产L-缬氨酸工程菌及构建方法与应用与流程

产l-缬氨酸工程菌及构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域中，产l-缬氨酸工程菌及构建方法与应用。


背景技术：

2.在微生物中，l-缬氨酸(支链氨基酸的一种)是从丙酮酸开始，经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸生物合成的。通过乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶b催化的反应产生这些中间代谢产物。然而，这些酶还参与从丁酮酸和丙酮酸开始的l-异亮氨酸的生物合成，而且l-亮氨酸也从酮异戊酸(一种中间代谢产物)开始，经由2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮异己酸生物合成。因此，因为支链氨基酸(即l-缬氨酸、l-异亮氨酸和l-亮氨酸)使用相同的酶用于其生物合成过程，所以已知工业上通过发酵生产一种类型的支链氨基酸具有难度。此外，存在的一个问题是工业的批量生产受到由l-缬氨酸(其为终产物)或其衍生物引起的反馈抑制的限制。
3.大肠杆菌具有明确的遗传背景，是氨基酸生产中具有吸引力的工业化生产底盘。然而，相比于谷氨酸棒杆菌，生产l-缬氨酸的大肠杆菌菌株的相关报道较少，这可能是由于大肠杆菌对l-缬氨酸生物合成的调节机制更为复杂。乙酰羟基酸合酶(ahas)是l-缬氨酸生物合成的限速酶，大肠杆菌有三种ahas同工酶，由ilvbn、ilvgm和ilvih编码，具有不同的性质和调节机制。park等人报道了通过escherichia coli w3110和escherichia coli w的系统代谢工程改造l-缬氨酸生产菌株，其l-缬氨酸终产量达到60.7g/l，糖酸转化率为0.22g/g。除了诱变育种和常规代谢工程修饰外，辅因子平衡也被认为是提高l-缬氨酸产量的关键瓶颈。由于胞内辅因子影响代谢网络、信号转导和物质运输，进而影响微生物细胞的生理功能。在微生物发酵生产化学品的过程中，化学品的效价和产量往往受到辅因子不平衡的限制，这主要是由合成途径中辅因子依赖酶的不平衡表达引起的。savrasova和stoynova等人通过用异源nadh依赖性亮氨酸脱氢酶替换天然nadph依赖性转氨酶，构建了一株以大肠杆菌mg1655为出发菌株的l-缬氨酸工程菌。在微需氧条件下，该菌株的糖酸转化率(0.23g/g)仅为最大理论产量0.65g/g的35.4％。开发生物传感器高通量筛选方法，引入外源辅酶再生途径以平衡胞内辅因子，构建高效的工业底盘生产菌株，是需要解决关键科学问题。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何提高l-缬氨酸产量。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于生产缬氨酸的工程菌，所述工程菌为对受体菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括a1）；a1）包括a11）、a12）和a13）：a11）敲除所述受体菌的yjit基因，抑制所述yjit基因的表达或抑制所述yjit基因编码的蛋白质的活性；a12）增加所述受体菌中brnf基因编码蛋白质的含量或增强所述brnf基因编码蛋白质的活性；
a13）增加所述受体菌中brne基因编码蛋白质的含量或增强所述brne基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为大肠杆菌（escherichia coli）。
6.其中，所述受体菌含有yjit基因（geneid:945056，更新日期2023-04-14）。
7.上述工程菌中，所述brnf基因与所述brne基因可来源于谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）。
8.上述工程菌中，所述brnf基因可编码序列表中seq id no.2所示的蛋白质；所述brne基因可编码序列表中seq id no.3所示的蛋白质。
9.上述工程菌中，所述brnf基因可为序列表中seq id no.1的第832-1587位所示的dna分子；所述brne基因可为序列表中seq id no.1的第1584-1910位所示的dna分子。
10.上述工程菌中，所述brnf基因与所述brne基因的表达由能在所述工程菌中启动所述brnf基因与所述brne基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。在本发明的一个实施例中，所述brnf基因与所述brne基因的表达由ptrc启动子启动，所述ptrc启动子为seq id no.1的第758-831位所示的dna分子。
11.具体的，a1）可通过crispr/cas9系统，利用靶向yjit基因的sgrna与作为供体的seq id no.1所示的dna片段进行基因编辑实现。
12.上述工程菌中，所述受体菌可为大肠杆菌（escherichia coli）。
13.上述工程菌中，所述改造还可包括a2）、a3）、a4）和a5）中的任一种、任两种或任三种：a2）包括a21）、a22）和a23）：a21）敲除所述受体菌的yjiv基因，抑制所述yjiv基因的表达或抑制所述yjiv基因编码的蛋白质的活性；a22）增加所述受体菌中ilve基因编码蛋白质的含量或增强所述ilve基因编码蛋白质的活性；a23）增加所述受体菌中ilvd基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvd基因编码蛋白质的活性；a3）包括a31）和a32）：a31）敲除所述受体菌的trpr基因，抑制所述trpr基因的表达或抑制所述trpr基因编码的蛋白质的活性；a32）增加所述受体菌中ilvh
g14d 、s17f
基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvh
g14d 、s17f
基因编码蛋白质的活性；所述ilvh
g14d 、s17f
基因由将ilvh基因中第14位甘氨酸密码子替换为天冬氨酸密码子、第17位丝氨酸密码子替换为苯丙氨酸密码子得到；a4）包括a41）、a42）和a43）：a41）敲除所述受体菌的laci基因，抑制所述laci基因的表达或抑制所述laci基因编码的蛋白质的活性；a42）敲除所述受体菌的lacz基因，抑制所述lacz基因的表达或抑制所述lacz基因编码的蛋白质的活性；a43）增加所述受体菌中dna聚合酶的含量或增强所述dna聚合酶的活性；
a5）包括a51）和a52）：a51）敲除所述受体菌的ycgh基因，抑制所述ycgh基因的表达或抑制所述ycgh基因编码的蛋白质的活性；a52）增加所述受体菌中ilvc基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvc基因编码蛋白质的活性。
14.其中，所述受体菌还含有yjiv基因（geneid:2847669，更新日期2023-04-14）、trpr基因（geneid:948917，更新日期2023-04-14）、laci基因（geneid:945007，更新日期2023-04-14）、lacz基因（geneid:945006，更新日期2023-04-14）和ycgh基因（geneid:2847703，更新日期2023-04-14）。
15.上述工程菌中，所述ilve基因可来源于枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）；所述ilvd基因可来源于大肠杆菌（escherichia coli）；所述ilvh基因可来源于大肠杆菌（escherichia coli）；所述dna聚合酶可来源于大肠杆菌（escherichia coli）；所述ilvc基因可来源于大肠杆菌（escherichia coli）。
16.上述工程菌中，所述ilve基因可编码序列表中seq id no.6所示的蛋白质；所述ilvd基因可编码序列表中seq id no.5所示的蛋白质；所述ilvh
g14d 、s17f
基因可编码序列表中seq id no.8所示的蛋白质；所述dna聚合酶可为序列表中seq id no.10所示的蛋白质；所述ilvc基因可编码序列表中seq id no.12所示的蛋白质。
17.上述工程菌中，所述ilve基因可为序列表中seq id no.4的第808-1902位所示的dna分子；所述ilvd基因可为序列表中seq id no.4的第1977-3827位所示的dna分子；所述ilvh
g14d 、s17f
基因可为序列表中seq id no.7的第835-1326位所示的dna分子；所述dna聚合酶的编码基因可为序列表中seq id no.9的第701-3352位所示的dna分子；所述ilvc基因可为序列表中seq id no.11的第794-2269位所示的dna分子。
18.所述ilve基因、所述ilvd基因、所述ilvh
g14d 、s17f
基因、所述dna聚合酶编码基因和所述ilvc基因的表达由能在所述工程菌中启动相应基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。
19.在本发明的一个实施例中，所述ilve基因的表达由ptrc启动子启动，所述ptrc启动子为seq id no.4的第1903-1976位所示的dna分子。
20.在本发明的另一个实施例中，所述ilvd基因的表达由pilvd启动子启动，所述pilvd启动子为seq id no.4的第3828-3893位所示的dna分子。
21.在本发明的另一个实施例中，所述ilvh
g14d 、s17f
基因的表达由ptrc启动子启动，所述ptrc启动子为seq id no.7的第761-834位所示的dna分子。
22.在本发明的另一个实施例中，所述dna聚合酶编码基因的表达由pxylf启动子启动，所述pxylf启动子为seq id no.9的第3353-3617位所示的dna分子。
23.在本发明的另一个实施例中，所述ilvc基因的表达由ptrc启动子启动，所述ptrc
启动子为seq id no.11的第2270-2343位所示的dna分子。
24.具体的，a2）可通过crispr/cas9系统，利用靶向yjiv基因的sgrna与作为供体的seq id no.4所示的dna片段进行基因编辑实现。
25.a3）可通过crispr/cas9系统，利用靶向trpr基因的sgrna与作为供体的seq id no.7所示的dna片段进行基因编辑实现。
26.a4）可通过crispr/cas9系统，利用靶向laci和lacz基因的sgrna与作为供体的seq id no.9所示的dna片段进行基因编辑实现。
27.a5）可通过crispr/cas9系统，利用靶向ycgh基因的sgrna与作为供体的seq id no.11所示的dna片段进行基因编辑实现。
28.本发明的受体菌包括但不限于大肠埃希氏菌（escherichia coli），任何含有yjit基因、yjiv基因、trpr基因、laci和lacz基因、ycgh基因且可以合成l-缬氨酸的细菌均可利用本发明的方法来制备重组菌并生产l-赖氨酸，所述细菌可为大肠埃希氏菌（escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌、北京棒杆菌（corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌、泛菌（pantoea）、菠萝泛菌（pantoea ananatis）、短杆菌（bacillus brevis）、乳酸短杆菌或黄色短杆菌。所述酵母可为酿酒酵母或毕赤酵母。
29.在本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌（escherichia coli）为大肠埃希氏菌（escherichia coli）yp045或大肠杆菌（escherichia coli）w3110。
30.在本发明的一个实施例中，所得重组菌为重组菌cgmcc22721-yjit和w3110-yjit，重组菌cgmcc22721-yjit和w3110-yjit分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，同时插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
31.在本发明的另一个实施例中，所得重组菌为重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv和w3110-yjit-yjiv，重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv和w3110-yjit-yjiv分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；同时将yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
32.在本发明的另一个实施例中，所得重组菌为重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr和w3110-yjit-yjiv-trpr，重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr和w3110-yjit-yjiv-trpr分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；将yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；同时将trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因，保
持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
33.在本发明的另一个实施例中，所得重组菌为重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-laciz和w3110-yjit-yjiv-trpr-laciz，重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-laciz和w3110-yjit-yjiv-trpr-laciz分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；将yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；将trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因；同时将laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
34.本发明还提供了制备用于生产缬氨酸的工程菌的方法，所述方法包括：对受体菌进行上述a1）的改造，得到目的工程菌；所述受体菌为大肠杆菌（escherichia coli）。
35.上述方法还可包括对所述受体菌进行上述a2）、a3）、a4）和a5）这四种中的任一种、任两种或任三种的改造。
36.本发明还提供了l-缬氨酸的制备方法，所述方法包括：培养所述工程菌，得到l-缬氨酸。
37.上述方法中，培养所述工程菌可采用能使所述工程菌生长的培养基进行；和/或，培养所述重组工程菌采用能使所述工程菌生长的条件进行。
38.本发明还提供了一种用于生产l-缬氨酸的产品，所述产品为p1）或为由p1）与p2）
‑ꢀ
p5）中任一种、任两种或任三种组成的产品：p1）为分别或同步实现a11）、a12）和a13）的物质：a11）敲除受体菌的yjit基因或抑制所述yjit基因的表达或抑制所述yjit基因编码的蛋白质的活性；a12）增加受体菌中brnf基因编码蛋白质的含量或增强所述brnf基因编码蛋白质的活性；a13）增加受体菌中brne基因编码蛋白质的含量或增强所述brne基因编码蛋白质的活性；p2）为分别或同步实现a21）、a22）和a23）的物质：a21）敲除受体菌的yjiv基因或抑制所述yjiv基因的表达或抑制所述yjiv基因编码的蛋白质的活性；a22）增加受体菌中ilve基因编码蛋白质的含量或增强所述ilve基因编码蛋白质的活性；a23）增加受体菌中ilvd基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvd基因编码蛋白质的活性；p3）为分别或同步实现a31）和a32）的物质：a31）敲除受体菌的trpr基因或抑制所述trpr基因的表达或抑制所述trpr基因编码的蛋白质的活性；
a32）增加受体菌中ilvh
g14d 、s17f
基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvh
g14d 、s17f
基因编码蛋白质的活性；p4）为分别或同步实现a41）、a42）和a43）的物质：a41）敲除受体菌的laci基因或抑制所述laci基因的表达或抑制所述laci基因编码的蛋白质的活性；a42）敲除受体菌的lacz基因或抑制所述lacz基因的表达或抑制所述lacz基因编码的蛋白质的活性；a43）增加受体菌中dna聚合酶的含量或增强所述dna聚合酶的活性；p5）为分别或同步实现a51）和a52）的物质：a51）敲除受体菌的ycgh基因或抑制所述ycgh基因的表达或抑制所述ycgh基因编码的蛋白质的活性；a52）增加受体菌中ilvc基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvc基因编码蛋白质的活性。
39.所述工程菌或所述产品在生产l-缬氨酸中的应用，或在制备用于生产l-缬氨酸产品中的应用，或在制备含有l-缬氨酸的食品、饲料或药品中的应用，也属于本发明的保护范围。
40.本发明的工程菌及其制备方法与相关产品可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的缬氨酸，所生产的产物还可为谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。
41.实验证明，本发明改造后的工程菌可提高l-缬氨酸产量，可用于生产l-缬氨酸，具有很好的应用前景。
42.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
43.保藏说明分类命名：大肠埃希氏菌（escherichia coli）。
44.菌株编号：yp045。
45.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
46.保藏单位简称：cgmcc。
47.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。
48.保藏日期：2021年06月15日。
49.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22721。
附图说明
50.图1、发酵培养基配方（其余为水）。
51.图2、发酵控制工艺。
52.图3、l-缬氨酸产量及显著性分析。
具体实施方式
53.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
54.下述实施例中，l-缬氨酸生产菌cgmcc22721为大肠埃希氏菌（escherichia coli）yp045，该菌株已于2021年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22721。
55.实施例1、构建基因组上缺失yjit基因同时过表达brnf-brne基因的工程菌株。
56.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的yjit基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的yjit基因（geneid:945056，更新日期2023-04-14）），同时插入ptrc启动子启动的brnf-brne基因（branched chain amino acid exporter，支链氨基酸输出蛋白），来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032，以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
57.一、sgrna的构建依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，使用crispr rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgrna靶序列，选择好合适的sgrna靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pgrb克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgrna质粒。
58.扩增sgrna片段，无需模板，只需进行pcr退火过程即可，体系及程序如下：pcr反应体系：sgrna-1f 10μl，sgrna-1r 10μl；pcr反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用dna纯化试剂盒回收sgrna目的dna片段，测定其dna浓度，并将浓度稀释至100ng/μl。
59.将pgrb质粒利用spei酶切后再进行去磷酸化处理，利用gibson assembly试剂盒（new england公司）进行sgrna和去磷酸化后的线性化质粒的重组。重组体系：neb组装酶2.5μl，去磷酸化后的线性化质粒2μl，sgrna目的dna片段 0.5μl。50℃组装30min后将产物转化dh5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgrna-pf/sgrna-pr测序鉴定。将测序正确的质粒命名为pgrb-sgrna-1。
60.本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pgrb克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgrna序列：sgrna-1f:5'-tgacagctagctcagtcctaggtataatactagtgtacgcgttgccaattctatgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg-3'，sgrna-1r:5'-ccttattttaacttgctatttctagctctaaaacatagaattggcaacgcgtacactagtattatacctaggactgagctagctgtca-3'，sgrna-pf: 5'-gtctcatgagcggatacatatttg-3'，sgrna-pr: 5'-gcgtcaggtgcataaacaga-3'。
61.二、pcr扩增同源重组片段
依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，设计并合成敲除yjit基因的引物，同时插入ptrc-brnf-brne基因序列的引物，以crispr/cas9基因编辑的方式敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的yjit基因，同时插入ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）。
62.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p1:5'-gagtgatgagcggttgaag-3'，p2:5'-ctcacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaaaaaacaggcagcaaagtcc-3'，p3:5'-cgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccgtgcaaaaaacgcaagag-3'，p4: 5'-cttcacaggtagtgcttttagttagaaaagattcaccagtccaac-3'，p5: 5'-gtgaatcttttctaactaaaagcactacctgtgaagg-3'，p6: 5'-ctgcggcaataatcaacg-3'。
63.以大肠杆菌w3110基因组dna为模板，以引物p1/p2、p5/p6和kapa hifi hotstart（上海华雅思创生物科技有限公司，kk2601）进行pcr扩增，获得大小分别为801bp的上同源臂和684bp和下同源臂片段；以谷氨酸棒状杆菌atcc13032基因组dna为模板，以引物p3/p4和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小为1153bp的ptrc-brnf-brne基因片段。pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p1/p6进行overlap pcr获得同源重组dna片段δyjit-ptrc-brnf-brne（seq id no.1），大小为2579 bp。
64.seq id no.1中，第758-831位所示为ptrc启动子，第832-1910位所示为brnf-brne基因，编码seq id no.2所示的brnf蛋白质（编码序列为seq id no.1的第832-1587位）与seq id no.3所示的brne蛋白质（编码序列为seq id no.1的第1584-1910位）。
65.三、感受态的制备及转化提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和大肠杆菌w3110感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-cas9和w3110-cas9转化子。
66.引物如下（上海invitrogen公司合成）：predcas9-pf: 5'-gcagtggcggttttcatg-3'；predcas9-pr:5'-ccttggtgatctcgcctttc-3'。
67.制备cgmcc22721-cas9和w3110-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pgrb-sgrna-1质粒和同源重组dna片段δyjit-ptrc-brnf-brne，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p7/p8进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1720bp片段的为阳性转化子。
68.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p7: 5'-gctgtattccttatgtggacc-3'，
p8: 5'-gcaggaatccaaagtcagc-3'。
69.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-1，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p1/p6进行pcr鉴定，能扩增出大小2579bp（seq id no.1）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-yjit和w3110-yjit；重组菌cgmcc22721-yjit和w3110-yjit均缺失yjit基因，同时过表达ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；具体地，重组菌cgmcc22721-yjit和w3110-yjit分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，同时插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
70.实施例2、构建基因组上缺失yjiv基因同时过表达ilve-ilvd基因的工程菌株。
71.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的yjiv基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的yjiv基因（geneid:2847669，更新日期2023-04-14），同时插入ptrc启动子启动的ilve基因（branched-chain amino-acid aminotransferase，支链氨基酸转氨酶，来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（dihydroxyacid dehydratase，二羟基酸脱水酶，来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
72.一、sgrna的构建依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，使用crispr rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgrna靶序列，选择好合适的sgrna靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pgrb克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgrna质粒。
73.扩增sgrna片段，无需模板，只需进行pcr退火过程即可，体系及程序如下：pcr反应体系：sgrna-2f 10μl，sgrna-2r 10μl；pcr反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用dna纯化试剂盒回收sgrna目的dna片段，测定其dna浓度，并将浓度稀释至100ng/μl。
74.将pgrb质粒利用spei酶切后再进行去磷酸化处理，利用gibson assembly试剂盒（new england公司）进行sgrna和去磷酸化后的线性化质粒的重组。重组体系：neb组装酶2.5μl，去磷酸化后的线性化质粒2μl，sgrna目的dna片段 0.5μl。50℃组装30min后将产物转化dh5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgrna-pf/sgrna-pr测序鉴定。将测序正确的质粒命名为pgrb-sgrna-2。
75.本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pgrb克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgrna序列：sgrna-2f:5'-tgacagctagctcagtcctaggtataatactagtctattgatattatcaatacagt
tttagagctagaaatagcaagttaaaataagg-3'，sgrna-2r:5'-ccttattttaacttgctatttctagctctaaaactgtattgataatatcaatagactagtattatacctaggactgagctagctgtca-3'。
76.二、pcr扩增同源重组片段依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，设计并合成敲除yjiv基因的引物，同时插入ptrc-ilve基因和pilvd-ilvd基因的引物，以crispr/cas9基因编辑的方式敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的yjiv基因，同时插入ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）。
77.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p9: 5'-tgaatggactgctatgcg-3'，p10: 5'-cacagtgtattaagcagacgttaacaacgcagtacttcctgctg-3'，p11: 5'-gaagtactgcgttgttaacgtctgcttaatacactgtg-3'，p12:5'-gtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatggaactttttaaatatatggag-3'，p13:5'-ctcacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaattaaccccccagtttcgatttat-3'，p14: 5'-ccaccagcacatccgttgaaatacaaaaaatgggac-3'，p15: 5'-tcccattttttgtatttcaacggatgtgctggtgg-3'，p16: 5'-tgaagacacgctggctaac-3'。
78.以大肠杆菌w3110基因组dna为模板，以引物p9/p10、p13/p14、p15/p16和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小分别为831bp的上同源臂、1979bp的pilvd-ilvd基因和856bp下同源臂片段；以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168基因组dna为模板，以引物p11/p12和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小为1161bp的ptrc-ilve基因。pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p9/p16进行overlap pcr获得同源重组dna片段δyjiv-ptrc-ilve-pilvd-ilvd（seq id no.4），大小为4732 bp。
79.seq id no.4中，第3828-3893位所示为pilvd启动子，第1977-3827位所示为ilvd基因，编码seq id no.5所示的ilvd蛋白质；第1903-1976位所示为ptrc启动子，第808-1902位所示为ilve基因，编码seq id no.6所示的ilve蛋白质。
80.三、感受态的制备及转化将实施例1的cgmcc22721-cas9和w3110-cas9制备感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pgrb-sgrna-2质粒和同源重组dna片段δyjiv-ptrc-ilve-pilvd-ilvd，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p17/p18进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1543bp片段的为阳性转化子。
81.引物如下（上海invitrogen公司合成）：
p17: 5'-agcgagtttccaataccg-3'，p18: 5'-atttctcctgctttcggc-3'。
82.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-2，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p9/p16进行pcr鉴定，能扩增出大小4732bp（seq id no.4）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-yjiv和w3110-yjiv；重组菌cgmcc22721-yjiv和w3110-yjiv均缺失yjiv基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；具体地，重组菌cgmcc22721-yjiv1和w3110-yjiv分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjiv基因编码区进行敲除，同时插入ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
83.实施例3、构建基因组上缺失trpr基因同时过表达ilvh基因的工程菌株。
84.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的trpr基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的trpr基因（dna-binding transcriptional repressor，dna 结合转录抑制因子；geneid:948917，更新日期2023-04-14），同时插入ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因（acetolactate synthase,乙酰乳酸合成酶），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
85.一、sgrna的构建依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，使用crispr rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgrna靶序列，选择好合适的sgrna靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pgrb克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgrna质粒。
86.扩增sgrna片段，无需模板，只需进行pcr退火过程即可，体系及程序如下：pcr反应体系：sgrna-3f 10μl，sgrna-3r 10μl；pcr反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用dna纯化试剂盒回收sgrna目的dna片段，测定其dna浓度，并将浓度稀释至100ng/μl。
87.将pgrb质粒利用spei酶切后再进行去磷酸化处理，利用gibson assembly试剂盒（new england公司）进行sgrna和去磷酸化后的线性化质粒的重组。重组体系：neb组装酶2.5μl，去磷酸化后的线性化质粒2μl，sgrna目的dna片段 0.5μl。50℃组装30min后将产物转化dh5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgrna-pf/sgrna-pr测序鉴定。将测序正确的质粒命名为pgrb-sgrna-3。
88.本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pgrb克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgrna序列：
sgrna-3f:5'-tgacagctagctcagtcctaggtataatactagtcgtgagttaaaaaatgaactgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg-3'，sgrna-3r:5'-ccttattttaacttgctatttctagctctaaaacagttcattttttaactcacgactagtattatacctaggactgagctagctgtca-3'。
89.二、pcr扩增同源重组片段依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，设计并合成敲除trpr基因的引物，以及插入ptrc-ilvh
g14d 、s17f
基因序列的引物，以crispr/cas9基因编辑的方式敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的trpr基因，同时插入ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因。
90.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p19:5'-ccaatctggtgaagagcaag-3'，p20:5'-ctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaatgctgaatagggtgattgttg-3'，p21:5'-caatttcacacaggaaacagaccatgcgccggatattatcagtcttactcgaaaatgaatcagacgcgttattccgc-3'，p22: 5'-gtcttatcatgcctaccaaatcaacgcattattttatcg-3'，p23: 5'-cgataaaataatgcgttgatttggtaggcatgataagac-3'，p24: 5'-gtgcgtcctaaatcgctac-3'。
91.以大肠杆菌w3110基因组dna为模板，以引物p19/p20、p21/p22、p23/p24和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小分别为831bp的上同源臂、535bp的ptrc-ilvh
g14d 、s17f
基因和801bp和下同源臂片段；pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p19/p24进行overlap pcr获得同源重组dna片段δtrpr-ptrc-ilvh（seq id no.7），大小为2108 bp。
92.seq id no.7中，第761-834位所示为ptrc启动子，第835-1326位所示为ilvh
g14d 、s17f
基因，编码seq id no.8所示的ilvh
g14d 、s17f
蛋白质。
93.三、感受态的制备及转化将实施例1的cgmcc22721-cas9和w3110-cas9制备感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pgrb-sgrna-3质粒和同源重组dna片段δtrpr-ptrc-ilvh，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p25/p26进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1437bp片段的为阳性转化子。
94.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p25: 5'-catcggcgaagagtatgag-3'，p26: 5'-aaagtccgaccacaccagag-3'。
95.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-3，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p19/p24进
行pcr鉴定，能扩增出大小2108bp（seq id no.7）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-trpr和w3110-trpr；重组菌cgmcc22721-trpr和w3110-trpr均缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因；具体地，重组菌cgmcc22721-trpr和w3110-trpr分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上trpr基因部分编码区进行敲除，同时插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
96.实施例4、构建基因组上缺失laci-lacz基因同时过表达dna聚合酶基因的工程菌株。
97.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的laci-lacz基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的laci-lacz基因（dna-binding transcriptional repressor，dna 结合转录抑制因子；beta-d-galactosidase，β-d
‑ꢀ
半乳糖苷酶；laci geneid:945007，更新日期2023-04-14；lacz geneid:945006，更新日期2023-04-14），同时插入pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
98.一、sgrna的构建依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，使用crispr rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgrna靶序列，选择好合适的sgrna靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pgrb克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgrna质粒。
99.扩增sgrna片段，无需模板，只需进行pcr退火过程即可，体系及程序如下：pcr反应体系：sgrna-4f 10μl，sgrna-4r 10μl；pcr反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用dna纯化试剂盒回收sgrna目的dna片段，测定其dna浓度，并将浓度稀释至100ng/μl。
100.将pgrb质粒利用spei酶切后再进行去磷酸化处理，利用gibson assembly试剂盒（new england公司）进行sgrna和去磷酸化后的线性化质粒的重组。重组体系：neb组装酶2.5μl，去磷酸化后的线性化质粒2μl，sgrna目的dna片段 0.5μl。50℃组装30min后将产物转化dh5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgrna-pf/sgrna-pr测序鉴定。将测序正确的质粒命名为pgrb-sgrna-4。
101.本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pgrb克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgrna序列：sgrna-4f:5'-tgacagctagctcagtcctaggtataatactagttcactgcccgctttccagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg-3'，sgrna-4r: 5'-ccttattttaacttgctatttctagctctaaaacgactggaaag cgggcagtgaactagtattatacctaggactgagctagctgtca-3'。
102.二、pcr扩增同源重组片段依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，设计并合成敲除laci-lacz基因序列的引物，以及插入pxylf-dna聚合酶基因序列的引物，以crispr/cas9
基因编辑的方式敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的laci-lacz基因，同时插入pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）。
103.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p27:5'-cggtaataatccacagcagg-3'，p28: 5'-gacttcgcgttcgcgtaacaggtagcagagcgggta-3'，p29: 5'-tacccgctctgctacctgttacgcgaacgcgaagtc-3'，p30: 5'-ctaactacagaaggccctacaccatgaacacgattaacatcgc-3'，p31: 5'-gcgatgttaatcgtgttcatggtgtagggccttctgtagttag-3'，p32: 5'-cattaagttctgtctcggcggagataattcacaagtgtgcg-3'，p33: 5'-cgcacacttgtgaattatctccgccgagacagaacttaatg-3'，p34: 5'-ggttacggacagaactaccg-3'。
104.以大肠杆菌w3110基因组dna为模板，以引物p27/p28、p31/p32、p33/p34和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小分别为718bp的上同源臂、305bp的pxylf启动子和928bp和下同源臂片段；以大肠杆菌bl21基因组dna为模板，以引物p29/p30和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小为2693bp的dna聚合酶基因。pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p27/p34进行overlap pcr获得同源重组dna片段δlaciz-pxylf-dna polymerase（seq id no.9），大小为4524 bp。
105.seq id no.9中，第3353-3617位所示为pxylf启动子，第701-3352位所示为dna聚合酶基因，编码seq id no.10所示的dna聚合酶。
106.三、感受态的制备及转化将实施例1的cgmcc22721-cas9和w3110-cas9制备感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pgrb-sgrna-4质粒和同源重组dna片段δlaciz-pxylf-dna polymerase，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p35/p36进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1655bp片段的为阳性转化子。
107.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p35: 5'-ttcgcccattgtcgttac-3'，p36: 5'-agttccgcttacagcctacc-3'。
108.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-4，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p27/p34进行pcr鉴定，能扩增出大小4524bp（seq id no.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-laciz和w3110-laciz；重组菌cgmcc22721-laciz和w3110-laciz均缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；具体地，重
组菌cgmcc22721-laciz和w3110-laciz分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上laci-lacz基因部分编码区进行敲除，同时插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
109.实施例5、构建基因组上缺失ycgh基因同时过表达ilvc基因的工程菌株。
110.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的ycgh基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的ycgh基因（geneid:2847703，更新日期2023-04-14）），同时插入ptrc启动子启动的ilvc基因（ketol-acid reductoisomerase，酮醇酸还原异构酶，来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
111.一、sgrna的构建依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，使用crispr rgen tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgrna靶序列，选择好合适的sgrna靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pgrb克隆载体同源臂序列，以便通过重组形成完整的sgrna质粒。
112.扩增sgrna片段，无需模板，只需进行pcr退火过程即可，体系及程序如下：pcr反应体系：sgrna-5f 10μl，sgrna-5r 10μl；pcr反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用dna纯化试剂盒回收sgrna目的dna片段，测定其dna浓度，并将浓度稀释至100ng/μl。
113.将pgrb质粒利用spei酶切后再进行去磷酸化处理，利用gibson assembly试剂盒（new england公司）进行sgrna和去磷酸化后的线性化质粒的重组。重组体系：neb组装酶2.5μl，去磷酸化后的线性化质粒2μl，sgrna目的dna片段 0.5μl。50℃组装30min后将产物转化dh5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgrna-pf/sgrna-pr测序鉴定。将测序正确的质粒命名为pgrb-sgrna-5。
114.本实验所用引物如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的核苷酸为pgrb克隆载体同源臂序列，加粗的核苷酸为sgrna序列：sgrna-5f:5'-tgacagctagctcagtcctaggtataatactagtcccgtcctgcgccccgaagcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg-3'，sgrna-5r:5'-ccttattttaacttgctatttctagctctaaaacgcttcggggcgcaggacgggactagtattatacctaggactgagctagctgtca-3'。
115.二、pcr扩增同源重组片段依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，设计并合成敲除ycgh基因的引物，以及插入ptrc-ilvc基因的引物，以crispr/cas9基因编辑的方式敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因中的ycgh基因，同时插入ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）。
116.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p37:5'-aaatggagggataacagcc-3'，p38: 5'-gctgttgcgggttaacgctccatttagaatagagtcggacgaaat-3'，
p39: 5'-ctaaatggagcgttaacccgcaacagcaatac-3'，p40:5'-gccatttacgccaagtttttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgag-3'，p41:5'-cagtgtattgaagtagttagccatggtctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacattatac-3'，p42: 5'-ttgccttcgggcttatctc-3'。
117.以大肠杆菌w3110基因组dna为模板，以引物p37/p38、p39/p40、p41/p42和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小分别为808bp的上同源臂、1580bp的ptrc-ilvc基因和944bp和下同源臂片段；pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p37/p42进行overlap pcr获得同源重组dna片段δycgh-ptrc-ilvc（seq id no.11），大小为3189 bp。
118.seq id no.11中，第2270-2343位所示为ptrc启动子，第794-2269位所示为ilvc基因，编码seq id no.12所示的ilvc蛋白质。
119.四、感受态的制备及转化将实施例1的cgmcc22721-cas9和w3110-cas9制备感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pgrb-sgrna-5质粒和同源重组dna片段δycgh-ptrc-ilvc，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p43/p44进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1669bp片段的为阳性转化子。
120.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p43: 5'-aagacctctggaagcgtatc-3'，p44: 5'
‑ꢀ
cgttgcggaagtgaaatc-3'。
121.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-5，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p37/p42进行pcr鉴定，能扩增出大小3189bp（seq id no.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-ycgh和w3110-ycgh；重组菌cgmcc22721-ycgh和w3110-ycgh均缺失ycgh基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；具体地，重组菌cgmcc22721-ycgh和w3110-ycgh分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上ycgh基因部分编码区进行敲除，同时插入了ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
122.实施例6、构建cgmcc22721-yjit和w3110-yjit上缺失yjiv基因同时过表达ilve-ilvd基因的工程菌株。
123.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-yjit和野生型大肠杆菌w3110-yjit基因中的yjiv基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的yjiv基因），同时插入ptrc启
动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
124.一、pcr扩增同源重组片段依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，设计并合成敲除yjiv基因的引物，同时插入ptrc-ilve基因和pilvd-ilvd基因的引物，以crispr/cas9基因编辑的方式敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-yjit和野生型大肠杆菌w3110-yjit基因组中的yjiv基因，同时插入ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis）和pilvd启动子启动的ilvd基因。
125.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p45: 5'-agttcgccctttgctctctc-3'。
126.以大肠杆菌w3110-yjit基因组dna为模板，以引物p45/p10、p13/p14、p15/p16和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小分别为812bp的上同源臂、1979bp的pilvd-ilvd基因和856bp下同源臂片段；以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168基因组dna为模板，以引物p11/p12和kapa hifi hotstart进行pcr扩增，获得大小为1161bp的ptrc-ilve基因。pcr反应结束后，采用柱式dna凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的dna以引物p45/p16进行overlap pcr获得同源重组dna片段δyjiv-ptrc-ilve-pilvd-ilvd-2（seq id no.13），大小为4713 bp。
127.seq id no.13中，第3809-3874位所示为pilvd启动子，第1958-3808位所示为ilvd基因，编码seq id no.5所示的ilvd蛋白质；第1884-1957位所示为ptrc启动子，第789-1883位所示为ilve基因，编码seq id no.6所示的ilve蛋白质。
128.二、感受态的制备及转化提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例1的cgmcc22721-yjit和w3110-yjit感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-yjit-cas9和w3110-yjit-cas9转化子。
129.制备cgmcc22721-yjit-cas9和w3110-yjit-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例2的pgrb-sgrna-2质粒和同源重组dna片段δyjiv-ptrc-ilve-pilvd-ilvd-2，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p46/p18进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1561bp片段的为阳性转化子。
130.引物如下（上海invitrogen公司合成）：p46: 5'-agcgtttcactcctactggg-3'。
131.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-2，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p45/p16进
glutamicum）atcc13032）；缺失yjiv基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因。具体地，重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr和w3110-yjit-yjiv-trpr分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；将yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；同时将trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
137.实施例8、构建cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr和w3110-yjit-yjiv-trpr上缺失laci-lacz基因同时过表达dna聚合酶基因的工程菌株。
138.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr和野生型大肠杆菌w3110-yjit-yjiv-trpr基因中的laci-lacz基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的laci-lacz基因），同时插入pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
139.提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例7的cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr和w3110-yjit-yjiv-trpr感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-cas9和w3110-yjit-yjiv-trpr-cas9转化子。
140.制备cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-cas9和w3110-yjit-yjiv-trpr-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例4的pgrb-sgrna-4质粒和同源重组dna片段δlaciz-pxylf-dna polymerase，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p35/p36进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1655bp片段的为阳性转化子。
141.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-4，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p27/p34进行pcr鉴定，能扩增出大小4524bp（seq id no.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-laciz和w3110-yjit-yjiv-trpr-laciz；重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-laciz和w3110-yjit-yjiv-trpr-laciz均缺失yjit基因，同时过表达ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；缺失yjiv基因，同时过表达ptrc启动子启动
laciz-ycgh均缺失yjit基因，同时过表达ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；缺失yjiv基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因；缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；缺失ycgh基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）。具体地，重组菌cgmcc22721-yjit-yjiv-trpr-laciz-ycgh和w3110-yjit-yjiv-trpr-laciz-ycgh分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjit基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的brnf-brne基因（来自谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）atcc13032）；将yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；将trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因；将laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；同时将ycgh基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
147.实施例10、构建cgmcc22721-yjiv和w3110-yjiv上缺失trpr基因同时过表达ilvh基因的工程菌株。
148.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-yjiv和野生型大肠杆菌w3110-yjiv基因中的trpr基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的trpr基因），同时插入ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因，以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
149.提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例2的cgmcc22721-yjiv和w3110-yjiv感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-yjiv-cas9和w3110-yjiv-cas9转化子。
150.制备cgmcc22721-yjiv-cas9和w3110-yjiv-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例3的pgrb-sgrna-3质粒和同源重组dna片段δtrpr-ptrc-ilvh，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p25/p26进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1437bp片段的为阳性转化子。
151.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-3，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p19/p24进
coli）w3110）；缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因；缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）。具体地，重组菌cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz和w3110-yjiv-trpr-laciz分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；将trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因；同时将laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
157.实施例12、构建cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz和w3110-yjiv-trpr-laciz上缺失ycgh基因同时过表达ilvc基因的工程菌株。
158.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz和野生型大肠杆菌w3110-yjiv-trpr-laciz基因中的ycgh基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的ycgh基因），同时插入ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
159.提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例11的cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz和野生型大肠杆菌w3110-yjiv-trpr-laciz感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz-cas9和w3110-yjiv-trpr-laciz-cas9转化子。
160.制备cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz-cas9和w3110-yjiv-trpr-laciz-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例5的pgrb-sgrna-5质粒和同源重组dna片段δycgh-ptrc-ilvc，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p43/p44进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1669bp片段的为阳性转化子。
161.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-5，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p37/p42进行pcr鉴定，能扩增出大小3189bp（seq id no.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz-ycgh和w3110-yjiv-trpr-laciz-ycgh；重组菌cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz-ycgh和w3110-yjiv-trpr-laciz-ycgh均缺失yjiv基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基
因；缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；缺失ycgh基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）。具体地，重组菌cgmcc22721-yjiv-trpr-laciz-ycgh和w3110-yjiv-trpr-laciz-ycgh分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上yjiv基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilve基因（来自枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）和pilvd启动子启动的ilvd基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）；将trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因；将laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；同时将ycgh基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
162.实施例13、构建cgmcc22721-trpr和w3110-trpr上缺失laci-lacz基因同时过表达dna聚合酶基因的工程菌株。
163.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-trpr和野生型大肠杆菌w3110-trpr基因中的laci-lacz基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的laci-lacz基因），同时插入pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
164.提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例3的cgmcc22721-trpr和w3110-trpr感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp）的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-trpr-cas9和w3110-trpr-cas9转化子。
165.制备cgmcc22721-trpr-cas9和w3110-trpr-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例4的pgrb-sgrna-4质粒和同源重组dna片段δlaciz-pxylf-dna polymerase，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p35/p36进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1655bp片段的为阳性转化子。
166.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-4，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p27/p34进行pcr鉴定，能扩增出大小4524bp（seq id no.9）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-trpr-laciz和w3110-trpr-laciz；重组菌cgmcc22721-trpr-laciz和w3110-trpr-laciz均缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因；缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）。具体地，重组菌cgmcc22721-trpr-laciz和w3110-trpr-laciz分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌
w3110基因组上trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因；同时将laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
167.实施例14、构建cgmcc22721-trpr-laciz和w3110-trpr-laciz上缺失ycgh基因同时过表达ilvc基因的工程菌株。
168.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-trpr-laciz和野生型大肠杆菌w3110-trpr-laciz基因中的ycgh基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的ycgh基因），同时插入ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
169.提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例13的cgmcc22721-trpr-laciz和野生型大肠杆菌w3110-trpr-laciz感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-trpr-laciz-cas9和w3110-trpr-laciz-cas9转化子。
170.制备cgmcc22721-trpr-laciz-cas9和w3110-trpr-laciz-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例5的pgrb-sgrna-5质粒和同源重组dna片段δycgh-ptrc-ilvc，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p43/p44进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1669bp片段的为阳性转化子。
171.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-5，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p37/p42进行pcr鉴定，能扩增出大小3189bp（seq id no.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-trpr-laciz-ycgh和w3110-trpr-laciz-ycgh；重组菌cgmcc22721-trpr-laciz-ycgh和w3110-trpr-laciz-ycgh均缺失trpr基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvh
g14d 、s17f
基因；缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；缺失ycgh基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）。具体地，重组菌cgmcc22721-trpr-laciz-ycgh和w3110-trpr-laciz-ycgh分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上trpr基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的突变的ilvh
g14d 、s17f
基因；将laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；同时将ycgh基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
172.实施例15、构建cgmcc22721-laciz和w3110-laciz上缺失ycgh基因同时过表达
ilvc基因的工程菌株。
173.依据ncbi公布的大肠杆菌（escherichia coli）w3110基因组序列，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除l-缬氨酸生产菌cgmcc22721-laciz和野生型大肠杆菌w3110-laciz基因中的ycgh基因（经测序确认这些菌株染色体上保留有完整的ycgh基因），同时插入ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），以此更深入研究这些基因对合成l-缬氨酸的影响。
174.提取predcas9质粒（含有壮观霉素抗性基因），分别转化到实施例4的cgmcc22721-laciz和野生型大肠杆菌w3110-laciz感受态细胞中，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养，挑选抗壮观霉素（100mg/l）的单菌落用引物predcas9-pf/predcas9-pr 进行 pcr鉴定，获得943bp的为含有predcas9质粒的cgmcc22721-laciz-cas9和w3110-laciz-cas9转化子。
175.制备cgmcc22721-laciz-cas9和w3110-laciz-cas9感受态细胞。当菌体长至od
600
=0.1加入终浓度0.1mm的iptg以诱导λ
‑ꢀ
red介导的同源重组。当od
600
=0.4时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化实施例5的pgrb-sgrna-5质粒和同源重组dna片段δycgh-ptrc-ilvc，涂布到含有壮观霉素（100mg/l）和氨苄霉素（100mg/l）的2-yt琼脂平板上32℃培养12 h。对培养产生的单菌落传代后通过引物p43/p44进行pcr鉴定，pcr扩增出大小1669bp片段的为阳性转化子。
176.将阳性转化子接种于含壮观霉素（100mg/l）和终浓度至0.2% 阿拉伯糖的2-yt培养基中以消除质粒pgrb-sgrna-5，挑选在壮观霉素（100mg/l）上生长而在氨苄霉素（100mg/l）上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-yt培养基上42℃培养以消除predcas9质粒，挑选在壮观霉素（100mg/l）上不生长而在无抗的2-yt上生长的菌落，再次通过引物p37/p42进行pcr鉴定，能扩增出大小3189bp（seq id no.11）片段的为阳性子，将阳性子送测序，测序结果正确的菌株分别命名为cgmcc22721-laciz-ycgh和w3110-laciz-ycgh；重组菌cgmcc22721-laciz-ycgh和w3110-laciz-ycgh均缺失laci-lacz基因，同时过表达pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；缺失ycgh基因，同时过表达ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110）。具体地，重组菌cgmcc22721-laciz-ycgh和w3110-laciz-ycgh分别是将l-缬氨酸生产菌cgmcc22721和野生型大肠杆菌w3110基因组上laci-lacz基因部分编码区进行敲除，插入了pxylf启动子启动的dna聚合酶基因（来自大肠杆菌（escherichia coli） bl21）；同时将ycgh基因部分编码区进行敲除，插入了ptrc启动子启动的ilvc基因（来自大肠杆菌（escherichia coli）w3110），保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
177.实施例16、l-缬氨酸发酵实验。
178.将上述实施例1-15构建的菌株和缬氨酸生产菌cgmcc22721及野生型大肠杆菌w3110在blbio-5gc-4-h型号的发酵罐（上海百仑生物科技有限公司）中以图1所示的培养基和图2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如图3所示。由以上发酵结果所示，无论对于产l-缬氨酸的菌株cgmcc22721，还是模式菌株野生型大肠杆菌w3110，经过实施例1-15的改造后均有助于l-缬氨酸产量的提高。
179.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.用于生产缬氨酸的工程菌，为对受体菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括a1）；a1）包括a11）、a12）和a13）：a11）敲除所述受体菌的yjit基因，抑制所述yjit基因的表达或抑制所述yjit基因编码的蛋白质的活性；a12）增加所述受体菌中brnf基因编码蛋白质的含量或增强所述brnf基因编码蛋白质的活性；a13）增加所述受体菌中brne基因编码蛋白质的含量或增强所述brne基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为大肠杆菌（escherichia coli）。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述brnf基因与所述brne基因来源于谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）。3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述brnf基因编码序列表中seq id no.2所示的蛋白质；所述brne基因编码序列表中seq id no.3所示的蛋白质。4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述brnf基因为序列表中seq id no.1的第832-1587位所示的dna分子；所述brne基因为序列表中seq id no.1的第1584-1910位所示的dna分子。5.根据权利要求1-4中任一所述的工程菌，其特征在于：所述改造还包括a2）、a3）、a4）和a5）中的任一种、任两种或任三种：a2）包括a21）、a22）和a23）：a21）敲除所述受体菌的yjiv基因，抑制所述yjiv基因的表达或抑制所述yjiv基因编码的蛋白质的活性；a22）增加所述受体菌中ilve基因编码蛋白质的含量或增强所述ilve基因编码蛋白质的活性；a23）增加所述受体菌中ilvd基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvd基因编码蛋白质的活性；a3）包括a31）和a32）：a31）敲除所述受体菌的trpr基因，抑制所述trpr基因的表达或抑制所述trpr基因编码的蛋白质的活性；a32）增加所述受体菌中ilvh
g14d 、s17f
基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvh
g14d 、s17f
基因编码蛋白质的活性；所述ilvh
g14d 、s17f
基因由将ilvh基因中第14位甘氨酸密码子替换为天冬氨酸密码子、第17位丝氨酸密码子替换为苯丙氨酸密码子得到；a4）包括a41）、a42）和a43）：a41）敲除所述受体菌的laci基因，抑制所述laci基因的表达或抑制所述laci基因编码的蛋白质的活性；a42）敲除所述受体菌的lacz基因，抑制所述lacz基因的表达或抑制所述lacz基因编码的蛋白质的活性；a43）增加所述受体菌中dna聚合酶的含量或增强所述dna聚合酶的活性；a5）包括a51）和a52）：
a51）敲除所述受体菌的ycgh基因，抑制所述ycgh基因的表达或抑制所述ycgh基因编码的蛋白质的活性；a52）增加所述受体菌中ilvc基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvc基因编码蛋白质的活性。6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述ilve基因来源于枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）；所述ilvd基因来源于大肠杆菌（escherichia coli）；所述ilvh基因来源于大肠杆菌（escherichia coli）；所述dna聚合酶来源于大肠杆菌（escherichia coli）；所述ilvc基因来源于大肠杆菌（escherichia coli）。7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述ilve基因编码序列表中seq id no.6所示的蛋白质；所述ilvd基因编码序列表中seq id no.5所示的蛋白质；所述ilvh
g14d 、s17f
基因编码序列表中seq id no.8所示的蛋白质；所述dna聚合酶为序列表中seq id no.10所示的蛋白质；所述ilvc基因编码序列表中seq id no.12所示的蛋白质。8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述ilve基因为序列表中seq id no.4的第808-1902位所示的dna分子；所述ilvd基因为序列表中seq id no.4的第1977-3827位所示的dna分子；所述ilvh
g14d 、s17f
基因为序列表中seq id no.7的第835-1326位所示的dna分子；所述dna聚合酶的编码基因为序列表中seq id no.9的第701-3352位所示的dna分子；所述ilvc基因为序列表中seq id no.11的第794-2269位所示的dna分子。9.制备用于生产缬氨酸的工程菌的方法，包括：对受体菌进行权利要求1-4中任一所述a1）的改造，得到目的工程菌，所述受体菌为大肠杆菌（escherichia coli）。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对所述受体菌进行权利要求5-8中任一所述a2）、所述a3）、所述a4）和所述a5）这四种中的任一种、任两种或任三种的改造。11.l-缬氨酸的制备方法，包括：培养权利要求1-8中任一所述工程菌，得到l-缬氨酸。12.权利要求1-8中任一所述工程菌在生产l-缬氨酸中的应用，或在制备用于生产l-缬氨酸产品中的应用，或在制备含有l-缬氨酸的食品、饲料或药品中的应用。

技术总结
本发明公开了产L-缬氨酸工程菌及构建方法与应用。本发明发现将大肠杆菌中的yjiT基因敲除并表达brnF与brnE后，或者结合敲除yjiV基因与表达ilvE与ilvD，敲除trpR基因与表达ilvH突变蛋白，敲除lacI与lacZ基因与表达DNA聚合酶，敲除ycgH基因与表达ilvC，所得重组菌可提高L-缬氨酸产量，可用于生产L-缬氨酸，具有很好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。


技术研发人员：张英 孟刚 魏爱英 赵春光 周晓群 毕国东 杨立鹏 蔡卫卫
受保护的技术使用者：黑龙江伊品生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/8/9