一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法

1.本发明涉及微藻养殖技术领域，具体涉及一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法。


背景技术：

2.近年来，随着环保要求的不断提高，对于低碳节能的生物固碳技术需求更为迫切。微藻固碳是二氧化碳生物捕集技术极其重要的一种方式。微藻通过光合作用，固定自然界中的二氧化碳和无机碳酸盐，其固碳效率比陆生植物高10-50倍，具有高效的光合固碳能力，被认为是一种有潜力的生物技术用于减少二氧化碳的排放。随着微藻固碳技术的不断研究和应用，其在碳减排领域的潜力日益凸显，有望成为未来减缓气候变化的重要手段之一。
3.蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)是一种率属于小球藻属(chlorella)，绿藻门(chlorophyta)的绿藻，是一种生长在池塘、湖泊、海洋等地方的浅水港湾中微型单细胞(3-8μm)藻类。蛋白核小球藻的细胞直径通常在2-10μm之间，呈球形或卵圆形，细胞内含有单个细胞核和一个色素体，细胞壁通常比较厚，细胞壁呈透明状。蛋白核小球藻能通过自养方式，高效地利用太阳能进行光合作用，同时固定二氧化碳。由于其含有丰富的蛋白质、脂质等，具有丰富的营养价值，所以蛋白核小球藻也是一种重要的生物燃料来源，可以通过其生产的生物质进行生物燃料制备。此外，蛋白核小球藻因其高含量的蛋白质和氮素还可以用作饲料和肥料。它们以其高效的光合作用和快速生长速度而闻名，在二氧化碳固碳、食品、饲料、医药和能源等领域具有广泛的应用前景。
4.传统的蛋白核小球藻的规模化培养大多是以悬浮培养方式在开放式的池塘中进行。这些池塘很容易建造，不需要特别控制一些参数，如照明和温度。然而，在开放池塘中，蛋白核小球藻的生物量产出效率很低。作为技术改进，蛋白核小球藻的另一种培养方式是采用各种封闭的光生物反应器(prb)，包括垂直柱、平板状、管状、柱状和塑料袋等，这些培养系统对养分、光照和温度有更好的控制，与开放池塘相比，能够提升一定的培养密度和生物量。但常规的光生物反应器仍无法满足微藻高生物量和高品质的要求，主要存在以下问题：(1)光照不均匀：常规的光生物反应器采用的是单向光照，因此光线无法均匀地照射到微藻的各个部位，导致微藻生长不均匀，影响微藻的生物量和品质；(2)氧气浓度过高：微藻的光合作用产生氧气，如果反应器内的氧气浓度过高，会对微藻生长产生负面影响，甚至导致微藻死亡；(3)碳源和营养条件不足：微藻的生长需要足够的碳源、氮源和磷源，而常规的光生物反应器中，碳源、氮源和磷源往往是有限的，导致微藻生长缓慢；此外，光生物反应器系统的建设成本高，系统维护困难，这些缺点限制了pbr规模化生产的实际应用。
5.近年来，学者们发现了一种新的微藻生物膜培养系统，利用基质上的生物膜进行生长，即附着培养。在相同的气候和光照条件下，附着培养模式下的产量比传统开放池塘模式下的生物质产量高出数倍。除了高生物量产出外，附着培养还降低了收获成本，减少电力消耗，能够固定更多的二氧化碳。然而，现有的微藻附着培养体系存在以下缺陷：(1)研究更
多的关注光生物反应器的结构、培养模式等，对微藻的高生物量产出研究较少；(2)目前的微藻附着培养周期较长，产藻负荷低，且鲜有关于蛋白核小球藻附着培养产出高生物量的相关研究报道；(3)现有的附着培养体系忽略了培养过程中能质传递受限、微藻叶绿素光电子捕获和叶绿体中光系统的关键性酶利用等问题的探究。研究表明，提高光渗透利用效率、提高光合作用关键性酶活性能够大幅提升微藻生物量产出。同时，在这个过程中需要克服载体材质、营养元素、曝气量、光暗比和其他相关因素(如ph值、温度等)对系统的影响，这样才能有效提升附着培养的高生物量产出。因此，改进培养系统以提高生物量产出，降低其生产成本非常关键。
6.综上，现有的蛋白核小球藻养殖技术存在生长周期长、容易受到外界环境因素的影响、养殖成本高等一系列问题，从而限制了其产量和品质的提高，无法实现产业化应用。因此，急需研究和开发更为优异的微藻养殖技术，提高其生物质产出量和品质尤为重要。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法。
8.本发明的目的通过以下技术方案实现：提供一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，包括以下步骤：步骤a、选择光生物反应器中适合蛋白核小球藻高生物量养殖的堆积球载体将若干个堆积球载体放入光生物反应器中，并形成三维空间立体排布的堆叠方式，所述堆积球载体包括球体骨架和填充于所述球体骨架内的填充载体，所述球体骨架由丙烯通过加聚反应而成的聚合物聚丙烯材料制成，所述填充载体由聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝制成；步骤b、制备适合蛋白核小球藻高生物量生长的营养液体系所述营养液体系为培养液和缓冲溶液的组合，其中每升培养液由以下成分组成：7.5g nano3、0.375g mgso47h2o、0.18g cacl22h2o、0.03g柠檬酸、0.03g柠檬酸铁铵、0.05g edta、0.1g na2co3、0.0143g h3bo3、0.00905g mncl2、0.00111g znso4、0.000395g cuso4、0.00195g钼酸钠、0.000245g硝酸钴和余量的纯净水；所述缓冲溶液为0.2～1.0mol/l的kh2po
4-k2hpo4缓冲溶液；将配置好的培养液和缓冲溶液进行高压灭菌后，冷却备用；步骤c、蛋白核小球藻的扩大培养c1)采用bg11培养基进行悬浮培养：将蛋白核小球藻和bg11培养基按体积比1:15混合置于锥形瓶中并放置培养箱，在温度为24～26℃、光照强度为5000lux、曝气量为2l/min、光暗比为16:8h的条件下培养21d，完成第一轮扩培；c2)将第一轮扩培的藻液按照上述步骤c1的条件继续进行多轮扩大培养，直至获得5～8g/l高浓度活性好的蛋白核小球藻藻液；期间每天早中晚进行3次摇瓶，促进培养液与蛋白核小球藻的有效接触，防止蛋白核小球藻沉淀而影响生长；步骤d、蛋白核小球藻的附着培养d1)将步骤a经过灭菌的填充载体填充至堆积球载体内，然后将步骤c的蛋白核小球藻藻液总体积的15％接种至光生物反应器内的填充载体上，分别加入步骤b的培养液和h2po
4-k2hpo4缓冲溶液，形成适合蛋白核小球藻生长的营养液体系，并调节ph为7.1～8.2；
将光生物反应器放置培养箱内进行培养，温度为24～26℃；d2)设置光生物反应器的光暗比为16h:8h～20h:4h，确保蛋白核小球藻有足够的光照时间；d3)设置光生物反应器的曝气量为1～5l/min，所有气体在接触藻液之前，都要先通过气体过滤膜，以防藻细胞发生感染。
9.上述技术方案中，步骤d2中，所述光暗比为18h:6h。
10.上述技术方案中，步骤d3中，所述曝气量为3l/min，所述气体过滤膜的孔径为0.45μm。
11.上述技术方案中，步骤a中，设置堆积球载体的堆积密度即填充载体占整个生物反应器的体积比为75％～85％。
12.上述技术方案中，步骤a中，所述堆积球载体的直径为14～16cm。
13.上述技术方案中，步骤a中，所述填充载体由若干长度为7～9cm的条状聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝交错分布而成，所述填充载体的表面包裹一层具有生物亲和力的微生物固着层。聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝互相接触连接，堆积球载体之间形成彼此连通的三维通道孔隙，增加了微藻的附着固定面积，为微藻生长提供了更多的附着繁殖空间。
14.本发明构思和原理分析如下：对于现有的光生物反应器来说，堆积球载体设置的难点在于光线的透光率高、适合蛋白核小球藻生物学特性的堆积球载体的选择、以及与之配套的反应营养液体系和反应器内其他环境条件的优化。实验过程中，发明人首先根据蛋白核小球藻的生长特性，选择适合其生长的堆积球载体，分别从亲水性、生物亲和性、牢固性、成本等多个角度考虑，确定了具有大比表面积、亲水性能优异的聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝材料作为填充载体。该聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝填充载体的表面特性对藻类的附着有着决定性的影响。其原理是：1)聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝表面存在一些羟基、羧基等亲水性官能团，一方面亲水性官能团吸附周围水分子，形成水膜，使藻类在载体表面的接触角度变小，从而增强了附着的黏附力；另一方面，亲水性官能团能够吸附藻类表面的负电荷官能团，如羧基、磷酸基等，形成静电吸引力，进一步促进藻类的附着；2)由于聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的大比表面积(1.1404m2/g)对气泡具有更强的重新分布能力，同时聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的水分度和接触角为20～50
°
，随着其亲水性的进一步增加，接触性变好，为微藻与填充载体之间的接触提供了有利的内环境，从而促进微藻在聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝填充载体表面的积累。
15.进一步，本发明通过设置堆积球载体的堆积密度75％～85％，即填充载体占整个生物反应器的体积比为75％～85％，形成三维空间立体排布的堆叠方式，充分增大有效光的穿透性，进而提高填充载体上蛋白核小球藻的生长速度和高生物量产出。
16.以上确定了合适的堆积球载体及其堆积密度后，还需要与之配套的营养液体系和反应器内的环境条件，才能真正带来微藻的高生物量产出。然而，在培养过程中申请人发现，随着蛋白核小球藻在堆积球载体内快速生长的同时，原有常规使用的bg11培养基，其氮和磷元素在一天内几乎被消耗完，体系中的营养元素消耗速率太快，因此必须重新选择适合当下的堆积球载体的营养液，以提供充足的营养物质；此外，申请人还发现，由于高生物量快速产出的蛋白核小球藻自身的分泌物中可能含有碱性胞外物质，或者是生物利用过程中释放了碱性物质，使体系ph急剧升高到11左右，导致了体系ph的崩溃，严重破坏了反应器
体系的平衡，不利于微藻的生长。故，结合以上选择的堆积球载体及堆积密度后所出现的新的技术难题，申请人通过大量实验，最终改良了培养液，并引入了0.2～1mol/l的kh2po
4-k2hpo4磷酸盐缓冲对，从而形成了新的适应于当下光生物反应器的营养液体系，最终实现了既能够提供蛋白核小球藻快速生长所需的充足营养物质又能够维持整个反应器体系的酸碱平衡稳定性。
17.综上，与现有技术相比，本发明具有以下优点：1.本发明根据蛋白核小球藻的生长特性，选择适合于光生物反应器内微藻生长速度快、生物量产出高的堆积球载体，即具有大比表面积、亲水性优异的聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝材料作为填充载体，由于聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的大比表面积对气泡具有更强的重新分布能力，同时为微藻与载体之间的接触提供了有利的内环境，从而促进了微藻在聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝载体表面的积累；另一方面通过优化堆积球载体的堆积密度，形成三维空间立体排布的堆叠方式，充分增大有效光的穿透性，进而提高填充载体上蛋白核小球藻的生长速度和高生物量产出；2.当确定了合适的堆积球载体和堆积密度后，本发明发现并解决了常规bg11培养基反应体系无法满足改良后高生物量产出的堆积球载体内蛋白核小球藻的生长需求，因此通过改良培养液配方并加入了0.2～1.0mol/l的kh2po
4-k2hpo4磷酸盐缓冲溶液，从而构建了新的适应于当下光生物反应器的营养液体系以及稳定的ph 7.1～8.2，最终实现了既能够提供蛋白核小球藻快速生长所需的充足营养物质又能够维持整个反应器体系的酸碱平衡稳定性，进而实现高品质蛋白的生产；3.本发明进一步通过精准控制光生物反应器内的光暗比、光照强度、曝气量、ph值、温度等环境条件，促进蛋白核小球藻的光合作用和呼吸作用，通过以上协同作用，最大限度地提高蛋白核小球藻的产量和品质，相比现有技术悬浮培养方式，本发明的蛋白核小球藻的生物量提升了800～1000倍，效果非常显著。
18.4.由于本发明养殖方法所培育的蛋白核小球藻的生物质产量远超传统悬浮培养，而更多的蛋白核小球藻产出使得光生物反应器可以耐受更高的二氧化碳浓度，即从二氧化碳的吸收效果上看，本发明的蛋白核小球藻在通入不同二氧化碳浓度的模拟烟气时，其最大固碳速率在一天内达到21.59g/l，而悬浮培养方式的固碳速率则低于1g/l。因此，本发明的蛋白核小球藻因其高效固碳的特点，可应用于电厂烟气的处理，实现微藻固碳技术在环保等领域的产业化应用。
19.5.本发明的养殖方法简单易行，大大缩短了培养周期，降低了成本，并且无需复杂的设备和技术，具有非常好的产业化应用前景。
附图说明
20.利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
21.图1为本发明的含有堆积球载体的光生物反应器的结构示意图。
22.图2为本发明的堆积球载体的结构示意图。
23.图3为本发明的光生物反应器在0h、3h、6h、12h、18h和24h附着培养下蛋白核小球
藻的sem电镜图。
24.图4为实施例1以及对比例1和2的蛋白核小球藻的生物量产出曲线图。
25.图5为对比例2～4的蛋白核小球藻在(a)75％、(b)80％和(c)85％堆积密度下的生物量产出变化图。
26.图6为对比例2～4的蛋白核小球藻在不同堆积密度下的(a)ph值、(b)硝氮含量和(c)总磷含量消耗速率图。
27.图7为实施例2、4以及对比例5的蛋白核小球藻在不同磷酸盐缓冲液缓冲体系下的生物量变化图。
28.图8为对比例2～4的蛋白核小球藻在不同堆积密度下的(a)ph值、(b)硝氮含量和(c)总磷含量消耗速率图。
29.图9为实施例5～10的蛋白核小球藻在不同曝气量下的生物量变化图。
30.图10为实施例8、11和12的蛋白核小球藻在不同光暗比下的生物量变化图。
31.图11为实施例1和对比例1的蛋白核小球藻的蛋白质、脂质、多糖和叶绿素含量变化图。
32.图12为实验例1～3、实施例11和对比例1的蛋白核小球藻的生物量产出曲线图。
33.图13为实验例1～3、实施例11和对比例1的蛋白核小球藻的二氧化碳固碳率的曲线图。
34.附图标记：反应器1、曝气装置2、led灯带3；堆积球载体4、球体骨架41、填充载体42。
具体实施方式
35.结合以下实施例及附图对本发明作进一步描述。
36.1、实验材料(1)蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)以下所有实施例、对比例和实验例使用的藻种为蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)，藻种编号为fachb-9，购买自中国科学院水生生物研究所。该藻为单细胞，球形，壁薄，直径3～5μm，生殖个体直径有时可达23μm，其色素体呈杯状，几乎充满整个细胞，具有一个形成大量彼此连通的三维通道的孔隙明显的蛋白核。为了进行实验，蛋白核小球藻需要进行保藏。
37.(2)悬浮培养用培养基bg11培养基，购自海博生物科技有限公司。
38.2、实验装置如图1所示，以下实施例中采用的光生物反应器主要由圆柱形的反应器1、照明装置、设置于反应器1内的曝气装置2和若干个堆积球载体4组成。圆柱形的反应器1由聚乙烯材料制成，上直径为20.2cm，下直径为21cm，高为18.4cm，用于实现微藻细胞的培养，有效容积为5.0l。反应器1外围缠绕着一根5m长的led灯带3，光源位于反应器1四周，并通过反应器1四围设置的光透过外壁向反应器1内照射，提供光能以促进蛋白核小球藻的光合作用，保证光源的输出为5000lux。在反应器1底部安装曝气装置2，曝气装置2由空气鼓风机提供空
气，空气经风机打入反应器1，输入反应器1中的空气形成微小的气泡以供装置提供碳源，由玻璃转子流量计控制曝气量。
39.与现有技术不同的是，如图2所示，本发明的堆积球载体4包括球体骨架41和填充于球体骨架41内的填充载体42，球体骨架41由丙烯通过加聚反应而成的聚合物聚丙烯材料制成，填充载体42由聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝制成，填充载体42的表面包裹一层具有生物亲和力的微生物固着层。具体的，堆积球载体4的直径为14～16cm；填充载体42由若干长度为7～9cm的条状聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝交错分布而成。
40.实施例1：一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，包括以下步骤：步骤a、选择光生物反应器中适合蛋白核小球藻高生物量养殖的堆积球载体将若干个堆积球载体放入上述光生物反应器中，并形成三维空间立体排布的堆叠方式，堆积球载体之间形成彼此连通的三维通道孔隙，增加了微藻的附着固定面积，为微藻生长提供了更多的附着繁殖空间。
41.具体的，堆积球载体的直径为14～16cm；填充载体由若干长度为7～9cm的条状聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝交错分布而成，并且设置堆积球载体的堆积密度为75％，充分增大有效光的穿透性，进而提高填充载体上蛋白核小球藻的生长速度和高生物量产出。
42.步骤b、制备适合蛋白核小球藻高生物量生长的营养液体系营养液体系为培养液和缓冲溶液的组合，其中每升培养液由以下成分组成：7.5g nano3、0.375g mgso47h2o、0.18g cacl22h2o、0.03g柠檬酸、0.03g柠檬酸铁铵、0.05g edta、0.1g na2co3、0.0143g h3bo3、0.00905g mncl2、0.00111g znso4、0.000395gcuso4、0.00195g钼酸钠、0.000245g硝酸钴和余量的纯净水；缓冲溶液为每升培养液中加入87.33ml 0.2mol/l的kh2po
4-k2hpo4缓冲溶液；将配置好的培养液和缓冲溶液进行高压灭菌后，冷却备用。
43.步骤c、蛋白核小球藻的扩大培养c1)采用bg11培养基进行悬浮培养：将蛋白核小球藻和bg11培养基按体积比1:15混合置于锥形瓶中并放置培养箱，在温度为24～26℃、光照强度为5000lux、曝气量为2l/min、光暗比为16:8h的条件下培养21d，完成第一轮扩培；c2)将第一轮扩培的藻液按照上述步骤c1的条件继续进行多轮扩大培养，直至获得5～8g/l高浓度活性好的蛋白核小球藻藻液；期间每天早中晚进行3次摇瓶，促进培养液与蛋白核小球藻的有效接触，防止蛋白核小球藻沉淀而影响生长；步骤d、蛋白核小球藻的附着培养d1)将步骤a经过灭菌的填充载体填充至堆积球载体内，然后将步骤c的蛋白核小球藻藻液总体积的15％接种至填充载体上，分别加入步骤b的培养液和h2po
4-k2hpo4缓冲溶液，形成适合蛋白核小球藻生长的营养液体系，然后测定ph，确保体系ph保持在7.1～8.2；d2)设置光生物反应器的光暗比为16h:8h，确保蛋白核小球藻有足够的光照时间；d3)设置光生物反应器的曝气量为2l/min，所有气体在接触藻液之前，都要先通过孔径为0.45μm的气体过滤膜，以防藻细胞发生感染。
44.实施例2：
本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例1的相同，不同之处在于：步骤a中，设置堆积球载体的堆积密度为80％。
45.实施例3：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例1的相同，不同之处在于：步骤a中，设置堆积球载体的堆积密度为85％。
46.实施例4：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤b中，缓冲溶液为1.0mol/l的kh2po
4-k2hpo4缓冲溶液。
47.实施例5：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤d3中，设置光生物反应器的曝气量为0.5l/min。
48.实施例6：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤d3中，设置光生物反应器的曝气量为1l/min。
49.实施例7：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤d3中，设置光生物反应器的曝气量为2l/min。
50.实施例8：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤d3中，设置光生物反应器的曝气量为3l/min。
51.实施例9：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤d3中，设置光生物反应器的曝气量为4l/min。
52.实施例10：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例2的相同，不同之处在于：步骤d3中，设置光生物反应器的曝气量为5l/min。
53.实施例11：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例8的相同，不同之处在于：步骤d2中，设置光生物反应器的光暗比为18h:6h。
54.实施例12：本实施例的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其主要技术方案与实施例8的相同，不同之处在于：步骤d2中，设置光生物反应器的光暗比为20h:4h。
55.对比例1：蛋白核小球藻采用bg11培养基进行悬浮培养：将蛋白核小球藻和bg11培养基按体积比1:15混合置于锥形瓶中并放置培养箱，在温度为24～26℃、光照强度为5000lux、光暗比为16h:8h，曝气量为2l/min的条件下培养21d。
56.对比例2：
对比例2的主要技术方案与实施例2相同，不同之处在于：对比例2的方法中未采用步骤b的营养液体系(去掉步骤b)，即步骤d1的蛋白核小球藻的附着培养过程中，仍然采用常规的bg11培养基作为微藻的营养液。
57.对比例3：对比例3与对比例2基本相同，不同之处在于：设置堆积球载体的堆积密度为80％。
58.对比例4：对比例4与对比例2基本相同，不同之处在于：设置堆积球载体的堆积密度为85％。
59.对比例5：对比例5与实施例2基本相同，不同之处在于：步骤b中，缓冲溶液为0.05mol/l的kh2po
4-k2hpo4缓冲溶液。
60.蛋白核小球藻的性能检测：本实验中，蛋白核小球藻的生物量产量在6～8天达到峰值，因此确定蛋白核小球藻的培养周期为7天。在培养周期中，定期进行藻液样品的取样和分析，将采样时间固定在每天的早上9:00，用取样器抽取10ml悬浮藻液，再向反应器中补充10ml营养液浓缩液。载体上的微藻湿生物量采用超声震荡的方法剥离下来，再采用抽滤后称重的方法计算湿生物量。测定包括营养液消耗速率、微藻生物量、叶绿素含量、硝酸盐、磷酸盐等指标，以评估不同培养条件下蛋白核小球藻的生长和代谢特性。同时，寻求藻类生产的最佳条件，进一步提高蛋白核小球藻的生长速率和产量。
61.1、蛋白核小球藻生物量的检测微藻培养过程中每天早上9:00定时取样，在第一天需进行多次采样，取样时间分别为9:00，12:00，15:00，18:00，21:00，24：00。取样后要尽快进行抽滤称重处理，湿生物量分为悬浮培养和堆积球载体培养两部分。堆积球载体上的生物量采用超声震荡的方法剥离下来后，采用离心机6000r/min离心6min处理，处理后按照下列公式计算湿生物量产量：2、营养消耗速率测定本实验中采取的－n、tp、do、ph、浊度含量测试方法参照书目《水和废水分析监测方法》(第四版)，具体监测方法如表1所示。
62.表1.分析项目及其分析方法
3、藻类生物品质的测定3.1蛋白质含量测试方法样品前处理：采用双缩脲法检测藻细胞内蛋白质含量。取0.1g藻粉，加入4ml pbs缓冲溶液，在冰水中连续冻融破碎3次，每次30min，在6000r/min下离心6min，将上清液收集好，用去离子水洗涤微藻细胞3次，使其充分溶胀，余下的藻渣按上述步骤重复2-3次，合并上清液，定容。
63.蛋白质含量的测定：采用双缩脲法测定微藻中蛋白质含量。将已经溶胀的1ml微藻细胞样品加入4ml10％三氯乙酸(tca)浓度的缩脲试剂中，使其在低温下沉淀沉淀蛋白质，沉淀过程中不断搅拌。沉淀完成后，用酒精洗涤沉淀，并干燥至恒重。最后加入2ml naoh(1mol/l)并充分混合，测定其595nm处的吸光度值(od值)。
64.标准曲线的制备：用已知浓度的蛋白质标准品制备一系列浓度的标准溶液，将其与双缩脲试剂混合后，按照上述方法测定吸光度值，制备标准曲线，根据标准曲线计算蛋白质含量。具体的计算公式如下：3.2多糖含量测c(mg/ml)＝19.23od
540
+0.05(r2＝0.999)试方法微藻样品处理：将微藻藻液离心收集，去除上清液，用去离子水洗涤微藻细胞3次，使其充分溶胀，然后将其充分溶解，并用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量。
65.多糖含量的测定：采用蒽酮-硫酸比色法测定微藻中多糖含量。将微藻样品加入80％硫酸中，并在室温下静置10分钟，然后加入0.2％蒽酮溶液，混合均匀。将混合液加热至100℃，保持10分钟，然后放冷至室温。最后将反应液的吸光度值在490nm处测定。
66.标准曲线的制备：用已知浓度的多糖标准品制备一系列浓度的标准溶液，将其与蒽酮-硫酸试剂混合后，按照上述方法测定吸光度值，制备标准曲线。具体的计算公式如下所示：c(mg/ml)＝1.11
×
od
620-0.012(r2＝0.999)3.3脂质含量测试方法微藻样品处理：取0.1g藻粉，然后用氯仿-甲醇-水(1：2：0.8，v/v)混合溶液6ml后，搅拌30min提取藻类中的脂质，6000r/min离心6min，弃上清液，取有机相，余下藻渣重复上述步骤2-3次，合并有机相，在真空干燥中干燥至恒重。
67.脂质含量的测定：取适量提取液加入0.1％次甲基蓝(mbth)和v/v 4％硫酸(h2so4)溶液，混合均匀后，在100℃的水浴中加热15分钟。加热后立即冷却到室温并加入0.1％ mbth溶液，混合均匀后，用紫外分光光度计测定样品在λ＝610nm处的吸光度。
68.标准曲线的制备：用已知浓度的三十四酸甘油酯(tag)标准品制备一系列浓度的标准溶液，将其与mbth和h2so4溶液混合后，按照上述方法测定吸光度值，制备标准曲线。
69.3.4叶绿素含量测试方法微藻样品处理：将微藻细胞离心收集，去除上清液，用去离子水洗涤微藻细胞3次，然后用酒精提取叶绿素。
70.叶绿素的提取：取藻粉20g，用95％乙醇溶液(5ml/g)在黑暗中超声提取叶绿素，超声时间约为5分钟，提取液温度控制在4℃左右。提取液离心沉淀后，将上清液取出，使用分光光度计测量其吸光度值在663和645nm处。
71.标准曲线的制备：用已知浓度的叶绿素标准品制备一系列浓度的标准溶液，将其与95乙醇溶液混合后，按照上述方法测定吸光度值，制备标准曲线。
72.ca＝12.21a
663-2.81a
645
cb＝20.13a
645-5.03a
663
公式中ca、cb分别表示叶绿素a、叶绿素b的质量浓度。
73.1.微藻二氧化碳固碳率一般认为微藻细胞中碳含量占据50％，因此生成1kg的微藻则会固定1.83kg的二氧化碳，这是当前应用最多的一种快速简单的估算方法，计算公式如下所示：式中：rco2表示二氧化碳固碳率；μ
l
表示微藻的干生物质产量(g/l)；表示二氧化碳的摩尔质量，44g/mol；mc表示c的摩尔质量，12g/mol；cc表示微藻细胞的平均碳含量(％，w/w)，每个微藻细胞单重为0.507g。
74.实验结果：1、堆积球载体(聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝填充载体)及其堆积密度对蛋白核小球藻生长的影响(1)堆积球载体的影响首先，如图4所示，分别为实施例1和对比例2的蛋白核小球藻在含有堆积球载体的生物光反应器中的生物量产出以及对比例1的蛋白核小球藻在悬浮培养过程中的生物量产出曲线图，图中看到实施例1和对比例2采用堆积球载体培养的蛋白核小球藻的生物量产量在6～8天达到峰值，而对比例1的蛋白核小球藻则缓慢生长，并且在0-7天内的生物量只有0.3-3g/l。因此，本实验中确定蛋白核小球藻的培养周期为7天。为了进一步验证堆积球载体以及培养液体系对对蛋白核小球藻生长的影响，以下对比实验中选择对培养7天的蛋白核小球藻的生物量进行检测。
75.分别检测实施例1至4以及对比例1至5的蛋白核小球藻的生物量，结果如表2所示。
76.表2.实施例1至4以及对比例1至5的蛋白核小球藻的生物量
新的培养液1是指相对于常规培养微藻所用的bg11培养基，营养液体系中更换了新的培养液由表2可知，对比例1采用的是传统的悬浮培养，培养液采用的是常规用于微藻的bg11培养基，蛋白核小球藻培养7天后的生物量为0.2g/l；当采用本发明的堆积球载体进行附着培养时，但营养液体系中依然采用对比例1的bg11培养基，即对比例2～4分别在不同的堆积密度下，蛋白核小球藻培养7天后的生物量达到了60g/l以上，是对比例1悬浮培养的120倍以上，这说明，聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝为微藻细胞的生长提供了更充足的附着位点，并且聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的强亲水性进一步促进了蛋白核小球藻在光生物反应器中的生物量生产。
77.分析其原理是：蛋白核小球藻高生物量附着培养分为两个阶段，第一阶段是悬浮微藻细胞在初期开始附着在聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的过程，这个过程的主要限制性因素为载体的亲水性。聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的水分度和接触角为23.50
°
(将＜60
°
的接触角称为亲水接触角，＞60
°
的接触角称为疏水接触角)，从而更有利于微藻细胞与聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝的附着，这个过程改善了系统培养的微环境，影响了细胞的生长与代谢；第二阶段是微藻通过粘附、包捕、封闭等方式在涤纶填充载体上快速生长阶段，这一阶段随着涤纶填充载体表面亲水性的增加，细胞与载体表面之间的范德华力不断增强，随着培养周期的增加，范德华力的增强进一步促进了蛋白核小球藻在涤纶载体的附着。
78.如图3所示，蛋白核小球藻的sem图像显示，在培养初期，聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝上的蛋白核小球藻分布少，且体积较小。随着培养周期的增加，蛋白核小球藻不断生长，聚集后附着在聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝上，体积增大。总的来说，聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝因其比表面积大，亲水性好等特性，有利于蛋白核小球藻的附着生长，进而大大提高系统的生物质产量。
79.1.堆积球载体的堆积密度的影响将堆积球载体中每平方米的填充载体的重量称为载体量，单位是g/m2。在本实施例1至3以及对比例2至4中，分别将堆积密度设置为75％、80％、85％三个水平，对应的载体量分别为878.6g/m2、1114.2g/m2和1494.7g/m2。不同堆积密度下反应器中悬浮培养的浊度也是影响透光性的重要因素。
80.如表2以及图5a、5b、5c所示，将对比例1的悬浮培养作为对照组，采用本发明的堆积球载体进行附着培养时，对比例2～4的蛋白核小球藻的湿生物量在75％、80％和85％堆积密度下都呈现先升高后降低的趋势，生物量产出分别为60.34g/l、67.52g/l和64.56g/l。蛋白核小球藻在75％、80％和85％堆积密度下的最大湿生物量产量排序为：80％＞85％＞75％。这说明当堆积密度从75％增大到80％时，载体量的增加有助于蛋白核小球藻生物密度和光吸收效率的提高。然而，当堆积密度从80％增大到85％时，蛋白核小球藻生物质产量却下降，这可能是因为过于密集的堆积球，导致相对较低的光穿透率，从而导致了蛋白核小球藻细胞的老化。由此确定，培养状况最好的载体密度是80％。
81.2、光生物反应器中的营养液体系对蛋白核小球藻生长的影响当确定了合适的堆积球载体及其堆积密度后，还需要与之配套的营养液体系，才能真正带来微藻的高生物量产出。这是因为，如表2及图6所示，在对比例2至4的培养过程中，申请人发现，采用常规使用的bg11培养基，随着蛋白核小球藻在堆积球载体内快速生长
的同时，硝酸盐浓度从300mg/l下降到75mg/l，磷含量从7mg/l下降到0.1mg/l，几乎被消耗殆尽。没想到的是，由于磷酸盐底物的快速消耗，ph值从7.1迅速上升到11.0。因此，常规悬浮培养体系使用的bg11培养基中氮、磷的消耗过快，并且蛋白核小球藻的快速增长会导致原有体系ph的崩溃，严重破坏了反应器体系的平衡，进一步限制了蛋白核小球藻的生物量增加，故bg11培养基已经无法满足蛋白核小球藻在堆积球载体的光生物反应器中生长需求，必须重新选择适合当下的堆积球载体的营养液体系。
82.结合以上出现的新的技术难题，申请人重新改良了培养液，并引入了0.2～1mol/l的kh2po
4-k2hpo4磷酸盐缓冲对，从而形成了新的适应于当下光生物反应器的营养液体系。由表2可知，实施例2采用新的培养液并添加0.2mol/l的kh2po4-k2hpo4磷酸盐缓冲对，可获得最大的生物量产出达到129.87g/l，是对比例1的悬浮培养(0.2g/l)生物量的649.35倍以上，相比对比例3的附着培养但仍然采用bg11培养液体系的生物量(67.52g/l)的接近两倍，而且在新的营养液体系下，蛋白核小球藻培养1天后即进入稳定生长期，随后生物量没有太大的变化(见图4)。
83.进一步，为了确定合适的磷酸盐缓冲对，实施例2、实施例4和对比例5在同等条件下，分别选择了0.2mol/l、1mol/l和0.05mol/l kh2po
4-k2hpo4磷酸盐缓冲液进行对比试验，结果如图7所示，当添加0.2mol/l和1mol/l的磷酸盐缓冲液，二者的蛋白核小球藻生物量基本接近，而对比例5添加0.05mol/的磷酸盐缓冲液的生物量最低为41.69g/l。这说明0.05mol/l的磷酸盐缓冲对并不足以维持反应器中的酸碱平衡，从而限制蛋白核小球藻的进一步生长。
84.如图8所示，当确定了新的营养液体系后，实施例2和实施例4的体系中ph值稳定在7.2～8.1有利于蛋白核小球藻生长的范围内。同时，增加0.05mol/l、0.2mol/l和1mol/l的h2po
4-k2hpo4磷酸盐缓冲液体系中，硝氮含量由500mg/l分别下降至275.7mg/l、264.5mg/l和163.8mg/l；磷含量由1500mg/l分别下降至1100.7mg/l、1082.2mg/l和600.4mg/l。由此可以看出，对比例5的硝氮含量在0.05mol/l的磷酸盐缓冲液体系中消耗最快，蛋白核小球藻生物量最低，为41.69g/l。在堆积球载体的光生物反应器中充足的磷含量有利于维持体系ph的平衡，从而促进蛋白核小球藻的生物量产出。
85.1.光生物反应器中的曝气量和光暗比对蛋白核小球藻生长的影响如表3和图9所示，实施例5～10的蛋白核小球藻在不同曝气量下的生物量都呈现出先快速增长，在第1天后保持生物量稳定增长时期的趋势。当曝气速率为0.5、1、2、3、4和5l/min时，蛋白核小球藻的最大生物量在一天内分别达到102.37g/l、140.24g/l、120.63g/l、195.07g/l、179.93g/l和151.4g/l。相较于对比例1的悬浮培养体系，分别提升了511.85、701.2、603.15、975.35、899.65、757倍，表明蛋白核小球藻能在6种曝气量条件下都有不同程度地生长。
86.表3.实施例5至12以及对比例1的蛋白核小球藻的生物量
新的培养液1是指相对于常规培养微藻所用的bg11培养基，营养液体系中更换了新的培养液如图10所示，实施例8、实施例11和实施例12的蛋白核小球藻在不同光暗比下的
生物量产出的变化情况是，当光暗比为18h:6h时，反应器的生物量达到峰值210.99g/l，在16h:8h和20h:4h条件下，反应器的生物量分别为195.08g/l和168.71g/l，与对比例1的悬浮培养体系相比，分别提高了1054.95倍、843.55倍和843.55倍。
87.2.蛋白核小球藻的品质蛋白核小球藻的蛋白质含量极为丰富，其蛋白质、脂质、多糖和叶绿素是蛋白核小球藻光合作用积累而来。因此，通过蛋白质、脂质、多糖和叶绿素含量变化可以衡量蛋白核小球藻的品质。
88.如图11所示，分别为对比例1和实施例1的蛋白核小球藻品质的对比实验结果。由图11a和图11b可知，实施例1所获得的蛋白核小球藻，其蛋白质、脂质、多糖、叶绿素含量随培养时间的增长呈上升趋势。在培养的前24小时，其蛋白质、脂质、多糖、叶绿素含量快速增殖，由23.5mg/l、62.9mg/l、630.5mg/l和24.7mg/l分别升高至1780.4mg/l、289.8mg/l、173.5mg/l和105.6mg/l。蛋白核小球藻的光合速率增大，代谢活动增强，这是因为蛋白核小球藻处于对数生长期，细胞数目快速增长，繁殖速度加快。而对比例1的悬浮培养体系中的蛋白质、脂质、多糖和叶绿素含量分别从98.3mg/l、15.9mg/l、10.2mg/l和10.3mg/l增加到389.5mg/l、97.3mg/l、59.7mg/l和40.4mg/l，比实施例1的低得多。由此可见，采用本发明的堆积球载体反应器和养殖方法所获得的蛋白核小球藻的蛋白核小球藻其品质更高，这是因为在培养前期蛋白核小球藻快速增长，需要大量吸收培养液环境中的氮、磷元素，而本发明的营养液体系能够满足这一需求，但是随着培养时间的增加，蛋白核小球藻生长环境中的氮、磷元素浓度逐渐降低，此时较低的氮、磷浓度不利于蛋白核小球藻的生长，导致其生长代谢速率下降，从而使蛋白核小球藻的蛋白质、多糖、脂质、叶绿素含量降低。
89.1.蛋白核小球藻对二氧化碳的吸收效果及其对生长和光合作用的影响如表4所示，本实验例1～3分别模拟了三种不同二氧化碳浓度的电厂烟气进行微藻固炭实验。
90.表4.不同二氧化碳浓度下模拟电厂的烟气配比具体实验方案为：1.将蛋白核小球藻按照实施例11的方法培养，不同之处在于，步骤d3中，向光生物反应器中分别通入二氧化碳浓度为2.5％、5％和7％的模拟电厂烟气；然后培养3d，在培养过程中为了防止由于二氧化碳的通入导致ph的降低，要在培养过程中进行监测。
91.同时，分别采用正常通入空气(空气中二氧化碳的浓度为0.04％)的堆积球载体附着培养方式的实施例11以及悬浮培养方式的对比例1作为参照。
92.2.取出20ml的藻液，离心沉淀后取上清液，测定其中固定二氧化碳的速率；同时，测定微藻的生长速率、微藻细胞含碳量等指标。
93.3.测量每一天培养的蛋白核小球藻干重，具体操作方法为：取10ml蛋白核小球藻
藻水混合液，在9000r/min转速下，离心10min脱水，在80℃烘干至恒重。
94.4.记录不同时间点(0h、3h、6h、12h、18h、1d、2d、3d)的数据，采用toc分析仪测定微藻藻粉中的总有机碳和无机碳(碳酸根、碳酸氢根等)的含量。
95.结果如图12所示，增大烟气中的二氧化碳浓度可以提高蛋白核小球藻的固碳速率和生物量产出。当采用本发明的堆积球载体附着培养方法时，0.04％、2.5％、5％和7％的二氧化碳浓度下的蛋白核小球藻的最大湿生物量产出分别达到为220.2g/l、240.7g/l、262.4g/l和273g/l，相较于对比例1的悬浮培养方式，分别提升了1101、1203.5、1312和1365倍。此外，如图13所示，从二氧化碳的吸收效果上看，蛋白核小球藻在0.04％、2.5％和5％二氧化碳浓度下的最大固碳速率为15.69g/l、17.9g/l和19.51g/l，当提高二氧化碳浓度至7％，蛋白核小球藻的固碳效率进一步提高，在一天内达到21.59g/l，而对比例1悬浮培养方式的固碳速率则低于1g/l。由此可知，采用本发明的养殖方法所培育的蛋白核小球藻的生物质产量远超传统悬浮培养，而更多的蛋白核小球藻产出使得光生物反应器可以耐受更高的二氧化碳浓度，避免了过高二氧化碳浓度对蛋白核小球藻的毒害作用。因此，本发明的蛋白核小球藻因其高效固碳的特点，可应用于电厂烟气的处理，实现微藻固碳技术在环保等领域的产业化应用。
96.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、选择光生物反应器中适合蛋白核小球藻高生物量养殖的堆积球载体将若干个堆积球载体放入光生物反应器中，并形成三维空间立体排布的堆叠方式，所述堆积球载体包括球体骨架和填充于所述球体骨架内的填充载体，所述球体骨架由丙烯通过加聚反应而成的聚合物聚丙烯材料制成，所述填充载体由聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝制成；步骤b、制备适合蛋白核小球藻高生物量生长的营养液体系所述营养液体系为培养液和缓冲溶液的组合，其中每升培养液由以下成分组成：7.5g nano3、0.375g mgso47h2o、0.18g cacl22h2o、0.03g 柠檬酸、0.03g 柠檬酸铁铵、0.05g edta、0.1g na2co3、0.0143g h3bo3、0.00905g mncl2、0.00111g znso4、0.000395g cuso4、0.00195g 钼酸钠、0.000245g 硝酸钴和余量的纯净水；所述缓冲溶液为0.2~1.0 mol/l的kh2po
4-k2hpo4缓冲溶液；将配置好的培养液和缓冲溶液进行高压灭菌后，冷却备用；步骤c、蛋白核小球藻的扩大培养c1）采用bg11培养基进行悬浮培养：将蛋白核小球藻和bg11培养基按体积比1:15混合置于锥形瓶中并放置培养箱，在温度为24~26℃、光照强度为5000 lux、曝气量为2 l/min、光暗比为16 h:8 h的条件下培养21 d，完成第一轮扩培；c2）将第一轮扩培的藻液按照上述步骤c1的条件继续进行多轮扩大培养，直至获得5~8 g/l高浓度活性好的蛋白核小球藻藻液；期间每天早中晚进行3次摇瓶，促进培养液与蛋白核小球藻的有效接触，防止蛋白核小球藻沉淀而影响生长；步骤d、蛋白核小球藻的附着培养d1）将步骤a经过灭菌的填充载体填充至堆积球载体内，然后将步骤c的蛋白核小球藻藻液总体积的15 %接种至光生物反应器内的填充载体上，分别加入步骤b的培养液和h2po
4-k2hpo4缓冲溶液，形成适合蛋白核小球藻生长的营养液体系，并调节ph为7.1~8.2；将光生物反应器放置培养箱内进行培养，温度为24~26℃；d2）设置光生物反应器的光暗比为16 h:8 h~20 h:4 h，确保蛋白核小球藻有足够的光照时间；d3）设置光生物反应器的曝气量为1~5 l/min，所有气体在接触藻液之前，都要先通过气体过滤膜，以防藻细胞发生感染。2.根据权利要求1所述的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其特征在于：步骤d2中，所述光暗比为18 h:6 h。3.根据权利要求1所述的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其特征在于：步骤d3中，所述曝气量为3 l/min，所述气体过滤膜的孔径为0.45 μm。4.根据权利要求1所述的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其特征在于：步骤a中，设置堆积球载体的堆积密度即填充载体占整个生物反应器的体积比75%~85%。5.根据权利要求1所述的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其特征在于：步骤a中，所述堆积球载体的直径为14~16 cm。6.根据权利要求1所述的一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，其特征
在于：步骤a中，所述填充载体由若干长度为7~9 cm的条状聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝交错分布而成，所述填充载体的表面包裹一层具有生物亲和力的微生物固着层。

技术总结
本发明涉及微藻养殖技术领域，具体涉及一种高品质高生物量蛋白核小球藻的快速养殖方法，主要包括步骤A、选择光生物反应器中适合蛋白核小球藻高生物量养殖的堆积球载体，步骤B、制备适合蛋白核小球藻高生物量生长的营养液体系，步骤C、蛋白核小球藻的扩大培养，步骤D、蛋白核小球藻的附着培养。与现有技术相比，本发明通过选择聚对苯二甲酸乙二酯纤维丝填充载体作为堆积球载体进行高密度附着培养，并构建适应于堆积球载体的营养液体系和生长环境，从而最大限度地提升蛋白核小球藻的产量和品质，缩短了生长周期，降低养殖成本，本发明具有非常好的产业化应用前景。非常好的产业化应用前景。非常好的产业化应用前景。


技术研发人员：朱能武 韦思静 李飞
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.13
技术公布日：2023/8/9