一种异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物、其制备方法及应用与流程

1.本发明属于肿瘤靶向治疗领域，具体涉及一种异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物、其制备方法及应用。


背景技术：

2.癌症已经成为导致全球人口过早死亡和寿命缩短的重要原因。2020年，全球约有1930万例确诊癌症病例，近1000万人死于癌症。专家预测，到2035年，全球的癌症患者将会增加一半。而中国的癌症发病率和死亡率在全球的占比很高。2022年我国的新发癌症病例约48.2万，癌症死亡病例约32.1万例，分别是美国的2倍和5倍。乳腺癌已取代肺癌，成为全球第一大癌。全球乳腺癌新发病例高达226万例。2020年全球约有90.57万人被诊断患有肝癌，其中死亡病例约83.02万。预计到2040年，原发性肝癌的确诊人数和死亡人数可能会增加55％以上。此外，胃癌和胰腺癌等的发病率也很高，预后仍然很差。目前临床上对于癌症的治疗方式虽然有了很大进步，但是由于肿瘤的异质性和不断进化，多数药物的反应率低，且容易发生耐药，导致有效治疗药物仍然十分缺乏。常规细胞毒类化疗药紫杉醇、顺铂、卡铂和卡培他滨等具有抗癌谱广和疗效好的优势，但是毒副作用大且容易早期耐药。因此，积极探索和研发新的抗癌药物具有重要临床意义。
3.本技术合成了一类具有全新结构式的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物。通过一些生物学技术分析，发现该类化合物在极低剂量能够显著抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌细胞的增殖，在动物体内抗乳腺癌的药效与白蛋白结合型紫杉醇接近，且无明显毒副作用。因此，对此类化合物进一步开发，将在肿瘤治疗的应用方面具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物、其制备方法及应用。
5.基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
6.一种异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物，结构式如通式i所示：
[0007][0008][0009]
其中，r1选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、或-so2nh2；
[0010]
r2选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh、oh、
[0011][0012]
r3选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh或oh；
[0013]
r4选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh或oh；
[0014]
r5选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh或oh；
[0015]
w,x,g,q,v,m分别独立选自c或n；
[0016]
k选自o、nh或ch2；
[0017]
n＝0,1,2。
[0018]
上述异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物，具体为如下结构的化合物：
[0019]
[0020][0021]
上述异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物与乙酸、二氢叶酸、苯甲酸、柠檬酸、山梨酸、丙酸、草酸、富马酸、马来酸、盐酸、苹果酸、磷酸、亚硫酸、硫酸、香草酸、酒石酸、抗坏血酸、硼酸、乳酸和乙二胺四乙酸中的至少一种形成的生物学可接受的盐。
[0022]
上述异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物的制备方法，合成路线如下所示：
[0023][0024]
具体合成步骤如下：
[0025]
(1)将化合物1、化合物2和碳酸钾溶于dmf中，65～75℃搅拌反应完全后，将反应液用乙酸乙酯稀释，并用饱和食盐水洗，有机相旋干得到化合物3；
[0026]
(2)将化合物3溶于甲醇中，加入氯化氢的乙酸乙酯溶液，室温搅拌反应完全后，将反应液旋干得到化合物4；
[0027]
(3)将化合物5溶于二氯甲烷中，-5～5℃依次加入吡啶和三光气，室温搅拌反应完全后，加入盐酸和二氯甲烷萃取，有机相干燥，旋干得到化合物6；
[0028]
(4)将化合物4、化合物6和diea溶于thf中，室温搅拌反应完全后，将反应液旋干后进行柱层析即得目标化合物。
[0029]
优选地，步骤(1)中，化合物1、化合物2和碳酸钾的摩尔比为1:1:1.2；步骤(2)中，化合物3和氯化氢的摩尔比为1:10；步骤(3)中，化合物5，三光气和吡啶的摩尔比为1:0.5:1.5；步骤(4)中，化合物4、化合物6和diea的摩尔比为1:1.2:3。
[0030]
上述的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物及其生物学可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用应用。
[0031]
优选地，所述的抗肿瘤药物是指治疗乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等的药物。
[0032]
具体的说，本发明合成了一类具有全新结构的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1、iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等。通过cck-8法检测此类化合物对多种癌细胞的增殖抑制作用；通过裸鼠移植瘤模型检测化合物对乳腺癌在体生长的影响。
[0033]
结果表明，本发明的化合物it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等可以有效抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等细胞的增殖，并在小鼠体内显著抑制乳腺癌的生长。
[0034]
总之，本发明提供了一种新的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物以及它的衍生物在肿瘤治疗上的用途和潜在分子机制。
附图说明
[0035]
图1是以白蛋白结合型紫杉醇(paclitaxel)为阳性对照，溶剂为空白对照，评估it230308b-1(rdp034)在小鼠体内的抗肿瘤效果。
具体实施方式
[0036]
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明。
[0037]
在本发明合成式i化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识做适当改变的。
[0038]
在本发明中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温环境下进行；更具体地，所述室温是指20-30℃；(ii)有机溶剂用常用干燥方法干燥，溶剂的蒸发使用旋转蒸发仪减压蒸发，浴温不高于50℃；展开剂和洗脱剂均为体积比；(iii)反应过程用薄层色谱(tlc)跟踪；(iv)终产物具有满意的质子核磁共振(1h-nmr)。
[0039]
实施例1:所有化合物的合成参考如下路线
[0040]
具体合成方法，以化合物it230308b-1为例，结构式如下：
[0041][0042]
化合物it230308b-1的名称为(4-(4-(2,2,2-trifluoroethoxy)benzyl)piperazin-1-yl)(5-((5-(3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl)pyrazin-2-yl)oxy)isoindolin-2-yl)methanone，其合成路线如下：
[0043][0044]
步骤1.tert-butyl 5-((5-(3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl)
[0045]
pyrazin-2-yl)oxy)isoindoline-2-carboxylate(化合物3)
[0046]
将化合物1(2.0g,8.50mmol,1.0eq)，化合物2(2.78g,8.50mmol,1.0eq)和碳酸钾(1.41g,10.2mmol,1.2eq)溶解到30ml dmf中，70℃反应3小时，tlc监测反应完毕。反应液用200ml乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗三次(200ml*3)，有机相干燥旋干，粗品过柱子(pe/ea＝10/1～3/1)纯化得到3.5g白色固体化合物3，收率78.3％。
[0047]1h nmr(cdcl3,300mhz)δ:9.05(d,j＝1.1hz,1h),8.70(d,j＝1.1hz,1h),8.38(d,j＝8.2hz,2h),7.84(d,j＝8.4hz,2h),7.35(s,1h),6.95(d,j＝10.0hz,2h),4.83(s,4h),1.59(s,9h).
[0048]
步骤2.(4-(2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenyl)methanol(化合物4)
[0049]
将化合物3(3.2g,6.09mmol,1.0eq)溶于20ml甲醇，冷却到0℃，加入4m的氯化氢的乙酸乙酯溶液(15.2ml,60.9mmol,10eq)，自然升温到室温反应2小时，tlc监测显示原料反应完毕，并有新点产生。将反应液直接旋干，得到2.75g化合物4，白色固体，收率97.8％。
[0050]1h nmr(cdcl3,300mhz)δ:9.05(d,j＝1.1hz,1h),8.70(d,j＝1.1hz,1h),8.38(d,j＝8.2hz,2h),7.84(d,j＝8.4hz,2h),7.35(s,1h),6.95(d,j＝10.0hz,2h),4.83(s,4h)
[0051]
步骤3. 4-(4-(2,2,2-trifluoroethoxy)benzyl)piperazine-1-carbonyl chloride(6)
[0052]
将化合物5(4.0g,14.58mmol,1.0eq)溶解于30ml二氯甲烷中，冷却到0℃，依次加入三光气(2.16g,7.29mmol,0.5eq)和吡啶(1.73g,21.87mmol,1.5eq)，室温反应1小时，tlc监测反应完毕。将反应液倒入1m的稀盐酸水溶液中(150ml)，用二氯甲烷萃取3次(100ml*3)，将有机相合并，用无水硫酸钠干燥，旋干得到710mg化合物(6)，黄色固体，收率92.1％。
[0053]1h nmr(cdcl3,400mhz)δ:7.60(s,2h),7.15(d,j＝7.9hz,2h),4.83-4.78(m,2h),4.35(s,2h),3.57(s,5h),3.17(s,4h),1.34-1.22(m,1h).
[0054]
步骤4.(4-(4-(2,2,2-trifluoroethoxy)benzyl)piperazin-1-yl)(5-((5-(3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)
[0055]-1,2,4-oxadiazol-5-yl)pyrazin-2-yl)oxy)isoindolin-2-yl)methanone(it230308b-1)
[0056]
将化合物4(1.0g,2.17mmol,1.0eq)，化合物6(0.87g,2.60mmol,1.2eq)和diea(0.84g,6.50mmol,3.0eq)溶解于25ml thf中，室温反应4小时，tlc监测反应完毕。将反应液直接旋干过柱(dcm/meoh＝60:1～20:1)得到1.02g it230308b-1，黄色固体，收率65％。
[0057]1h nmr(cdcl3,300mhz)δ:9.05(d,j＝1.1hz,1h),8.70(d,j＝1.1hz,1h),8.38(d,j＝8.2hz,2h),7.84(d,j＝8.4hz,2h),7.38(d,j＝8.6hz,2h),7.35(s,1h),7.16(d,j＝12.2hz,2h),6.95(d,j＝10.0hz,2h),4.83(s,4h),4.39(s,3h),3.66(m,2h),3.55(s,2h),3.43(s,4h),2.53(s,4h).
[0058]
实施例2、it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等对乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等细胞的增殖抑制作用
[0059]
分别收集对数生长期的mda-mb-468、hepg2、bxpc-3和mkn-45细胞，计数，调整细胞悬液浓度为5
×
104个/ml，加入96孔细胞培养板，每孔体积100μl。以dmso为溶剂对照，将本发明所述的化合物it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等用dmso稀释后加入培养孔，使体系中化合物的终浓度分别为0.1、0.3、1、3、10、30、100和300(μmol/l)。继续培养48h后，每孔加入cck-8溶剂10μl，37℃孵育1h，酶标仪读值，测定在吸收波长为450nm下的od值，记录结果，以化合物的剂量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。所述化合物对肿瘤细胞的半数抑制率(ic50值)的统计结果如下表1所示：
[0060]
表1.cck-8检测it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等对乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等细胞的增殖抑制作用
[0061]
[0062]
[0063][0064]
表中显示：it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等对乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等均有良好的增殖抑制作用，特别是在胃癌和乳腺癌细胞的抑瘤活性更强，本技术以it230308b-1为例对这类化合物的体内抗肿瘤效应进行了进一步研究。
[0065]
实施例3、it230308b-1(rdp034)在小鼠体内的抗肿瘤药效。
[0066]
从斯贝福(北京)生物技术有限公司购入spf级，6周龄，体重18-22g的balb/c-nude雌性裸鼠20只，用于接种瘤块。取之前在皮下接种成功的mda-mb-468细胞移植瘤组织，用pbs洗净血污，切成1.5毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直
接刺入皮下，注入瘤块。将接种过的动物放回原笼饲养，保持环境清洁，避免感染。肿瘤细胞接种1周后，观察接种部位是否有乳白色结节形成。用游标卡尺测量肿瘤的长径和宽径，根据公式(肿瘤体积＝长径
×
短径2×
0.5)计算肿瘤的体积。待肿瘤体积达100-150mm3时进行分组和给药。将符合实验体积要求的18只小鼠随机分为3组，每组6只。通过腹腔注射给药，it230308b-1(rdp034)的剂量为每鼠5mg/kg，溶剂对照(10％dmso+90％玉米油，记为sus control)为空白对照，白蛋白结合型紫杉醇(paclitaxel)5mg/kg为阳性对照，每次注射100μl，每天给药1次，连续给药10天。隔日检测小鼠的瘤体积和体重，结果详见图1。
[0067]
图1a的结果显示，给药第十天时，rdp034 5mg/kg组和paclitaxel 5mg/kg组的瘤体积显著小于空白对照组。图1b的结果表明，从给药第二天起，rdp034 5mg/kg组和paclitaxel 5mg/kg组与空白对照组的移植瘤体积的差距不断增大。从给药第六天起，paclitaxel的移植瘤生长速率加快，逐渐超过rdp034组的瘤体积。图1c的结果表明，给药第十天时paclitaxel组的小鼠体重明显下降，而rdp034组的小鼠体重无明显降低。这些数据表明，rdp034与paclitaxel的体内抗癌药效接近，且不易耐药和副作用少。
[0068]
综上结果表明，it230308b-1、it230309b-1、it230310b-1、id230308b-1、id230309b-1、id230310b-1、iy230307a-1、iy230308a-1、iy230309a-1、iy230309b-1、iy230310b-1、iy230312b-1、id230312b-1、it230312b-1、it230313b-1、iy230320a-1、iy230320b-1、iy230320c-1、id230320a-1、id230320b-1、id230320c-1、it230320a-1、it230320b-1、it230320c-1、iy230322a-1、iy230322b-1、iy230322c-1、id230322a-1、id230322b-1、id230322c-1iy230401a-1、iy230402a-1、iy230403a-1、iy230404a-1、iy230405a-1、iy230406a-1、iy230407a-1、iy230408a-1、iy230409a-1、iy230410a-1、iy230411a-1和iy230412a-1等可以显著抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等细胞的增殖，并且it230308b-1与紫杉醇相比，在小鼠体内具有更好的疗效和安全性。因此，此类药物具有良好的抗癌作用和开发潜力。
[0069]
按照药物开发的一般途径(先进行常规的抗肿瘤体外筛选，然后进行针对性的研究)，本发明的化合物可以应用到与细胞增殖异常相关的癌症治疗药物中，可通过与人体可接受的成盐或与药用载体混合制备抗肿瘤药物。
[0070]
最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发明权利要求保护的范围之内。

技术特征：
1.一种异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物，其特征在于，结构式如通式i所示：其中，r1选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、或-so2nh2；r2选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh、oh、r3选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh或oh；r4选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh或oh；r5选自h、f、cl、br、i、-cn、-ch3、-cf3、-och3、-ocf3、-cooh或oh；w,x,g,q,v,m分别独立选自c或n；k选自o、nh或ch2；n＝0,1,2。2.根据权利要求1所述的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物，其特征在于，具体为如下结构的化合物：
3.权利要求1或2所述的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物与乙酸、二氢叶酸、苯甲酸、柠檬酸、山梨酸、丙酸、草酸、富马酸、马来酸、盐酸、苹果酸、磷酸、亚硫酸、硫酸、香草酸、酒石酸、抗坏血酸、硼酸、乳酸和乙二胺四乙酸中的至少一种形成的生物学可接受的盐。
4.权利要求1所述异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下所示：具体合成步骤如下：(1)将化合物1、化合物2和碳酸钾溶于dmf中，65～75℃搅拌反应完全后，将反应液用乙酸乙酯稀释，并用饱和食盐水洗，有机相旋干得到化合物3；(2)将化合物3溶于甲醇中，加入氯化氢的乙酸乙酯溶液，室温搅拌反应完全后，将反应液旋干得到化合物4；(3)将化合物5溶于二氯甲烷中，-5～5℃依次加入吡啶和三光气，室温搅拌反应完全后，加入盐酸和二氯甲烷萃取，有机相干燥，旋干得到化合物6；(4)将化合物4、化合物6和diea溶于thf中，室温搅拌反应完全后，将反应液旋干后进行柱层析即得目标化合物。5.根据权利要求4所述异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，化合物1、化合物2和碳酸钾的摩尔比为1:1:1.2；步骤(2)中，化合物3和氯化氢的摩尔比为1:10；步骤(3)中，化合物5，三光气和吡啶的摩尔比为1:0.5:1.5；步骤(4)中，化合物4、化合物6和diea的摩尔比为1:1.2:3。6.权利要求1至3任一项所述的异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物及其生物学可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。7.根据要求6所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物是指治疗乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌的药物。

技术总结
本发明提供了一种异吲哚啉基-哌嗪基脲类化合物、其制备方法及应用，其含有的具有生物活性异吲哚啉基-哌嗪基脲母核基团进一步化学修饰产生诸多生物活性更高化合物，拓展了此类化合物在生物医药上的广泛应用以及药物制剂开发前景。该类化合物在低剂量（纳摩尔）即可显著抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等细胞的增殖，并能有效抑制移植瘤在小鼠体内的生长，表明该类化合物具有开发为抗肿瘤药物的前景。明该类化合物具有开发为抗肿瘤药物的前景。


技术研发人员：徐学军 杨玉坡 杨争艳 段超群 徐红运 裴梦富 刘亚青 李岑 汤善顺
受保护的技术使用者：河南省锐达医药科技有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/9