进行配制，并进行后续的测试。
62.表8
63.纤连蛋白活性测试（1）人体实验面部平滑评价实验方法，选择30名35-50岁亚洲女性，随机分成每组10名，共三组。分别涂抹测试组、对照组1和对照组2，每天全脸涂抹两次。对每位测试者分别进行0天，14天的面部visia数据采集，分为左右脸颊进行平滑度分析求取变化百分比，-表示减少百分率，+表示增加百分率，对10名测试人员求取平均值。进行显著性差异分析。
64.表9
65.结果显示测试组的左右脸颊平滑度提升幅度明显优于对照1组和对照2组。对照1组也能够不同程度优化肌肤平滑度，说明纤连蛋白能够被皮肤细胞吸收而发挥具有局限的作用。对照2组具有更加弱的提升肌肤平滑度。但是对照1组和对照2单独测试的数据叠加依然小于测试组对肌肤平滑的提升。显示金缕梅提取物、无患子提取物、高山火绒草提取物、海茴香提取物、燕麦提取物有助于纤连蛋白发挥抗衰和紧致的作用。
66.实验方法，选择30名35-50岁亚洲女性，随机分成每组10名，共三组。分别涂抹测试组、对照组1和对照组2，每天全脸涂抹两次。对每位测试者分别进行0天，14天的面部ck数据采集，分为左右脸颊进行弹性r2、r7分析求取变化百分比，-表示减少百分率，+表示增加百分率，对10名测试人员求取平均值。进行显著性差异分析。
67.r2=ua/uf，无负压时皮肤的回弹量与有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近1，说明皮肤弹性越好。r7=ur/uf，在皮肤测试的第一次循环中，皮肤恢复过程中的弹性部分与这次循环过程中皮肤的最大拉升量之比，越接近1，说明皮肤弹性越好。
68.表10
69.结果显示测试组的左右脸颊弹性提升幅度明显优于对照1组和对照2组。对照1组也能够不同程度提升肌肤弹性，说明纤连蛋白能够被皮肤细胞吸收而发挥具有局限的作用。对照2组具有更加弱的提升肌肤弹性作用。但是对照1组和对照2单独测试的数据叠加依然远小于测试组对肌肤弹性的改善。显示金缕梅提取物、无患子提取物、高山火绒草提取物、海茴香提取物、燕麦提取物有助于纤连蛋白发挥抗衰和紧致的作用。
70.可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本技术的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

技术特征：
1.一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，由金缕梅、无患子、海茴香、燕麦、高山火绒草组成。2.根据权利要求1所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，该组合物由以下比例混合而成：金缕梅提取物15-35份，无患子提取物15-35份，海茴香提取物3-7份，燕麦提取物10-20份，高山火绒草提取物10-20份。3.根据权利要求1所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，金缕梅提取物25份，无患子提取物25份，海茴香提取物5份，燕麦提取物12.5份，高山火绒草提取物12.5份。4.根据权利要求1所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，所述金缕梅提取物为弗吉尼亚金缕梅花提取物，无患子提取物为无患子果实提取物，高山火绒草提取物为地上部分提取物、燕麦提取物为燕麦果仁提取物、海茴香提取物为海崖芹全株提取物。5.根据权利要求1所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物的制备方法，其特征在于：s1脱水：对无患子果、高山火绒草地上部分、金缕梅花、燕麦颗粒、海茴香全株，5种植物进行烘干脱水处理；s2粉碎：将干物质进行粉碎机粉碎，并过100-300目筛；s3醇提：利用水醇浸泡提取，70%乙醇与干物质按照10:1浸泡12小时；过300目滤网、滤纸过滤得到滤液；s4浓缩：对滤液进行水浴真空浓缩，获得浸提液；s5纯化：浸提液分别经过凝胶柱和活性炭进行纯化，获得样品待用。6.根据权利要求1-4任一所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物及在化妆品中的应用，所述化妆品制成化妆水，面膜，啫喱，乳液和膏霜。7.根据权利要求6所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，所述组合物按质量比0.1%-10%添加至化妆品中。8.根据权利要求1所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，所述蛋白酶为皮肤中各类蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶。9.根据权利要求8所述的一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，其特征在于，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。

技术总结
一种抑制蛋白酶的天然活性组合物，包含金缕梅提取物、无患子提取物、海茴香提取物、燕麦提取物、高山火绒草提取物，该组合物可以添加到不同类型的化妆品中，特别是添加有小分子蛋白的化妆品，不仅可以发挥组合物自身的作用，同时还可以安全有效的抑制皮肤中水解蛋白酶类特别是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，避免小分子蛋白的水解，让小分子蛋白尽可能保持添加时的结构与分子量，实现化妆品功效最大化。实现化妆品功效最大化。


技术研发人员：李磊 王培培 孙亚萍 郑春阳
受保护的技术使用者：天津强微特生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/9