用于区分鼻咽癌和鼻型NK/T细胞淋巴瘤的诊断标志物及其应用

用于区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的诊断标志物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的诊断标志物及其应用。


背景技术：

2.鼻咽癌又被称为广东癌，高发于中国的华南地区。目前，临床上主要通过鼻咽镜、影像扫描(如ct、mri等)、组织活检等方式进行鼻咽癌的诊断。但早期鼻咽癌的症状不明显且不具有特异性(如鼻涕血、喉咙疼痛、吞咽困难、头疼、耳鸣或疼痛等)，常常被患者忽视，进而导致大部分患者确诊时已经进展到晚期，极大的影响了患者的预后。因此，在高发区开展便捷、有效的早筛工作对提高鼻咽癌早诊率、改善患者预后具有非常重要的意义。
3.鼻型nk/t细胞淋巴瘤是增长迅速的一种非霍奇金淋巴瘤，常见于亚洲。这种淋巴瘤通常发生在淋巴结以外的器官或组织中，最常见的于鼻腔中，也会影响鼻窦或喉咙的上部。该病的患者最常见的首发症状是鼻塞、流涕、涕血，其次是水肿和溃疡性坏死病变，主要影响鼻腔粘膜、鼻中隔、鼻副窦和鼻咽。临床上通常采取影像学、病理活检等方式进行诊断。
4.由于鼻咽癌起源于鼻咽部，因此对于鼻咽部的无创，高效取材及相应分子标志物的检测能更为直接反应病变部位的状况，理论上能及时发现早期原发或复发的鼻咽癌患者。通过鼻咽拭子刷取鼻咽部样本是可行的技术方案，既往已经在中国华南地区，印度尼西亚，加拿大等国家或地区开展了相应研究，即利用鼻咽刷或鼻咽拭子对鼻咽部可疑部位刷取取样，随后通过对eb病毒dna载量进行q-pcr的检测，来判断是否患有鼻咽癌。由于鼻咽拭子是可以直接获取鼻咽部病变部位的样本而采用的方法，不仅具有无痛、无侵袭性的优点，而且获取的脱落细胞可以直接反映鼻咽部肿瘤的特性，因此在鼻咽癌的早筛早诊中得到广泛关注。
5.但是无论是鼻咽癌还是鼻型nk/t细胞淋巴瘤的发生发展，都与eb病毒的感染密切相关。同时由于发病部位相同，且临床表现等存在相似之处，因此仅通过鼻咽拭子取样检测eb病毒载量难以区分这两种疾病。
6.尽管致病的确切机制尚不清楚，但目前有研究发现在不同的eb病毒相关肿瘤中，eb病毒的甲基化模式存在差异，提示可以从eb病毒的甲基化角度对鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤进行鉴别诊断。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种可有效区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤、诊断鼻咽癌的生物标志物。
8.本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一方面，提供一种甲基化生物标志物组合，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段中的全部或部分cpg位点。
10.优选地，所述甲基化生物标志物包括eb病毒(nc_007605.1)bilf2基因片段上137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp、138149bp中的任意一个或多个cpg位点。
11.优选地，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段上138035bp、138059bp、138073bp和138149bp的cpg位点。
12.优选地，所述bilf2基因片段为nc_007605.1:137464-138282。
13.本发明的第二方面，提供检测本发明第一方面所述标志物甲基化水平的试剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为如下任一种；
14.(1)诊断鼻咽癌；
15.(2)区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤。
16.优选地，所述检测所述标志物甲基化水平的试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测标志物甲基化水平的试剂。
17.优选地，所述试剂包括引物、探针。
18.优选地，所述引物的序列包括：
19.甲基化上游引物：tggaagtagttacggttaagg(seq id no.1)；
20.甲基化下游引物：tcaccgcccatacaaatacta(seq id no.2)；
21.非甲基化上游引物：ttggaagtagttatggttaagg(seq id no.3)；
22.非甲基化下游引物：tcaccacccatacaaatactaa(seq id no.4)。
23.优选地，所述探针的序列包括：
24.甲基化探针：attttcgggagtgtattttcggttt(seq id no.5)；
25.非甲基化探针：tatttttgggagtgtatttttggttta(seq id no.6)。
26.优选地，所述探针的两端分别标记有荧光报告基因和荧光淬灭基因。
27.优选地，所述探针5’端标记有荧光报告基因，3’端标记有荧光淬灭基因。
28.优选地，所述荧光报告基因选自fam、hex、rox、cy5、cy3、vic中的至少一种；所述荧光淬灭基因选自bhq1、bhq2、bhq3、mgb中的至少一种。
29.优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
30.本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测本发明第一方面所述标志物的试剂。
31.优选地，所述试剂盒的功能为如下中的至少一种：
32.(1)诊断鼻咽癌；
33.(2)区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤。
34.优选地，所述检测所述标志物甲基化水平的试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测标志物甲基化水平的试剂。
35.优选地，所述试剂包括引物、探针。
36.优选地，所述引物的序列包括：
37.甲基化上游引物：tggaagtagttacggttaagg(seq id no.1)；
38.甲基化下游引物：tcaccgcccatacaaatacta(seq id no.2)；
39.非甲基化上游引物：ttggaagtagttatggttaagg(seq id no.3)；
40.非甲基化下游引物：tcaccacccatacaaatactaa(seq id no.4)。
41.优选地，所述探针的序列包括：
42.甲基化探针：attttcgggagtgtattttcggttt(seq id no.5)；
43.非甲基化探针：tatttttgggagtgtatttttggttta(seq id no.6)。
44.优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。
45.本发明的第四方面，提供一种用于诊断鼻咽癌或区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的系统，包括：
46.检测模块，用于检测样本中第一方面所述的标志物的甲基化水平；
47.分析模块：用于获取上述检测结果，根据预定规则判断诊断结果。
48.优选地，所述预定规则具体为：以截断值为界将数据分为高甲基化组和低甲基化组，通过比较所述待测样本的甲基化水平与截断值的相对大小确定所述待测样本是否为鼻咽癌，若甲基化水平大于截断值，则诊断为鼻咽癌；若甲基化水平低于截断值，则诊断为鼻型nk/t细胞淋巴瘤或非鼻咽癌。
49.优选地，所述样本选自鼻咽拭子、血浆、血清、全血、唾液、组织、细胞样品、尿液、粪便中的至少一种。
50.本发明的有益效果是：
51.本发明通过对鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的样本进行eb病毒甲基化分析，筛选出高灵敏性和特异性的甲基化位点，包括eb病毒bilf2基因片段上137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp和138149bp位点；可作为区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的诊断标志物；发明人还针对甲基化位点进行了引物、探针设计。通过roc分析发现具有非常高特异性和灵敏性，具有诊断价值，可以用于鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤或非鼻咽癌患者的区分，提高鼻咽癌的诊断效率。
附图说明
52.图1为鼻咽癌(npc)及鼻型nk/t细胞淋巴瘤(nktcl)患者的eb病毒甲基化水平。
53.图2为各鼻咽癌(npc)及鼻型nk/t细胞淋巴瘤(nktcl)患者样本中eb病毒甲基化密度分布的山峦图。
54.图3为根据eb病毒基因的甲基化密度绘制的热图。
55.图4为对cpg位点甲基化密度进行组间比较并做秩和检验后得到的两组间差异显著的cpg位点的甲基化密度绘制的热图。
56.图5为鼻咽癌(npc)及鼻型nk/t细胞淋巴瘤(nktcl)中eb病毒bilf2基因甲基化密度的组间比较结果；图5a为bilf2基因整体甲基化密度的组间比较散点图；图5b为bilf2基因上各cpg位点的甲基化密度的组间比较散点图。
57.图6为bilf2基因上差异位点的qpcr验证结果；图6a为三组间ebv载量散点图，图6b为bilf2所测区域ml水平散点图比较。
58.图7为roc曲线。
具体实施方式
59.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
60.实施例1鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的eb病毒甲基化捕获测序
61.对6例鼻咽癌(npc)及3例鼻型nk/t细胞淋巴瘤(nktcl)患者的鼻咽拭子样本进行了eb病毒甲基化捕获测序。经质控过滤后，共3,683个cpg位点在所有样本中均能捕获成功并纳入后续分析。测序结果显示：
62.(1)从eb病毒平均甲基化水平来看，两组样本都较高，但npc样本中的eb病毒甲基化水平略高于nktcl(图1)；
63.(2)从eb病毒甲基化水平分布上看(图2)，样本中绝大多数位点都处于高甲基化状态，极少部分位点处于低甲基化或未甲基化状态，npc和nktcl样本中分布相似。但npc中更多的位点处于高甲基化(山峦图表现为山峰处于甲基化密度》80％后，且山峦高而窄)；而nktcl样本中高甲基化位点相对较少(山峦图表现为山峰虽处于甲基化密度》80％后，但山峦矮而宽，且甲基化密度为0％处对应的山峰高于npc样本)。
64.(3)将捕获到的位点注释到eb病毒基因上，得到eb病毒基因的甲基化密度并绘制热图，结果提示同一肿瘤来源的样本中eb病毒甲基化模式相似，但不同肿瘤来源的样本中存在甲基化模式的差异(图3)。
65.实施例2差异位点的筛选
66.由上述结果提示，npc和nktcl的鼻咽拭子样本内的eb病毒存在甲基化差异，因此依次对捕获到的3,683个cpg位点甲基化密度进行组间比较并做秩和检验。结果显示，288个位点在组间的差异具有统计学意义(p《0.05)，其中的70个位点在两组间差异较大(两组的甲基化密度中位数差异≥50％)。大部分位点(64/70)在npc样本中高甲基化，在这些位点中，注释到bilf2基因上的位点个数最多，有11个，因此重点关注该基因上的cpg位点(图4)。
67.bilf2基因(nc_007605.1:137464-138282)全长819bp，正义链上共包含27个cpg位点，在本次捕获测序中均成功捕获。基于该基因的整体甲基化密度而言，npc远远高于nktcl；对每个位点进行组间比较的结果显示，该基因的后10个相邻的cpg位点在两组间的差异十分显著(包含137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp、138149bp上的位点)(图5)。
68.实施例3显著差异位点的qpcr验证
69.使用63例npc、9例nktcl患者和50例非鼻咽癌对照的鼻咽拭子样本，对bilf2基因中的138035bp、138059bp、138073bp和138149bp这4个cpg位点所在区域进行qpcr检测，引物探针、pcr反应体系及条件如下：
70.引物探针序列：
71.甲基化上游引物：tggaagtagttacggttaagg(seq id no.1)；
72.甲基化下游引物：tcaccgcccatacaaatacta(seq id no.2)；
73.非甲基化上游引物：ttggaagtagttatggttaagg(seq id no.3)；
74.非甲基化下游引物：tcaccacccatacaaatactaa(seq id no.4)；
75.甲基化探针：fam-attttcgggagtgtattttcggttt-bhq1(seq id no.5)；
76.非甲基化探针：hex-tatttttgggagtgtatttttggttta-bhq1(seq id no.6)。
77.扩增反应体系：
78.每个样本分别进行甲基化和非甲基化扩增反应，每个扩增反应体系为20μl，甲基化扩增反应体系包含：10μl qpcr mixture，0.75μl甲基化上游引物，0.75μl甲基化下游引物，0.8μl甲基化taqman探针，6.7μl ddh2o以及1μl经亚硫酸氢盐转化的dna；非甲基化扩增反应体系包含：10μl qpcr mixture，0.75μl非甲基化上游引物，0.75μl非甲基化下游引物，0.8μl非甲基化taqman探针，6.7μl ddh2o以及1μl经亚硫酸氢盐转化的dna。
79.扩增反应条件：
80.95℃预变性5分钟，1个循环；变性95℃15秒，58℃退火延伸60秒，45个循环；40℃冷却30秒。
81.qpcr完成后，计算针对cpg位点的相对甲基化程度(methylation level，ml)，ml值的计算公式为：-(ct
m-ctu)。ctm为甲基化扩增体系中该位点扩增之后的ct值，ctu为非甲基化扩增体系中该位点扩增之后的ct值。如果该样本完成qpcr后，只检测到其中一个ct值，则另一个ct值定义为45代入计算公式计算相对甲基化程度。如果该样本qpcr完成后，两个ct值都没有检测到，则定义该样本检测失败。
82.检测结果如图6所示：图6a为三组间ebv载量散点图，图6b为bilf2所测区域ml水平散点图比较；
83.2例nktcl、4例npc以及30例对照样本因ebv载量低而检测失败，剩余7例nktcl、59例npc和20例对照样本的检测结果显示，大部分(6/7)nktcl患者样本中只能检测到非甲基化产物，而大部分(50/59)npc患者样本中只能检测到甲基化产物；其中nktcl组ml均值为-5.39，而npc组ml均值为15.08，组间差异显著且具有统计学意义(表1)。
84.表1
[0085][0086]
实施例4构建区分模型
[0087]
以qpcr得到的ml作为模型指标进行组间的区分，绘制roc曲线并计算曲线下面积(auc)，并与ebv载量构建的区分模型进行比较。结果显示，以ml为指标的npc与nktcl区分模型auc达0.965；当以roc分析得到的最佳截断值作为截断值(cov＝7.27)时，模型灵敏度、特异度分别为0.810和1.000(图7和表2)；而以ebv载量构建的区分模型auc为0.765，灵敏度及特异度分别为0.508和1.000。在npc的诊断应用中，以ml为指标的诊断模型auc为0.935，灵敏度为0.810，特异度为0.966；以ebv载量为指标的诊断模型auc为0.909，灵敏度为0.810，特异度为0.932。以上结果提示，bilf2 ml指标能有效区分npc和nktcl，且优于ebv载量指标；在npc与非鼻咽癌对照区分诊断上，也优于ebv载量诊断模型。
[0088]
表2
[0089][0090][0091]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种甲基化生物标志物组合，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段中的全部或部分cpg位点。2.根据权利要求1所述的甲基化生物标志物组合，其特征在于，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段上137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp、138149bp中的任意一个或多个cpg位点，所述eb病毒基因组为nc_007605.1；优选地，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段上138035bp、138059bp、138073bp和138149bp的cpg位点。3.检测权利要求1～2任一项所述标志物甲基化水平的试剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为如下任一种；(1)诊断鼻咽癌；(2)区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测标志物甲基化水平的试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测标志物甲基化水平的试剂。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物、探针；优选地，所述引物的序列包括：甲基化上游引物：tggaagtagttacggttaagg(seq id no.1)；甲基化下游引物：tcaccgcccatacaaatacta(seq id no.2)；非甲基化上游引物：ttggaagtagttatggttaagg(seq id no.3)；非甲基化下游引物：tcaccacccatacaaatactaa(seq id no.4)；优选地，所述探针的序列包括：甲基化探针：attttcgggagtgtattttcggttt(seq id no.5)；非甲基化探针：tatttttgggagtgtatttttggttta(seq id no.6)。6.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。7.一种产品，所述产品权利要求3～6任一项所述的试剂；优选地，所述试剂盒的功能为如下中的至少一种：(1)诊断鼻咽癌；(2)区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤。8.一种用于诊断鼻咽癌或区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的系统，包括：检测模块，用于检测样本中权利要求1～2任一项所述标志物的甲基化水平；分析模块：用于获取上述检测结果，根据预定规则判断诊断结果。9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述预定规则具体为：若甲基化水平大于截断值，则诊断为鼻咽癌；若甲基化水平低于截断值，则诊断为鼻型nk/t细胞淋巴瘤或非鼻咽癌。10.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述样本选自鼻咽拭子，血浆、血清、全血、唾液、组织、细胞样品、尿液、粪便中的至少一种。

技术总结
本发明公开了一种用于区分鼻咽癌和鼻型NK/T细胞淋巴瘤的诊断标志物及其应用；所述生物标志物包括EB病毒BILF2基因片段中137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp、138149bp中的任意一个或多个CpG位点，还针对甲基化位点进行了特异性的设计了引物、探针；通过ROC分析发现具有非常高特异性和敏感性，具有诊断价值，可以用于鼻咽癌和鼻型NK/T细胞淋巴瘤或非鼻咽癌患者的区分，提高鼻咽癌的诊断效率。咽癌的诊断效率。咽癌的诊断效率。


技术研发人员：贾卫华 郑小辉 唐曹丽
受保护的技术使用者：中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所)
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/9