一种基于叶片诱导的紫花苜蓿再生的方法及其培养基

1.本发明属于植物组织培养领域，涉及一种基于叶片诱导的紫花苜蓿再生的方法及其培养基。


背景技术：

2.苜蓿(medicago)是一种十分最重要、种植面积广泛的豆科牧草，其适应性广，且富含蛋白质、矿物质和维生素等营养物质，产草量高，誉为“牧草之王”。
3.我国苜蓿产业的发展受到种质资源的制约，为了满足化畜牧业快速发展的需要，扩大种植面积，培育、繁殖不同苜蓿品种变得十分重要。
4.苜蓿的组织培养能够快速扩繁苜蓿种质，对苜蓿育种至关重要，有必要探索效率高的苜蓿组织培养方法。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种用于苜蓿再生的培养基组合，所述培养基组合包括苜蓿愈伤诱导培养基和苜蓿生根生芽培养基；
6.所述苜蓿愈伤诱导培养基以wpm培养基为基础培养基，所述苜蓿愈伤诱导培养基包括0.8-1.2mg/l iaa；
7.所述苜蓿生根生芽培养基以wpm培养基为基础培养基，所述苜蓿生根生芽培养基包括0.08-0.15mg/l zt和0.03-0.10mg/l iba。
8.在一些实施方式中，所述苜蓿愈伤诱导培养基包括0.8-1.2mg/l iaa、5-9g/l琼脂、25-35g/l蔗糖和0.12-0.16g/l卡松，ph为5.8
±
0.5。
9.在一些实施方式中，所述苜蓿生根生芽培养基包括0.08-0.15mg/l zt、0.03-0.10mg/l iba、5-9g/l琼脂、25-35g/l蔗糖和0.12-0.16g/l卡松，ph为5.8
±
0.5。
10.在一些实施方式中，所述苜蓿愈伤诱导培养基包括1.0mg/l iaa。
11.在一些实施方式中，所述苜蓿生根生芽培养基包括0.1mg/l zt和0.08mg/l iba。
12.在一些实施方式中，所述wpm培养基包括：400mg/l nh4no3、386mg/l ca(no3)2、990mg/l k2so4、72.5mg/l cacl2、170mg/l kh2po4、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、180.7mg/l mgso4、22.3mg/l mnso4、8.6mg/l znso4·
7h2o、27.85mg/l fe2(so4)3·
7h2o、0.25mg/l cuso4·
5h2o、37.3mg/l na
2-edta、100mg/l肌醇、0.1mg/l维生素b1、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l维生素b6和2.0mg/l甘氨酸。
13.本发明第二方面提供了一种苜蓿再生的方法，所述方法包括如下步骤：
14.s1：愈伤组织诱导
15.将苜蓿外植体接种到苜蓿愈伤诱导培养基中进行诱导培养，形成苜蓿愈伤组织；
16.所述苜蓿愈伤诱导培养基为本发明第一方面所述的培养基组合中的所述苜蓿愈伤诱导培养基；
17.s2：生根生芽诱导
18.将所述苜蓿愈伤组织切分成愈伤团，将所述愈伤团接种到苜蓿生根生芽培养基中进行生根生芽培养，形成长有芽和根的苜蓿植株；
19.所述苜蓿生根生芽培养基为本发明第一方面所述的培养基组合中的所述苜蓿生根生芽培养基。
20.在一些实施方式中，在步骤s1中，所述诱导培养为暗培养，培养温度18-25℃，培养时间2-3周。
21.在一些实施方式中，在步骤s2中，所述生根生芽培养的培养温度为20-25℃，光暗周期为(14-18)/(6-10)h/d，光照强度为1500-3500lx，培养时间为35-50天。
22.在一些实施方式中，所述苜蓿外植体为苜蓿叶片。
23.在一些实施方式中，所述苜蓿叶片是苜蓿嫩枝经水培得到的苜蓿叶片。
24.在一些实施方式中，所述苜蓿叶片经灭菌处理后进行所述愈伤组织诱导。
25.在一些实施方式中，所述灭菌处理依次包括3-5次无菌水冲洗、酒精溶液浸泡、3-5次无菌水冲洗、次氯酸钠溶液浸泡、3-5次无菌水冲洗。
26.在一些实施方式中，所述酒精溶液的体积浓度为70-80％，酒精溶液浸泡的时间为25-35s。
27.在一些实施方式中，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.8-1.5％，次氯酸钠溶液浸泡的时间为4-6min。
28.在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：
29.s3：炼苗
30.将所述长有芽和根的苜蓿植株进行炼苗培养。
31.在一些实施方式中，所述炼苗培养的条件为：1500-3500lx的光照下炼苗5-12天，光暗周期(14-18)/(6-10)h/d，培养温度25
±
3℃。
32.在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：
33.s4：移栽
34.将经炼苗后的苜蓿苗从瓶中取出，移栽至土壤中。
35.在一些实施方式中，移栽后10-20d内苜蓿苗的生长环境为：温度在20-25℃、湿度80
±
5％。
附图说明
36.图1为本发明紫花苜蓿愈伤培养情况的照片之一。
37.图2为本发明紫花苜蓿生根生芽培养情况的照片之一。
具体实施方式
38.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
39.本发明没有详细描述的步骤均为本领域常规操作，没有详细记录的材料均为本领域常规材料。
40.本发明所用苜蓿为紫花苜蓿，具体品种为：sy4d。
41.实施例1：培养基的配制
42.一组苜蓿组织培养体系的配方，包括以下配方的培养基。
43.(1)基础培养基
44.wpm培养基，具体包括无机盐：nh4no
3 400mg/l、ca(no3)2386mg/l、k2so
4 990mg/l、cacl272.5 mg/l、kh2po
4 170mg/l、na2moo4·
2h2o 0.25mg/l、mgso4180.7 mg/l、mnso
4 22.3mg/l、znso4·
7h2o 8.6mg/l、fe2(so4)3·
7h2o 27.85mg/l、cuso4·
5h2o 0.25mg/l、na
2-edta 37.3mg/l，有机物：肌醇100mg/l、维生素b1 0.1mg/l、烟酸0.5mg/l、维生素b6 0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l。
45.(2)苜蓿叶片诱导愈伤培养基
46.基础培养基为wpm培养基，配方中还包括7g/l琼脂、30g/l蔗糖、0.14g/l卡松，ph 5.8
±
0.1。培养基中的激素为iaa，激素的含量分别参见表1。
47.(3)苜蓿生根生芽培养基
48.基础培养基为wpm培养基，配方中还包括7g/l琼脂、30g/l蔗糖、0.14g/l卡松，ph 5.8
±
0.1。培养基中的激素为zt和iba，激素的含量分别参见表2。
49.实施例2：苜蓿组织培养条件的优化
50.(一)愈伤组织诱导培养
51.取5月份采集的紫花苜蓿嫩枝，去除老叶后，自来水冲洗24h。
52.将冲洗后的紫花苜蓿嫩枝在室温下用自来水浸泡2d，浸泡温度为20-25℃，然后进行水培，每天换水，待长出新生嫩枝。
53.在超净工作台中消毒。在超净台中将初步清洗后的新生幼嫩小枝置于烧杯中，用无菌水进行冲洗5次，然后用体积分数75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗5次，用质量分数1.0％的次氯酸钠水溶液浸泡5min，期间不断搅拌，再用无菌水冲洗5次后，将小枝上的叶片(含叶柄)分切成约(0.4
×
0.4)cm的小块，分别接种于表1所示6种愈伤诱导培养基中，每种培养基的瓶数为10个。在培养温度22
±
2℃、暗室中培养2-3周，叶片边缘分化出愈伤组织，其中一瓶的照片参见图1，愈伤诱导率参见表1。
54.由此可见，本发明的方法能够有效地诱导紫花苜蓿外植体生成愈伤组织。
55.表1.苜蓿叶片诱导愈伤培养基及培养结果统计
56.编号iaa(mg/l)愈伤诱导率(％)愈伤生长状态10.221.6++20.522.3++30.852.6++41.078.3++++51.232.6++61.518.8+
57.注：“+”表示愈伤组织生长状态。
[0058]“++++”为生长状态最好，出愈时间短，生长快，愈伤团大，呈颗粒状，结构松散，微淡黄色；
[0059]“+++”表示愈伤生长状态较好，出愈时间短，愈伤生长较快，颗粒状，淡黄色；
[0060]“++”表示愈伤生长状态一般，生长较慢，呈块状，黄绿色；
[0061]“+”表示愈伤生长状态差，出愈时间长，生长慢，呈块状，结构致密，质地较硬，黄绿
色。
[0062]
(二)生根生芽诱导
[0063]
将步骤(二)中长势良好的愈伤组织于无菌超净工作台中，用无菌手术刀适当分切成长宽为(0.5
×
0.5)cm大小的愈伤团，分别转移至表2所示8种生根生芽诱导培养基中，每瓶5-15个愈伤团，在培养温度22
±
2℃、光暗周期为16/8h/d、光照强度1800-3000lx的条件下培养愈伤组织42天左右，分化出芽，同时生根，记录生芽率及生芽后幼苗长势，每种培养基的瓶数为10个，其中一瓶的照片参见图2，生芽率参见表2。
[0064]
由此可见，本发明的方法能够有效地诱导紫花苜蓿愈伤组织生根生芽。
[0065]
表2.苜蓿生根生芽培养基及培养结果
[0066][0067]
(三)炼苗
[0068]
将所述长有芽和根的紫花苜蓿植株进行炼苗培养，将培养瓶打开，装入0.5cm厚度的清水，每天更换，并逐步打开瓶盖，置于2000-3000lx的光照下炼苗7-10天，光暗周期为16/8h/d(即每天光照16h，暗培养8h)，培养温度25
±
1℃。
[0069]
(四)移栽
[0070]
将经7-10天炼苗后的紫花苜蓿苗从瓶中取出，用清水洗净培养基后移栽至草炭土和蛭石的混合土中，去除底端叶片，保留顶芽，覆盖透明塑料罩保湿。移栽后15d内保持罩内温度保持在21-23℃、湿度80
±
5％，移栽15d后去罩，即得紫花苜蓿种苗。
[0071]
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

技术特征：
1.一种用于苜蓿再生的培养基组合，所述培养基组合包括苜蓿愈伤诱导培养基和苜蓿生根生芽培养基；所述苜蓿愈伤诱导培养基以wpm培养基为基础培养基，所述苜蓿愈伤诱导培养基包括0.8-1.2mg/l iaa；所述苜蓿生根生芽培养基以wpm培养基为基础培养基，所述苜蓿生根生芽培养基包括0.08-0.15mg/l zt和0.03-0.10mg/l iba。2.如权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述苜蓿愈伤诱导培养基包括0.8-1.2mg/l iaa、5-9g/l琼脂、25-35g/l蔗糖和0.12-0.16g/l卡松，ph为5.8
±
0.5；和/或所述苜蓿生根生芽培养基包括0.08-0.15mg/l zt、0.03-0.10mg/l iba、5-9g/l琼脂、25-35g/l蔗糖和0.12-0.16g/l卡松，ph为5.8
±
0.5。3.如权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述苜蓿愈伤诱导培养基包括1.0mg/l iaa；和/或所述苜蓿生根生芽培养基包括0.1mg/l zt和0.08mg/l iba。4.如权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述wpm培养基包括：400mg/l nh4no3、386mg/l ca(no3)2、990mg/l k2so4、72.5mg/l cacl2、170mg/l kh2po4、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、180.7mg/l mgso4、22.3mg/l mnso4、8.6mg/l znso4·
7h2o、27.85mg/l fe2(so4)3·
7h2o、0.25mg/l cuso4·
5h2o、37.3mg/l na
2-edta、100mg/l肌醇、0.1mg/l维生素b1、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l维生素b6和2.0mg/l甘氨酸。5.一种苜蓿再生的方法，所述方法包括如下步骤：s1：愈伤组织诱导将苜蓿外植体接种到苜蓿愈伤诱导培养基中进行诱导培养，形成苜蓿愈伤组织；所述苜蓿愈伤诱导培养基为权利要求1-4中任一项所述的培养基组合中的所述苜蓿愈伤诱导培养基；s2：生根生芽诱导将所述苜蓿愈伤组织切分成愈伤团，将所述愈伤团接种到苜蓿生根生芽培养基中进行生根生芽培养，形成长有芽和根的苜蓿植株；所述苜蓿生根生芽培养基为权利要求1-4中任一项所述的培养基组合中的所述苜蓿生根生芽培养基。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤s1中，所述诱导培养为暗培养，培养温度18-25℃，培养时间2-3周；和/或在步骤s2中，所述生根生芽培养的培养温度为20-25℃，光暗周期为(14-18)/(6-10)h/d，光照强度为1500-3500lx，培养时间为35-50天。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述苜蓿外植体为苜蓿叶片。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述苜蓿叶片是苜蓿嫩枝经水培得到的苜蓿叶片；所述苜蓿叶片优选经灭菌处理后进行所述愈伤组织诱导；所述灭菌处理优选依次包括3-5次无菌水冲洗、酒精溶液浸泡、3-5次无菌水冲洗、次氯酸钠溶液浸泡、3-5次无菌水冲洗；所述酒精溶液的体积浓度优选为70-80％，酒精溶液浸泡的时间为25-35s；和/或
所述次氯酸钠溶液的质量浓度优选为0.8-1.5％，次氯酸钠溶液浸泡的时间为4-6min。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：s3：炼苗将所述长有芽和根的苜蓿植株进行炼苗培养；所述炼苗培养的条件优选为：1500-3500lx的光照下炼苗5-12天，光暗周期(14-18)/(6-10)h/d，培养温度25
±
3℃。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：s4：移栽将经炼苗后的苜蓿苗从瓶中取出，移栽至土壤中；移栽后10-20d内苜蓿苗的生长环境优选为：温度在20-25℃、湿度80
±
5％。

技术总结
本发明公开了一种用于苜蓿再生的培养基组合，包括苜蓿愈伤诱导培养基和苜蓿生根生芽培养基，苜蓿愈伤诱导培养基包括0.8-1.2mg/L IAA、5-9g/L琼脂、25-35g/L蔗糖和0.12-0.16g/L卡松，PH为5.8


技术研发人员：张月 孙娟 王增裕 赵怡然
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/9