针对葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）兔单克隆抗体及其应用的制作方法

针对葡萄糖-6-磷酸酶（g6pc）兔单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)兔单克隆抗体及其在免疫检测方面应用。


背景技术：

2.g6pc基因位于17号染色体上，编码肝脏催化亚基葡萄糖-6-磷酸酶。它有五个外显子，长度为12.5kb，编码一个35.5kda的蛋白质，由357个氨基酸组成。g6pc基因是一种在肝脏、肾脏和小肠中表达的多次跨膜蛋白，参与糖原分解和糖异生的最后一步，它在内质网(er)中发挥作用，分解葡萄糖-6-磷酸。
3.糖原贮积病ia型(gsd1a)是一种遗传性代谢紊乱，由葡萄糖-6-磷酸酶 (g6pase或g6pc)缺乏引起，葡萄糖-6-磷酸酶是葡萄糖稳态的关键酶，g6pase 催化肝肾糖原分解和糖异生的终末反应，以及葡萄糖-6-磷酸(g6p)水解为葡萄糖和无机磷酸盐。
4.葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)能够催化葡萄糖-6-磷酸分解为葡萄糖和磷酸,该基因表达水平及活性的变化直接影响生物体内葡萄糖的动态平衡,其过表达与糖尿病的发生发展有着密切的联系,该基因发生突变会导致1a型糖原贮积疾病。目前临床上常用免疫组织化学(ihc)病理实验检测疾病相关细胞中蛋白的表达状况，然而ihc实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，寻找高特异性和高敏感性的抗g6pc的抗体是建立检测细胞中g6pc方法的关键。检索中国、美国、 epo、wipo等专利网站，利用g6pc或g6pc+monoclonal antibody或antibody 作为关键词，有关与g6pc具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体的专利没有查到，有关检测利用抗g6pc兔单克隆抗体otir5g10制备免疫检测试剂盒也未查到；利用g6pc或g6pc+monoclonal antibody或antibody作为关键词，在pubmed未查到与本发明申报内容相关的类似文献。查询国家药品监督管理网站，还没有与g6pc相关的检测试剂注册。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供特异性好、亲和力高的抗g6pc兔单克隆抗体 otir5g10及其在制备用于检测g6pc蛋白的免疫检测工具中的应用，为糖原贮积病ia型(gsd1a)提供辅助诊断和监测，也为下一步工程抗体的制备提供基础。
6.所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体otir5g10。
7.所述兔单克隆抗体otir5g10以合成的g6pc多肽为免疫原，通过免疫注射新西兰大白兔，取免疫兔子外周血单核细胞(pmbcs)，分选特异性b细胞培养、筛选并利用分子克隆重组技术获得。
8.所述兔单克隆抗体otir5g10，其轻链可变区(vl)含110aa，其氨基酸序列如seq id no.1所示；所述抗体的重链(vh)含109aa，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
9.所述兔单克隆抗体otir5g10，其中vl区域包括3个抗原决定簇：cdr1、 cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和 91aa-100aa。其氨基酸序
列分别如seq id no.3-5所示。
10.所述兔单克隆抗体otir5g10，其中vh区域包括3个抗原决定簇：cdr1、 cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa-32aa，50aa-56aa和 94aa-98aa。其氨基酸残基序列分别如seq id no.6-8所示。
11.所述的兔单克隆抗体otir5g10可以与g6pc高特异性结合，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成检测g6pc的各种免疫检测试剂盒。尤其是，应用于免疫组化试剂盒以及标记肿瘤的试剂盒中。
附图说明
12.图1为兔单克隆抗体otir5g10重链和轻链全长扩增产物的电泳图，m为 dna分子量marker；
13.图2为兔单克隆抗体otir5g10特异识别完整的g6pc(full length g6pc, g6pc-fl)蛋白的westernblot检测结果图；
14.图3为福尔马林固定、石蜡包埋的人肝脏免疫组化结果图(一抗为g6pc单克隆抗体otir5g10)；
15.图4为福尔马林固定、石蜡包埋的人肾脏免疫组化结果图(一抗为g6pc 单克隆抗体otir5g10)；
16.图5为福尔马林固定、石蜡包埋的人十二指肠免疫组化结果图(一抗为g6pc 单克隆抗体otir5g10)。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
18.实施例1:g6pc兔单克隆抗体的制备
19.一、g6pc免疫原的制备
20.根据g6pc 1-357aa序列设计1个免疫原多肽，序列范围是80-120aa，多肽纯度在90％以上，达到了制备单抗的纯度要求。多肽由第三方中肽生化有限公司合成。
21.二、动物免疫
22.上述合成的g6pc多肽以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫2kg 左右的新西兰大白兔，免疫剂量为500μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为250μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；依据elisa效价128000时的od450大于1.0为标准，根据结果判定是否收集pbmcs或是继续免疫，选取抗体效价最高的兔子进行 pbmcs收集。
23.三、pbmcs分离、特异性b细胞分选、克隆重组将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛减掉，用酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处用50ml注射器穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器，取得所需血量后迅速将针头拔出，将注射器中的全血转入无菌50ml管中，与等量的pbs混匀后逐滴缓慢的加入到淋巴细胞分离液上方，室温400
×
g离心30分钟，离心后，液面由上至下分为四层：黄色血浆层、白色薄膜层即单个核细胞层、分离液层及红细胞
层，小心吸取单个核细胞层并用pbs洗涤去除血小板和淋巴细胞分离液后即可获得兔 pbmcs。从兔pbmcs中继续分选抗原特异性的b细胞进行培养，培养后的b 细胞上清用抗原包被的elisa板筛选阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取rna并反转录成cdna,天然配对的兔单克隆抗体轻重链全长序列从对应阳性克隆的cdna中被扩增出来，通过克隆重组方法构建兔单克隆抗体表达载体，并经测序确定序列。扩增的全长pcr产物结果如图1。
24.四、单克隆抗体的制备和纯化为了获得识别人g6pc蛋白的兔单克隆抗体，本发明将兔单克隆抗体重链、轻链基因装载在表达载体上，将质粒转染 hek293细胞；转染120-144小时获得培养上清中含有重组的识别人g6pc蛋白的兔单克隆抗体。收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化。以 bca法测定纯化后的单抗浓度，再分装、冻干。
25.实施例2:抗g6pc兔单克隆抗体otir5g10的鉴定
26.一、兔单克隆抗体otir5g10westernblot鉴定
27.采用westernblot(wb)检测。1泳道为转染pcmv6-entry对照质粒的细胞裂解液；2泳道为转染pcmv6-g6pc全长表达质粒的细胞裂解液，3泳道为转染 pcmv6-g6pc2全长表达质粒的细胞裂解液，4泳道为转染pcmv6-g6pc3全长表达质粒的细胞裂解液，每个裂解液上样5ug进行sds-page，转膜后进行wb 检测。
28.结果显示，兔单克隆抗体otir5g10仅特异识别完整的g6pc蛋白，而不识别家族蛋白g6pc2及g6pc3，抗体稀释比：1:5000-8000,1mg/ml，结果见图 2。
29.二、兔单克隆抗体的效价
30.采用倍比稀释法稀释兔单克隆抗体otir5g10，用间接elisa测抗体效价，结果显示本发明涉及的兔单克隆抗体otir5g10为1.2
×
107。
31.实施例3:兔单克隆抗体otir5g10可变区基因与氨基酸序列分析
32.以otir5g10抗体的重组质粒为dna模板，根据模板上轻链及重链5'端载体序列设计轻链可变区及重链可变区测序引物，采用测序仪abi 3730进行测序。经测序获得兔单克隆抗体otir5g10轻链及重链可变区的核苷酸序列。
33.利用互联网，在http://www.imgt.org上使用imgt/v-quest分析软件，分别将轻链与重链的核苷酸序列进行测序结果数据分析，得到兔单克隆抗体 otir5g10的轻链氨基酸序列如seq id no.1所示，重链氨基酸序列如 seq id no.2所示。vl全长为110个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，cdr的3个结构域氨基酸数分别为8、3和10，cdr1、 cdr2和cdr3的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-100aa，其氨基酸序列分别为qsvysnny、ras、lggydcssad。
34.通过分析，所述兔单克隆抗体otir5g10vh全长为109个氨基酸，其fr 的4个结构域氨基酸数分别为24、17、37和11，cdr的3个结构域氨基酸数分别为8、7和5，cdr1、cdr2和cdr3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和94aa-98aa，其氨基酸序列分别为gadlstyg、ivsggrp、vlgnl。
35.实施例4:单克隆抗体otir5g10为一抗的免疫组化检测
36.一、实验方法：
37.1、取福尔马林固定的人肝脏，肾脏，十二指肠组织进行石蜡包埋，使用 finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。
38.2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3
×
10min，无水乙醇3
×
10min，95％乙醇5min， 85％
乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min
×
3次。
39.3、加入抗原修复液(0.01m，ph6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复 3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min
×
3次。
40.4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min
×
3次。
41.5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。
42.6、去除封闭液，勿冲洗，加入g6pc单抗(otir5g10)，稀释比：1:2000，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20) 洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。
43.7、滴加polink-试剂盒2(catlogno.d37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。滴加polink-2试剂盒(catlog no.d37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用pbs洗涤3次，每次5min。
44.8、应用dab溶液(中杉金桥zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。
45.9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。
46.10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx 3次，85％乙醇5min， 95％乙醇5min，100％乙醇3
×
5min；二甲苯3
×
5min，中性树胶封片。
47.11、镜检，见图3-5。
48.二、实验结果：
49.由图3-5结果可见，抗体在较低稀释浓度(较高稀释比例)下在人肝脏、肾脏及十二指肠组织可见到明显特异性细胞浆染色。结果与g6pc在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体otir5g10可用于免疫组织化学检测g6pc蛋白的水平。otir5g10免疫组织化学染色表明单克隆抗体otir5g10 具有高的敏感性，可用于免疫组织化学检测人正常组织及相关肿瘤疾病中g6pc 的表达。

技术特征：
1.抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)的兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体otir5g10。2.根据权利要求1所述的抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)兔单克隆抗体otir5g10，其特征在于：兔单克隆抗体otir5g10以合成的多肽为免疫原，通过免疫注射新西兰大白兔，取免疫兔子外周血单核细胞(pmbcs)，分选特异性b细胞培养、筛选并利用分子克隆重组技术获得。3.根据权利要求2所述的抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)兔单克隆抗体otir5g10，其特征在于:其轻链可变区(vl)含110aa，其氨基酸序列如seq id no.1所示；所述抗体的重链(vh)含109aa，其氨基酸序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求2所述的抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)兔单克隆抗体otir5g10，其中vl区域包括3个抗原决定簇：cdr1、cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-100aa。其氨基酸序列分别如seq id no.3-5所示。5.根据权利要求2所述的抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)兔单克隆抗体otir5g10，其中vh区域包括3个抗原决定簇：cdr1、cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa-32aa，50aa-56aa和94aa-98aa。其氨基酸残基序列分别如seq id no.6-8所示。6.权利要求2所述的抗人葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)兔单克隆抗体的应用，其特征在于:用于葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)免疫检测试剂盒的制备，包括但不限于免疫组化试剂盒以及制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了兔抗人葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的单克隆抗体OTIR5G10，所述的抗体是利用分选特异B细胞并培养筛选及分子克隆重组产生。所述兔单克隆抗体OTIR5G10的免疫原为合成的80-120aa范围多肽，其OTIR5G10抗体轻链(VL)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；OTIR5G10抗体的重链(VH)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述OTIR5G10抗体的VL包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.3-5所示，所述OTIR5G10抗体的VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.6-8所示。本发明还涉及抗人葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)兔单克隆抗体在制备用于检测G6PC蛋白的免疫检测工具中的应用，包含但不限于免疫组化试剂盒以及制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用，为与G6PC相关的疾病诊断提供辅助手段，也为下一步工程抗体的制备提供基础。也为下一步工程抗体的制备提供基础。


技术研发人员：扈晓敏 W
受保护的技术使用者：无锡傲锐东源生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.31
技术公布日：2023/8/9