CD45作为生物标志物在筛查CD26抗体或其衍生物治疗肿瘤有效性和精准性中的应用的制作方法

cd45作为生物标志物在筛查cd26抗体或其衍生物治疗肿瘤有效性和精准性中的应用
技术领域
1.本发明涉及临床疗效有关的生物标志物，具体涉及cd45作为临床疗效有关的生物标志物的应用，更具体地涉及cd45在筛查对cd26抗体或其衍生物治疗肿瘤有效性和精准性中的应用。


背景技术：

2.精准医学是基于临床病理特征和分子特征，定制可精确满足不同患者实际需求的诊断、治疗及预后判断策略。其范畴包括精准预防(患病风险的预测及预防性干预)、精准诊断(疾病早期发现与诊断，分子分型)、精准治疗(分子靶向疗法、疗效的预测与监控、精准外科技术等)。
3.生物标志物的发现和应用是精准医学的重点研究方向。如pd-1/pd-l1、 ctla-4等免疫检查点抑制剂在多种实体瘤中已有广泛研究，并已作为非小细胞肺癌的一线治疗方案，但其整体客观缓解率依然只有20％左右。pd-l1的表达可以作为抗pd-1/pd-l1治疗反应的预测标志物，肿瘤突变负荷(tmb)也已被证明与黑色素瘤、肺腺癌、膀胱癌的免疫检查点抑制剂的疗效有关。开发适合的生物标志物，可以提高抗体治疗的精准性，并检测其疗效和耐药发生，提高患者的临床获益。
4.cd26是一种多功能ⅱ型跨膜糖蛋白，也可以以溶解形式存在于血浆中。 cd26常以同源二聚体形式存在，其单体含766个氨基酸，相对分子质量约 110kda。cd26氨基酸残基从内向外分为5个部分：胞内区(1～6)、跨膜区(7～ 28)、高度糖基化区(29～323)、富含半胱氨酸区(324～551)和c端催化结构域 (552～766)，其分子三维结构与功能密切相关。cd26(dpp4)抑制剂在临床上用于ⅱ型糖尿病的治疗已有数十年的历史。此外，cd26在多种肿瘤细胞表面的表达量明显升高，例如，如恶性间皮瘤，肾癌，前列腺癌，肺癌等，对于这类型 cd26表达量较高的肿瘤，cd26是一种具有重要价值的作用靶点(cd26/dpp4
‑ꢀ
a potential biomarker and target for cancer therapy,pharmacology& therapeutics(2019),198:135-159)。
5.目前以人cd26为靶点的抗癌药物研究进展最快的是y’s therapeutics公司的单克隆抗体ys110，已完成了i/ii期临床实验。但根据已有文献资料分析可知， ys110的临床前研究已存在体内外活性均较低的问题，如在文献“a humanizedanti-cd26 monoclonal antibody inhibits cell growth of malignant mesothelioma viaretarded g2/m cell cycle transition,cancer cell int(2016)16:35”中，在ys110的浓度为250ug/ml，作用48h以后，对肿瘤细胞株生长的抑制率为18.3％，ic
50
值远远高于250ug/ml，足见其体外的活性较低；又如在专利“抗cd26抗体及其使用方法(申请号：cn200680034937.4)”中，展示了ys110对多种cd26高表达细胞株的小鼠肿瘤模型的治疗，ys110仅能一定程度缩小肿瘤体积，缓解肿瘤生长，并不能完全抑制肿瘤生长实现肿瘤的治愈，可见其在动物模型中的活性仍然不理想。ys110已经完成的临床二期研究结果显示，ys110具有较好的耐受性，但疾病控
制率未达到预期，这与ys110在临床前研究中所表现出来的低活性相对应。
6.针对cd26抗体的研究，发明人发现部分cd26+细胞对cd26抗体或其衍生物敏感，但也有较多cd26+细胞对cd26抗体并不敏感。结合ys110在临床前研究及临床研究中较低的体内外活性，发明人推测cd26抗体对cd26+细胞的作用具有选择性。筛选出能够有效预测对cd26抗体治疗有效性的生物标记物，是cd26抗体实现临床应用亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.本技术提供了用于筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的生物标志物cd45。
8.第一个方面，本技术提供了cd26抗体或其衍生物在制备治疗cd26表达且 cd45不表达的肿瘤的药物中的应用。所述cd26表达cd45不表达的肿瘤包括实体肿瘤和血液瘤。
9.本技术还提供了cd26抗体或其衍生物在制备治疗cd26表达且cd45低表达的肿瘤的药物中的应用。所述cd26表达cd45低表达的肿瘤包括实体肿瘤和血液瘤。
10.本技术的“抗体”既可以是含有两条重链和两条轻链的完整结构抗体；又可以是抗体的抗原结合片段，即保留与抗原特异性结合能力的抗体片段，例如保留一个或多个cdr区的片段，包括但不限于fab片段、fv片段、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等。
11.本技术的“衍生物”指直接给予受试者的活性药物分子不是传统抗体(上述完整结构抗体或者抗体的抗原结合片段)，而是含有抗体或抗体的抗原结合片段的其他形式，包括但不限于靶向cd26的cart等，或者是在体内生成抗体或抗原结合片段的其他形式，包括但不限于含有抗cd26抗体编码基因的raav载体等。
12.第二个方面，本技术提供了cd45抗原或抗体在制备用于筛查受试者接受 cd26抗体或其衍生物治疗有效性的试剂盒中应用。
13.上述试剂盒的使用方法如下：以所述试剂检测病灶cd45表达情况；cd45 低表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高， cd45高表达或较高表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。
14.或者，上述试剂盒的使用方法如下：以所述试剂检测病灶cd45表达情况； cd45不表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。
15.第三个方面，本技术提供了一种筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的方法，检测病灶cd45表达情况；cd45低表达时，判断该受试者接受 cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45高表达或较高表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。
16.优选地，本发明提供的筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的方法，检测病灶cd45表达情况；cd45不表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45表达时，判断该受试者接受cd26 抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。本技术提供了cd45筛查受试者接受 cd26抗体或其衍生物治疗有效性的应用。
17.cd45是一种跨膜蛋白酪氨酸磷酸酯酶(ptpase)，在血液细胞中广泛表达，由细胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域构成。cd45存在多种亚型，不同亚型胞外结构域不同、
胞外及跨膜结构域相同，各亚型在不同种类细胞亚群上有表达差异。cd45胞膜外区是约有391～552个氨基酸的片段，有11～15个n-糖基化位点及多个o-糖基化位点。cd45胞内区结构域高度保守，含有2个重复的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(ptpase)结构域，其中一个具有ptpase活性，而另一个因催化活性所必须的关键氨基酸的变化而无显著ptpase活性，但后者可能对前者的ptp ase酶活性起调节作用。cd45通过其胞质区ptpase活性，调节src家族蛋白激酶，在淋巴细胞发育和活化中发挥关键作用。cd45是否与cd26抗体发挥药效有关在本技术以前是未知的。
18.本技术提供了cd45筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的应用，能有效改善cd26抗体或其衍生物肿瘤免疫治疗的精准性和有效性，提高患者的临床获益；发现了cd26作为肿瘤免疫治疗新靶点的治疗有效性和精准性的新机制。
附图说明
19.图1：18g272、19g294在pc-3细胞nod-scid小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化。
20.图2：18g272、19g294在pc-3细胞nod-scid小鼠皮下移植模型中的动物体重变化。
21.图3：19g294在a498细胞nod-scid小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化。
22.图4：18g272在os-rc-2细胞nod-scid小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化。
23.图5：19g294在os-rc-2细胞nod-scid小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化。
24.图6：aav表达载体骨架示意图，包括质粒复制起点puc ori，amp抗性基因，腺相关病毒5’末端反向重复序列(itr)，cmv启动子，β内含子增强序列，多克隆位点，polya终止序列与3’末端反向重复序列(itr)。
25.图7：aav递送bite基因在荷有osrc-2(肾癌)异种移植瘤nod/scid小鼠中的肿瘤体积变化。
26.图8：aav递送bite基因在荷有osrc-2(肾癌)异种移植瘤nod/scid小鼠中的小鼠体重变化。
27.图9：aav递送bite基因在荷有osrc-2(肾癌)异种移植瘤nod/scid小鼠中的小鼠生存期变化。
28.图10：car-t细胞采用流式细胞仪检测car阳性率。
29.图11：cd26靶向的car-t细胞对细胞的杀伤。
具体实施方式
30.除非在本文中明确定义，否则本文使用的技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
31.单数形式词语如“一个(a、an)”“所述(the)”包括它们对应的复数指示物。
32.术语“或”意指“和/或”，并可与“和/或”互换使用。
33.术语“cd26”又称二肽基肽酶(dpp4，dipeptidyl peptidase 4)，人cd26氨基酸序列能以登录号np_001926.2在genbank中找到，其cdna序列能以登录号 nm_001935.3在genbank中找到。
34.术语“抗体”是指可以非共价地、可逆地且以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋
白家族。例如，天然存在的igg抗体是四聚体，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重链和两条轻链。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl可以进一步细分为具有高变性的互补决定区(cdr，又称高变区)，以及更保守的框架区(fr)。每个 vh和vl由三个cdr和四个fr组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列： fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。hcdr1、hcdr2、hcdr3为三个重链互补决定区，lcdr1、lcdr2、lcdr3为三个轻链链互补决定区。重链可变区(vh)及轻链可变区(vl)负责抗原识别，尤其是其中的互补决定区(cdr)，通常对抗原的不同表位具有特异性。恒定区主要负责效应子功能。
35.术语“bite”是一种双特异性抗体，全称“双特异性t细胞接合器”，由两个具有抗原特异性的单链可变片断(single chain variable fragment，scfv)通过接头连接而成，其中一个scfv靶向识别肿瘤相关表面抗原，另一个scfv靶向识别t细胞表面cd3。单链可变片断(scfv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头连接而成。
36.cd3是t细胞信号传导的组成部分。当bite分子同时与t细胞和肿瘤细胞结合时，t细胞被激活，促进cd8+t细胞直接分泌穿孔素和颗粒酶，cd4+t细胞分泌细胞因子进一步招募活化杀伤性t细胞，从而杀伤肿瘤细胞。
37.在本技术具体的实施例中“双特性抗体”如18g272，19g294均为靶向cd26 的双特异性t细胞接合器(zhbite)，序列分别如seq id no：1与seq id no： 2所示。
38.zb：zhbody，双特异性单链fc抗体，以氨基至羧基的顺序包含不含fc片段含有cdr区的抗体或抗原结合片段-连接肽-ch2-ch3-肽接头-铰链-ch2-ch3。 zb09氨基酸序列如seq id no：4所示。可以按照常规方法制备zb抗体，如抗体序列进行cho细胞密码子优化，在基因上游添加avrii酶切位点与kozak序列，下游添加终止密码子和bstz17i酶切位点，全基因合成后，pcr扩增得到目的基因，通过酶切酶连反应连入pcho1.0载体的avrii与bstz17i位点，形成表达载体。表达载体稳定转化cho-s细胞，mtx与嘌呤霉素筛选高表达稳定细胞株。将高表达稳定细胞株接种于dynamis培养基(a2617501,thermo fisher)， 37℃，8％co2，130rpm进行分批补料流加培养。取上清培养液，离心收集上清， 0.45μm收集滤膜过滤即得处理后培养液上清，进行层析纯化。得到目的抗体分子。
39.za：zhbsab，双特异性类igg全长抗体，与天然抗体结构基本相同，由两条重链和两条轻链组成，每条轻链通过二硫键连接至一条重链；两个轻链-重链二聚体经由重链之间的二硫键连接，从而形成y形分子。za16、za23其中一个 fab片段识别cd26。另一个fab片段识别cd3。za16重链a氨基酸序列如seq idno：5所示，轻链a氨基酸序列如seq id no：6所示，重链b氨基酸序列如seqid no：7所示，轻链b氨基酸序列如seq id no：8所示。za23重链a氨基酸序列如seq id no：9所示，轻链a氨基酸序列如seq id no：10所示，重链b氨基酸序列如seq id no：11所示，轻链b氨基酸序列如seq id no：12所示。
40.cd26靶向car-t细胞：表达靶向cd26 car分子的t细胞，本技术的cd26 car分子结构包含cd8α信号肽、以vl-linker-vh连接的抗cd26单链抗体、cd8α铰链、cd8α跨膜区、cd28共刺激域、cd3zeta胞内域。
41.含有抗cd26抗体编码基因的raav载体，是将抗cd26抗体编码基因导入到腺相关病毒(aav)中，通过重组腺相关病毒(raav)载体将抗cd26抗体基因递送至体内，利用raav感染
后的细胞持续合成抗cd26抗体。
42.实施例1 cd26抗体对pbmc细胞的作用
43.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)主要由t淋巴细胞、b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞组成，它们都表达cd26，为观察cd26抗体是否对正常pbmc细胞有杀伤作用及与cd45 表达的关联性，开展如下实验：
44.一、细胞株cd26、cd45阳性率的检测
45.贴壁细胞用t75细胞培养瓶培养靶细胞，待细胞融合到80％以上时，胰蛋白酶消化细胞并收集，用macs buffer清洗一次，血球计数板进行计数，分为 5
×
105个细胞每份；悬浮细胞收集，用macs buffer清洗一次，血球计数板进行计数，分为5
×
105个细胞每份；用抗cd26单克隆抗体作为一抗，与靶细胞于室温共孵育约40min，孵育结束后，离心弃上清，细胞沉淀用macs buffer重悬，再次离心弃上清，收集细胞沉淀；再用相应的抗体alexa fluor 488鼠抗人igg1 做为二抗，重悬细胞沉淀，于室温避光孵育约30min，孵育结束后，用pbs清洗两次，离心弃上清，收集细胞沉淀；用约200ul的macs buffer将细胞沉淀重悬，在1h内用流式细胞仪accuri c6进行检测并分析cd26阳性率，结果如表1所示。
46.用t75细胞培养瓶培养靶细胞，收集，用macs buffer清洗一次，血球计数板进行计数，分为5
×
105个细胞每份；用抗cd45-fitc单克隆抗体(货号130
‑ꢀ
113-679，厂家miltenyi，可识别所有cd45亚型)(1:1000)与靶细胞于2～8℃共孵育约10min，孵育结束后，用macs buffer清洗两次，离心弃上清，收集细胞沉淀；用约200ul的macs buffer将细胞沉淀重悬，在1h内用流式细胞仪 accuri c6进行检测并分析cd45阳性率，结果如表1所示。
47.表1
48.细胞株cd26cd45pbmc75％99.2％
49.二、cd26抗体介导pbmc对pbmc的毒性评价
50.1、实验方法
51.按下述方法分别制备人肾癌786-0细胞、os-rc-2细胞模型。
52.pbmc细胞采用荧光染料calcein-am标记上绿色荧光信号，肿瘤细胞以 6
×
105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到u-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01 ng/ml、0.001ng/ml的双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为 1％tritonx-100为阳性对照，再按e/t为15:1的比例加入50μl浓度为9
×
106cells/ml 的pbmc细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
53.细胞裂解率用公式为：(v
sample-v
vehicle control
)/(v
tritonx-100-v
vehicle control
)
×
100％。(其中v
sample
为药物处理组的荧光信号读数，v
vehicle control
为溶剂对照组荧光信号读数的平均值，v
triton-100
为阳性对照组荧光信号读数的平均值。)将细胞裂解率和样品浓度值用graphpad prism 7.00软件计算各样品所介导的pbmc细胞对pbmc细胞的ic
50
值。
54.2、结果分析
55.在抗体18g272介导的pbmc对靶细胞786-0进行杀伤的过程中，介导pbmc 对pbmc细胞发生杀伤的能力极低。抗体18g272介导的pbmc(4#)对pbmc (4#)细胞的细胞毒效应ic
50
值
约为99730000pg/ml；抗体18g272介导的pbmc (6#)对pbmc(6#)细胞无细胞毒效应。
56.在抗体18g272介导的pbmc对靶细胞os-rc-2进行杀伤的过程中，不会介导pbmc对pbmc细胞发生杀伤。抗体18g272介导的pbmc(1#)对pbmc (1#)细胞无细胞毒效应；抗体18g272介导的pbmc(3#)对pbmc(3#)细胞无细胞毒效应。
57.在抗体19g294介导的pbmc对靶细胞786-0进行杀伤的过程中，介导pbmc 对pbmc细胞发生杀伤的能力极低。抗体19g294介导的pbmc(2#)对pbmc (2#)细胞的细胞毒效应ic
50
值约为1915313pg/ml；抗体19g294介导的pbmc (3#)对pbmc(3#)细胞的细胞毒效应ic
50
值约为1947224pg/ml。
58.在抗体19g294介导的pbmc对靶细胞os-rc-2进行杀伤的过程中，介导 pbmc对pbmc细胞发生杀伤的能力极低。抗体19g294介导的pbmc(2#)对 pbmc(2#)细胞的细胞毒效应ic
50
值约为47920315pg/ml；抗体19g294介导的 pbmc(3#)对pbmc(3#)细胞的细胞毒效应ic
50
值约为1406115138pg/ml。
59.综上所述，pbmc表达cd26同时高表达cd45，靶向cd26的抗体不会介导pbmc细胞对pbmc细胞产生细胞毒效应。
60.实施例2 cd26抗体对血液瘤的作用
61.为观察cd26抗体是否对血液瘤细胞有杀伤作用及与cd45表达的关联性，开展如下实验：
62.一、淋巴瘤细胞株cd26、cd45阳性率的检测
63.检测方法同实施例1，不同淋巴瘤细胞的cd26、cd45表达情况如表2所示。
64.表2
65.细胞株cd26cd45u93797.9％98.2％jurkat94.8％99.9％hl-6098.2％97.6％snk-699.4％94.5％namalwa98.6％95.1％molt-472.1％91.3％z-13898.8％93.7％raji不表达-66.二、cd26抗体介导pbmc对淋巴瘤细胞的毒性评价
67.1、实验方法
68.按下述方法分别制备人淋巴瘤细胞jurkat细胞、u937细胞、z-138细胞、 namalwa细胞、hl-60细胞、snk-6细胞、molt-4细胞。
69.肿瘤细胞采用荧光染料calcein-am标记上绿色荧光信号，以6
×
105cells/ml 的细胞浓度，每孔50μl接种到u-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001 ng/ml的双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％tritonx-100为阳性对照，再按e/t为15:1的比例加入50μl浓度为9
×
106cells/ml的pbmc细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶
标仪在 470nm的激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
70.细胞裂解率用公式为：(v
sample-v
vehicle control
)/(v
triton-100-v
vehicle control
)
×
100％。其中v
sample
为药物处理组的荧光信号读数，v
vehicle control
为溶剂对照组荧光信号读数的平均值，v
triton-100
为阳性对照组荧光信号读数的平均值。
71.将细胞裂解率和样品浓度值用graphpad prism 7.00软件计算样品所介导的 pbmc对靶细胞的ic
50
值。
72.3、结果分析
73.不同结构类型的双特异性抗体za23、za16、zb09、19g294，等均无法介导pbmc细胞对cd45+cd26+的肿瘤细胞株jurkat、u937、z-138、namalwa、 hl-60、snk-6、molt-4等产生细胞毒效应。
74.综上所述，多数淋巴瘤细胞表达cd26同时高表达cd45，靶向cd26的抗体不会介导pbmc细胞对高表达cd45淋巴瘤细胞产生细胞毒效应。
75.实施例3 cd26抗体对实体瘤的作用
76.为观察cd26抗体是否对实体瘤细胞有杀伤作用及与cd45表达的关联性，开展如下实验：
77.一、实体瘤细胞株cd26、cd45阳性率的检测
78.检测方法同实施例1，不同实体瘤细胞的cd26、cd45表达情况表3所示。
79.表3
[0080][0081][0082]
注：
“‑”
表示未检测；“不表达”表示使用该方法未检测出有表达，可以认为是不表达或低表达，并非严格意义上的不表达，可能与方法检测限有关。
[0083]
二、cd26抗体介导pbmc对实体瘤细胞的毒性评价
[0084]
1、实验方法
[0085]
实验方法同实施例2，制备人肾癌细胞os-rc-2细胞、786-0细胞、人肺鳞癌nci-h226细胞、人前列腺癌pc-3细胞模型。
[0086]
2、结果分析
[0087]
在相同的实验条件下，双特异性抗体za23、za16、zb09、19g294等对介导pbmc细胞对cd26+cd45-肿瘤细胞os-rc-2产生杀伤活性，见表4。双特异性抗体19g294、18g272等均可介导pbmc细胞对多种cd26+cd45-的肿瘤细胞产生强烈的细胞毒效应，见表5。
[0088]
表4不同双特异性抗体介导的pbmc对os-rc-2的细胞毒效应的ic
50
值 (pm)
[0089]
细胞名称za23za16zb0919g294os-rc-287.55.810.19.9
[0090]
表5不同双特异性抗体介导的pbmc对不同靶细胞细胞毒效应的ic
50
值 (pm)
[0091]
细胞名称18g27219g294786-041.44.7os-rc-25.29.9nci-h2262.613.7pc-36.94.0
[0092]
综上所述，在体外实验中，不同类型的cd26抗体对多种cd45不表达或低表达的实体瘤细胞株均有杀伤作用。
[0093]
为进一步观察cd26抗体对实体瘤的体内药效，开展如下三～五项体内实验。
[0094]
三、双特异性抗体18g272、19g294在荷有pc-3种移植瘤nod/scid小鼠中的药效
[0095]
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的nod-scid小鼠，将5
×
106cells/0.1 ml pc-3细胞悬液与1
×
107cells/0.1ml pbmc细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于nod-scid小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是model组、19g294组、18g272组，每组6只动物。model组和各治疗组静脉注射给药，接种当天开始给药，连续给药五日。停药两天后，进行第二疗程的给药。首次给药时间为小鼠皮下接种细胞1h后，即第一疗程为d1、 d2、d3、d4、d5；第二疗程为d8、d9、d10、d11、d12。给药频率为1天/次。
[0096]
结论：本试验通过nod-scid小鼠皮下注射pc-3和pbmc细胞混合液，建立人前列腺癌小鼠异种移植模型。在该模型的基础上，在30μg/只的剂量下， 18g272可以抑制pc-3人前列腺癌模型小鼠的肿瘤增长，19g294可以完全抑制 pc-3人前列腺癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图1、表6所示。
[0097]
供试品19g294、18g272在30μg/只的剂量下，动物没有出现体重下降，与模型组动物体重相当，治疗期间耐受良好，结果如图2、表6所示。
[0098]
表6
[0099][0100]
注：*：p＜0.05，vs model组；**：p＜0.01，vs model组
[0101]
四、双特异性抗体19g294在荷有a498异种移植瘤nod/scid小鼠中药效
[0102]
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的nod-scid小鼠，将1
×
107cells/0.1 ml a498细胞悬液与1
×
107cells/0.1ml pbmc细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于nod-scid小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是model组、19g294组，每组6只动物。model组和各治疗组静脉注射给药，接种当天开始给药，连续给药五日。停药两天后，进行第二疗程的给药。首次给药时间为小鼠皮下接种细胞1h后，即第一疗程为d1、d2、d3、d4、d5；第二疗程为d8、d9、d10、d11、d12。给药频率为1天/次。
[0103]
结论：本试验通过nod-scid小鼠皮下注射a498和pbmc细胞混合液，建立人肾癌小
鼠异种移植模型。在该模型的基础上，供试品19g294在30μg/只的剂量下，可完全抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图3、表7所示；供试品19g294在30μg/只的剂量下，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好。
[0104]
表7
[0105][0106]
注：*：p＜0.05，vs model组；**：p＜0.01，vs model组
[0107]
五、双特异性抗体18g272、19g294等在荷有os-rc-2异种移植瘤nod/scid 小鼠中药效
[0108]
实验一：
[0109]
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的nod-scid小鼠，3
×
106cells/0.1 ml os-rc-2细胞悬液与6
×
106cells/0.1ml pbmc细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于nod-scid小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是model组、18g272组；每组6只动物。model组于d1开始给于pbs，18g272组于d1开始给药，30μg/只，给药频率为1天/次，连续给药10天。
[0110]
结论：18g272在30μg/只的剂量下，d1开始给药可显著抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图4、表8所示。os-rc-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，在本试验条件下，18g272于d1天开始给药可降低动物死亡率，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好，结果如8所示。
[0111]
表8
[0112][0113]
实验二：
[0114]
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的nod-scid小鼠，3
×
106cells/0.1 ml os-rc-2细胞悬液与6
×
106cells/0.1ml pbmc细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于nod-scid小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是model组、19g294组；每组5只动物。model组于d1开始给于pbs，19g294组于d1开始给药，30μg/只，给药频率为1天/次，连续给药10天。
[0115]
结论：19g294在30μg/只的剂量下，d1开始给药能完全显著抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图5、表9所示。os-rc-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，在本试验条件下，19g294于d1天开始给药可降低动物死亡率，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好，结果如表9所示。
[0116]
表9
[0117][0118]
注：*：p＜0.05，vs model组；**：p＜0.01，vs model组
[0119]
从三～五的体内实验结果可知，多种cd26抗体在cd45不表达或低表达的多种不同实体瘤细胞的动物模型中都显示出较好的治疗效果。
[0120]
实施例4含有抗cd26抗体编码基因的raav载体在荷有肿瘤小鼠中的药效以上实施例观察了cd26抗体对不同种类细胞的体内外杀伤作用，为进一步观察靶向cd26的基因疗法对肿瘤细胞的作用，开展如下实验：一、aav表达载体的构建
[0121]
aav表达载体骨架示意图如图6所示。
[0122]
paav-gfp表达载体构建：
[0123]
gfp基因序列(seq id no：13)扩增后构建入paav-cmv载体的“β内含子增强序列”及“polya终止序列”之间的多克隆位点mcs(xbai与bamhi酶切位点之间)形成paav-gfp表达载体。
[0124]
paav-bite表达载体构建：
[0125]
将信号肽基因(seq id no：14)与bite基因序列(seq id no:15)融合并合成扩增后构建入paav-cmv载体的β内含子增强序列及polya终止序列之间的多克隆位点mcs(bamhi与ecori酶切位点之间)，形成aav表达载体： paav-21r23(含cd26-cd3 bite)。
[0126]
二、重组aav病毒的生产和纯化
[0127]
293t细胞培养：293t细胞复苏后在含10％fbs，1％glutamax的dmem培养基中贴壁培养，传代2-3次后细胞状态恢复可用于包装。150mm细胞培养皿使用15ml 0.1％明胶室温包被30min。293t细胞胰酶消化后重悬、计数，吸弃培养皿中包被液，每个150mm皿接种1.2-1.8
×
10e7个293t细胞，补293t培养基至 30ml，37℃，5％co2培养过夜。
[0128]
转染：第二天上午，293t细胞生长至70-80％汇合，更换新鲜293t培养基，每皿30ml，放回培养箱。准备转染混合物，将构建好的2种aav表达载体质粒分别与prc6、phelper质粒按质量比1：1：1加入无血清dmem培养基，每个 15cm皿总dna量30μg，再轻柔加入lipo8000脂质体(碧云天生物技术货号： c0533)，轻柔混匀，室温静置30min。每皿加入1.5ml转染混合物，轻柔混匀，放回培养箱。转染24h后，更换为30ml aav收获培养基(含2％fbs，1％ glutamax，1％1m hepes的dmem培养基)，放回培养箱。
[0129]
raav收集纯化：感染72h后，加入培养液体积的1/80的0.5m edta(ph8.0) 到含293t细胞的培养皿中,吹打使细胞悬浮，收集到50ml无菌离心管中。于4℃ 2000g离心10分钟，弃上清，完全去除上清液后收集细胞沉淀，即为含有aav 颗粒的宿主293t细胞。后续步骤按照purification kit maxi试剂盒 (takara货号：6666)说明书进行aav的纯化与浓缩，分装后-80℃保存。
[0130]
三、重组aav递送bite基因在荷有osrc-2(肾癌)异种移植瘤nod/scid 小鼠中的药效
[0131]
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的nod-scid小鼠，4
×
107cells/mlosrc-2
细胞悬液与6
×
107cells/ml pbmc细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合，gfp、21r23 aav纯化样品稀释至1
×
10
11
vg/ml。将osrc-2+pbmc细胞悬液0.1ml分别与溶媒pbs或给药组aav样品0.1ml混匀后接种于nod
‑ꢀ
scid小鼠皮下，每只接种0.2ml。分别是model组、a组(gfp组)、b组(21r23 组)、每组6只动物。建模第5天开始测量小鼠肿瘤体积、体重，观察小鼠生存状态。
[0132]
结论：本试验通过nod-scid小鼠皮下注射osrc-2和pbmc细胞混合液，建立人肾癌小鼠异种移植模型。在该模型的基础上，对每只小鼠给予1次10e10 vg表达bite双特异抗体的重组aav进行治疗。从建模第8天开始，模型组与 gfp-a组肿瘤开始明显增大，给予aav药物治疗b组肿瘤体积出现显著抑制，第12天b组肿瘤完全消退，结果如图7、表10所示。
[0133]
表10
[0134][0135]
此外，osrc-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，而给予aav治疗组的动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好，如图8、9所示。
[0136]
综上所述，重组aav递送的bite双特异性抗体仅通过1次给药，即完成对cd26表达同时cd45不表达或低表达的肾癌细胞的的完全抑制，具有显著的治疗效果。
[0137]
实施例5 cd26靶向car-t细胞对cd26-cd45-、cd26+cd45-、cd26+cd45+ 细胞的细胞毒性评价
[0138]
为进一步观察靶向cd26的car-t细胞免疫疗法对肿瘤细胞的作用及与 cd45表达的关联性，开展如下实验：
[0139]
一、car-t细胞构建
[0140]
重组car基因包含bamhi酶切位点、kozak序列、cd8α信号肽、以vl
‑ꢀ
linker-vh连接的抗cd26单链抗体、cd8α铰链、cd8α跨膜区、cd28共刺激域、cd3zeta胞内域、终止密码子、sali酶切位点，将重组car基因全序列合成 (seq id no：3)后，通过bamhi与sali双酶切位点连入慢病毒质粒载体pwpt
‑ꢀ
gfp中替换gfp基因，形成慢病毒表达载体pwpt-44529。
[0141]
将构建的pwpt-44529质粒进行慢病毒包装和纯化，进一步使用重组car 慢病毒感染健康供体t细胞，使用il2与激活剂刺激扩增car-t细胞，收获扩增后的car-t细胞采用流式细胞仪检测car阳性率，由图10可知，慢病毒感染t细胞的阳性率达到40.7％。
[0142]
二、car-t细胞药效评价
[0143]
在96孔板中将转染后的效应细胞：car-t细胞(44529)、未转染t细胞 (ntd)分别与不同靶细胞进行共培养，靶细胞的选择包括：cd26+cd45-的肾癌细胞a498与769-p；cd26-的淋巴瘤细胞raji与肾癌细胞g401；cd26+cd45+ 的淋巴瘤细胞u937与jurkat。共培养24h后取96孔板中的共培养上清，使用 dojindo公司ldh检测试剂盒(ck12)检测上清中靶细胞的ldh释放量来计算不同效靶比情况下car-t细胞和ntd细胞的杀伤率，结果如图11。
[0144]
由检测结果可见cd26靶向的car-t细胞对cd26阴性靶细胞raji与g401 无特异性杀伤作用，对cd26+cd45-细胞(a498、769-p)，cd26 car-t体现出高于对照t细胞明显的杀伤效果，证明了cd26 car-t的靶点特异性杀伤。但是对于cd26+cd45+双阳性细胞(u937、
jurkat)，cd26 car-t的杀伤效果被明显抑制，未检测到特异性杀伤。
[0145]
综上所述，cd26抗体、其他与cd26抗体有关的基因和细胞治疗方法(如靶向cd26的aav基因治疗、靶向cd26的car-t细胞治疗)均显示出对cd45 不表达或低表达的肿瘤细胞有显著的体内外杀伤活性；而对cd45高表达的肿瘤细胞无显著杀伤。
[0146]
基于上述研究结果本技术提供了cd45筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的应用，能有效改善cd26抗体或其衍生物肿瘤免疫治疗的精准性和有效性，提高患者的临床获益；发现了cd26作为肿瘤免疫治疗新靶点的治疗有效性和精准性的新机制。

技术特征：
1.cd26抗体或其衍生物在制备治疗cd26表达且cd45不表达的肿瘤的药物中的应用。2.如权利要求1所述应用，所述cd26表达且cd45不表达的肿瘤是是实体肿瘤。3.如权利要求1所述应用，所述cd26表达且cd45不表达的疾病是血液瘤。4.cd26抗体或其衍生物在制备治疗cd26表达且cd45低表达的肿瘤的药物中的应用。5.如权利要求4所述应用，所述cd26表达且cd45低表达的肿瘤是是实体肿瘤。6.如权利要求5所述应用，所述cd26表达且cd45低表达的疾病是血液瘤。7.如权利要求1至6任一项所述应用，所述cd26抗体为是特异性结合cd26的完整结构抗体、fab片段、fv片段、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。8.如权利要求1至6任一项所述应用，所述cd26抗体衍生物是靶向cd26的cart。9.如权利要求1至6任一项所述应用，所述cd26抗体衍生物是含有抗cd26抗体编码基因的raav载体。10.cd45抗原或抗体在制备用于筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的试剂中应用。11.如权利要求5所述的试剂，其使用方法如下：以所述试剂检测病灶cd45表达情况；cd45低表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45高表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。12.如权利要求6所述的试剂，其使用方法如下：以所述试剂检测病灶cd45表达情况；cd45不表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。13.一种筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的方法，检测病灶cd45表达情况；cd45低表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45高表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。14.一种筛查受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效性的方法，检测病灶cd45表达情况；cd45不表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，cd45表达时，判断该受试者接受cd26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。

技术总结
本发明涉及CD45作为生物标志物在筛查受试者对CD26抗体或其衍生物治疗肿瘤有效性中的应用。具体地，当CD45不表达或低表达时，判断该受试者接受CD26抗体或其衍生物治疗有效或有效的概率高，CD45高表达或较高表达时，判断该受试者接受CD26抗体或其衍生物治疗无效或无效的概率高。本申请筛选出了能够有效筛查对CD26抗体或其衍生物肿瘤治疗有效性的生物标记物，能显著改善CD26抗体或其衍生物肿瘤治疗的精准性和有效性，提高患者的临床获益；发现了CD26作为肿瘤免疫治疗新靶点的治疗有效性和精准性的新机制。和精准性的新机制。


技术研发人员：马永 曹锫沛 葛晨楠 杭建花 倪雯婷
受保护的技术使用者：江苏众红生物工程创药研究院有限公司
技术研发日：2022.01.30
技术公布日：2023/8/9