一株拮抗水稻稻曲病的暹罗芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物学和植物病害生防技术领域，具体涉及一株拮抗稻曲病菌的暹罗芽孢杆菌bacillus siamensis n288及其应用。


背景技术：

2.水稻是我国乃至世界上最为重要的一种粮食作物，它提供了全球近半数人口的食物来源。然而每年各种病害的发生导致水稻大量减产，稻曲病(ustilaginoidea virens)就是影响水稻产量的主要病害之一。我国各个稻作区均有稻曲病发生。该病害主要发生在水稻穗部，病原菌侵染稻穗形成稻曲球。稻曲病病原菌不仅会造成水稻减产、稻米品质下降，还会产生毒素，危害人体健康。
3.目前针对稻曲病的防控策略主要包括选育优良抗病品种、化学防治和生物防治等，其中化学防治为主要措施。但是长期使用化学农药容易使病原菌产生耐药性，导致药剂防效降低。同时，长期施用化学农药也会对生态环境造成污染，引发食品安全等一系列问题。鉴于以上问题，利用有益微生物来防治水稻稻曲病逐步受到农业工作者的重视。
4.生物防治与其他方法相比，具有安全、有效、环保的特点，生防制剂对病害防治效果好，无残留不污染环境且对人畜无害。生防菌可以分泌抗菌物质来抑制病原菌的生长，也可以产生某些物质来促进植物生长，从而提高植物的免疫力，减轻病害的发生。
5.因此，为了降低农田稻曲病的发生，有必要针对该病害进行生防微生物的筛选，充分挖掘和利用根际有益微生物，将有助于减少化肥和农药的投入，减轻环境污染，实现可持续发展。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一株拮抗水稻稻曲病的暹罗芽孢杆菌。本发明从江苏省南京市六合区的水稻试验田采集根际土壤，分离得到1883株细菌菌株。经筛选得到一株对稻曲病菌具有极强拮抗作用的菌株n288。根据其菌落和菌体形态特征16s rdna基因序列分析，鉴定为暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)。并将其于2023年保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.26570。本发明研究了该拮抗菌对稻曲病的防治效果，为稻曲病的生物防治及生防菌剂的进一步开发利用提供科学依据。
7.本发明提供一株拮抗水稻稻曲病的暹罗芽孢杆菌bacillus siamensisn288，其保藏编号为：cgmcc no.26570。
8.本发明还提供含有上述的暹罗芽孢杆菌bacillus siamensis n288的微生物菌剂。
9.本发明还提供暹罗芽孢杆菌bacillus siamensis n288的微生物菌剂的制备方法，将暹罗芽孢杆菌菌株n288接种于液体lb培养基中，置于恒温摇床30℃，180～200r/min振荡培养24h。
10.本发明还提供上述的暹罗芽孢杆菌bacillus siamensis n288菌株或菌剂在制备防治作物土传病害的药物中的作用。
11.作为优选，所述土传病害的病原菌包括水稻稻曲病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、油菜菌核病菌、香蕉枯萎病菌。
12.作为优选，所述作物为水稻、小麦、油菜、香蕉。
13.本发明从水稻稻曲病发生地块的健康植株根际分离筛选出对稻曲病有极强抗性的细菌菌株暹罗芽孢杆菌n288，暹罗芽孢杆菌n288菌株还对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、油菜菌核病菌、香蕉枯萎病菌有很强的拮抗作用。盆栽试验表明，暹罗芽孢杆菌n288菌株对稻曲病具有显著的防治作用。本发明的暹罗芽孢杆菌n288对连作土壤的修复及土传病害的防治具有重要意义。
附图说明
14.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
15.图1为本发明菌株n288对稻曲病菌的平板拮抗作用结果；图中a为稻曲病菌(ustilaginoidea virens)，b为菌株n288。
16.图2为本发明菌株n288的菌落形态。
17.图3为本发明构建的拮抗菌株n288的16s rdna基因序列系统发育树。
18.图4为本发明实施例3中盆栽实验中水稻的株高、根长情况。
19.图5为本发明实施例3中盆栽实验中水稻根际稻曲病原菌含量。
20.图6为本发明实施例4中采用对峙培养法测定暹罗芽孢杆菌n288菌株对不同病原菌的拮抗效果。
21.生物样品保藏信息
22.n288，分类命名为芽孢杆菌bacillus sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年2月20日，保藏编号为cgmccno.26570，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
23.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。
24.实施例1水稻稻曲病拮抗菌n288的分离和纯化
25.本技术发明人从江苏省南京市六合区的水稻稻曲病发病田块中采集健康植株的根际土壤，采集的深度范围为10-20cm，用无菌自封袋封好后带回实验室，暂保存于4℃，用于分离拮抗菌。
26.供试靶标病原菌为水稻稻曲病菌(ustilaginoidea virens)，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。细菌培养基为lb，真菌培养基为pda。
27.采用土壤稀释法分离细菌，连续划线培养至纯，以体积比1:1混合于40％甘油中，-80℃冰箱保存备用。采用平板对峙法测定细菌对稻曲病菌的拮抗作用。初筛将稻曲病菌接
种于pda平板上活化，待长出足够菌丝后，用直径5mm打孔器制取菌饼于新的pda平板中央，距菌饼边缘3cm处点接已纯化过的细菌，每个平板接4个点，置于28℃生化培养箱中黑暗培养。同时设置对照组，只接种稻曲病菌，待病原菌菌落长至一定大小时，将有拮抗效果的菌株保存，用来复筛。采用抑菌圈法进行复筛实验。
28.从水稻根际土壤中分离纯化到细菌1883株，通过平板对峙法初筛获得抑菌带直径大于3mm的拮抗菌株249种，占所有菌株的13.2％。利用抑菌圈法继续对拮抗菌进行复筛，获得抑菌圈直径大于16mm的菌株7种(表1)。本发明菌株n288对稻曲病菌的平板拮抗作用结果见图1。
29.表1细菌对稻曲病菌的抑制作用
[0030][0031]
实施例2稻曲病拮抗菌n288的鉴定
[0032]
采用菌落形态与分子生物学相结合的方法，对筛选到的拮抗菌株n288进行鉴定。pcr反应体系(50μl体系)：引物各2μl，2x mix 25μl，加ddh2o补充到50μl。引物为27f一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27f/1492r。(27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和(1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)。反应程序：94℃预变性3min，94℃变性55s，50℃退火50s，72℃延伸1min，72℃延伸10min，35个循环后16℃保存。pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳上检测后，送至北京擎科生物科技有限公司进行16s rdna测序，测序结果如seq id no.1所示。将所测序列通过eziocloud数据库进行blast比对，利用mega软件对分离的细菌进行系统发育分析。
[0033]
在lb培养基平板上，菌株n288菌落呈乳白色，菌落边缘不整齐、表面有褶皱，具有一定的粘附性。菌株n288的菌落形态见图2。
[0034]
菌株n288测序结果在ezbiocloud网站比对，与模式菌株bacillussiamensis kctc 13613
t
相似性最高，达99.23％，鉴定为bacillus siamensis暹罗芽孢杆菌(系统发育树见图3)。将该菌株于2023年保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.26570。
[0035]
实施例3水稻稻曲病拮抗菌暹罗芽孢杆菌n288防治稻曲病的盆栽实验
[0036]
供试水稻品种为两优培九，供试菌株为实施例2的稻曲病拮抗菌暹罗芽孢杆菌n288，保藏编号：cgmcc no.26570。
[0037]
暹罗芽孢杆菌菌剂制备：将暹罗芽孢杆菌菌株n288接种于液体lb培养基中，置于
恒温摇床30℃，200r/min振荡培养24h。用无菌水将培养好的发酵液调节浓度至活菌数为1
×
108cfu/ml。
[0038]
稻曲病病原菌菌悬液制备：将保存好的稻曲病病原菌用接种针接种到液体pda培养基中，置于恒温摇床28℃，140r/min振荡培养5-7d。用无菌水稀释为浓度1
×
106个/ml的孢子悬浮液。
[0039]
选取大小一致的健康水稻苗进行种植，用清水洗去浮土，用75％的酒精清洗一遍。在体积为10l的塑料桶中装入5kg的灭菌土，均匀栽种6株水稻苗，定期浇水。
[0040]
在水稻抽穗前，将暹罗芽孢杆菌菌剂浇灌到水稻根际，两天后，将稻曲病病原菌菌悬液浇灌到水稻根际，设置对照组。
[0041]
水稻成熟后，采集水稻根际土，提取dna，对水稻根际的病原菌含量进行qpcr定量。并测量水稻株高和根长。
[0042]
暹罗芽孢杆菌菌剂在一定程度上可以促进水稻生长(图4)，并且能够抑制水稻根际的稻曲病原菌(图5)。
[0043]
实施例4稻曲病拮抗菌暹罗芽孢杆菌n288菌株的抑菌谱测定
[0044]
选择发病率较普遍的植物真菌病害的病原微生物为实验材料，采用平板对峙法对芽孢杆菌n288拮抗菌谱进行测定。其中，病原真菌为：水稻稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)、小麦赤霉病菌(fusariumgraminearum)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、油菜菌核病菌(sclerotinia sclerotiorum)、香蕉枯萎病菌(fusarium oxysporumf.sp.cubense)。如图6所示，芽孢杆菌除了对稻绿核菌引起的稻曲病具有很强的抑制作用，对水稻稻瘟病病原菌、香蕉枯萎病病原菌也具有较强的作用，此外对水稻纹枯病病原菌、小麦赤霉病病原菌、灰霉病菌和油菜菌核病病原菌也有一定的抑制作用，由此说明芽孢杆菌n288具有潜在的对多种病害的预防效果。

技术特征：
1.一株暹罗芽孢杆菌bacillussiamensisn288，其保藏编号为cgmccno.26570。2.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌bacillussiamensisn288的微生物菌剂。3.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，是将所述暹罗芽孢杆菌bacillussiamensisn288菌株接种于lb液体培养基中，置于恒温摇床30℃，180～200r/min振荡培养24h制得。4.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌bacillussiamensisn288菌株在制备防治植物真菌性病害中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物病害的病原菌选自水稻稻曲病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、油菜菌核病菌或香蕉枯萎病菌。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、小麦、油菜、香蕉。7.权利要求2所述的菌剂在制备防治植物真菌性病害中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物病害的病原菌选自水稻稻曲病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌、油菜菌核病菌或香蕉枯萎病菌。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、小麦、油菜、香蕉。

技术总结
本发明提供一株拮抗水稻稻曲病的暹罗芽孢杆菌及其应用。一株拮抗水稻稻曲病的暹罗芽孢杆菌BacillussiamensisN288，其保藏编号为CGMCCNO.26570。本发明通过生防菌可制成微生物菌剂，对水稻稻曲病具有较好的防治效果，从而可减少农药的投入，减轻环境污染，对保护农田生态可持续发展具有重要意义。田生态可持续发展具有重要意义。田生态可持续发展具有重要意义。


技术研发人员：熊武 许波婷 岳杨 沈其荣
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/9