一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂

1.本发明涉及生物技术农作物促生菌领域，尤其涉及一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂。


背景技术：

2.磷是植物三大营养元素之一，是作物产量形成的必需元素，在农作物栽培过程中必需通过施磷肥来补充。植物吸收利用的磷主要源于土壤，而土壤95％的磷以植物难以吸收的形态存在，导致我国约74％的耕地土壤缺磷。为了追求高产，磷肥的投入常常超出作物实际需求量，造成土壤磷素积累增加，相当比例的磷与土壤中fe
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、ca
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、al
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结合，形成化合物而丧失有效性，降低了磷的利用效率，导致施入磷肥当季利用率仅5％～25％。水稻是我国最重要的粮食作物，约占我国粮食总产量的一半以上。水稻生产对磷肥的需求量大，但对磷肥的利用率较低，部分磷通过地表径流流失，造成农业面源污染。因此，降低磷肥投入，提高土壤磷有效性是水稻增产和技术突破的关键。
3.溶磷菌(phosphate-solubilizing bacteria，psb)是一类具有溶磷作用的微生物，能分泌有机酸、磷酸酶等物质活化土壤磷素，改变其形态，将植物难以吸收利用的难溶性或不溶性磷转化为可利用的形态，提高土壤中磷素的有效性。目前，已发现的溶磷微生物种类只占溶磷微生物的一小部分，包括细菌、真菌、放线菌等，如假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、曲霉(aspergillus)、青霉(penicillium)、罗旺醋杆菌(acetobacter lovaniensis)、解鸟氨酸拉乌尔菌(raoultella ornithinolytica)、果胶杆菌(pectobacterium cypripedii)、伯克霍尔德氏菌(burkholderia sp)、肠杆菌(enterobacter sp)、解聚糖类芽孢杆菌(paenibacillus glycanilyticus)和克雷伯氏菌(klebsiella)等菌属，这些溶磷菌能够不同程度地转化土壤磷素形态，增加土壤有效磷含量，进而提高作物产量，如刘耀辉等(2022)在土壤通报第53卷第2期(472-4818页)报道了伯克霍尔德氏菌(zp-4)和克雷伯氏菌(zp-2)菌液能显著降低土壤ph值、有机质含量和难以利用的残渣磷(residual-p)及hcl-pi，但显著提高了土壤潜在的、可利用的有机和无机磷源(h2o-pi、nahco3-pi、nahco3-po、naoh-pi和naoh-po)含量，加速了磷组分和形态的转化，改变了土壤细菌的生物多样性。栗丽等(2020)在应用与环境生物学报第26卷第3期(612-618页)报道，与未接种溶磷菌剂处理相比，接种混合溶磷菌剂的复垦土壤中的有效磷含量和磷酸酶活性大幅提高，油菜鲜重和磷含量增加。
4.紫花苜蓿(medicago sativa l.)属多年生豆科植物，营养价值高，是奶牛养殖的优质饲草，有“牧草之王”的美誉。申请人创新性地在我国华东地区建立了紫花苜蓿与水稻周年轮作技术，种植紫花苜蓿并将部分再生紫花苜蓿草还田，使轮作水稻产量增加18％(见李凤杰等发表于草业科学，2021，第38卷第10期2008-2018页)。进一步分析发现，轮作紫花苜蓿增加了稻田土壤有机磷和无机磷的可利用效率，促进了水稻植株磷与氮的协同增效作用，提高了孕穗期和灌浆期的氮素利用效率。尽管紫花苜蓿植株含有一定量的磷元素，但不足以使水稻增产18％，因此，推测种植紫花苜蓿改变了土壤有机和无机溶磷菌的生物多样
性和组成，促进了稻田土壤磷溶解能力，增加了土壤磷的可利用性，但相关研究尚未见报道。
5.因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用紫花苜蓿促进水稻对于土壤中无机磷吸收，增加水稻产量的微生物添加剂。


技术实现要素：

6.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是增加水稻对于土壤中磷的吸收，增加水稻产量。
7.为实现上述目的，本发明提供了一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，其特征在于，包括有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌。
8.在本发明的一较佳实施方式中，所述有机磷溶磷菌是从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离出的适宜水稻生长环境的菌种。
9.在本发明的另一较佳实施方式中，所述有机磷溶磷菌为多形单胞菌和氢噬胞菌中的一种或两种。
10.在本发明的另一较佳实施方式中，所述无机磷溶磷菌为不动杆菌和分散泛菌的一种或两种，其中，所述不动杆菌为从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离得到，所述分散泛菌为从紫花苜蓿植物中筛选和分离得到。
11.本发明还提供一种使用上述的水稻促生菌剂增加水稻产量的方法，其特征在于，所述方法包括：
12.把保存有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌的lb液体培养基按一定体积比混合，制备成溶磷菌促生菌剂施入稻田。
13.在本发明的一较佳实施方式中，所述一定体积比为20-30％：20-30％：40-60％，稻田耕翻时每亩地施用10-20升所述促生菌剂。
14.在本发明的另一较佳实施方式中，所述一定体积比为30％：30％：40％。
15.在本发明的另一较佳实施方式中，所述一定体积比为20％：20％：60％。
16.在本发明的另一较佳实施方式中，所述一定体积比为30％：20％：50％。
17.在本发明的另一较佳实施方式中，每亩稻田施入量15升所述促生菌剂。
18.基于本发明，可以达到如下技术效果：
19.1、针对水稻创制了高效溶解土壤磷的有机磷溶磷菌(多形单胞菌和氢噬胞菌)和无机磷溶磷菌(不动杆菌属和分散泛菌)复合溶磷微生物菌剂，有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌分别具有溶解土壤有机磷和无机磷的功能，可以促进水稻对土壤有机和无机磷的吸收，增加水稻产量。
20.2、从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离出适宜水稻生长环境的有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌，由于不同土壤环境适宜生长的微生物菌群不同，从稻田中分离的有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌更适宜稻田生长环境，能进一步促进水稻对土壤有机和无机磷的吸收，增加水稻产量。
21.以下将对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
22.本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
23.本发明提供了一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，包括有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌。所述有机磷溶磷菌是从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离出的适宜水稻生长环境的菌种，为多形单胞菌和氢噬胞菌中的一种或两种。所述无机磷溶磷菌为不动杆菌和分散泛菌的一种或两种，其中，所述不动杆菌为从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离得到，所述分散泛菌为从紫花苜蓿植物中筛选和分离得到。
24.所述的有机磷溶磷菌和不动杆菌，具体通过以下步骤获得：
25.1)秋季或早春播种的紫花苜蓿，在水稻插秧前20天刈割紫花苜蓿，同时，将800kg/亩-1500kg/亩的紫花苜蓿鲜草作为绿肥翻入土壤，20天后插秧；
26.2)水稻抽穗后期，取0-15cm土壤，去除杂物，取每1g土加无菌水10ml，漩涡振荡24h后得悬液备用。所得悬液4000r/min离心5min后，取上清液0.1ml，用无菌水稀释成10-104系列稀释液，分别涂布于pikovskava(pko)解无机磷培养基和蒙金娜溶有机磷培养基，28℃培养1-4d后分离溶磷菌，分离所得的有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌分别保存于lb液体培养基，制成有机磷和无机磷原生溶磷菌菌液，甘油管保存。
27.所述的有机磷溶磷菌，具体通过以下步骤获得：
28.1)将有机磷原生溶磷菌甘油管菌液，涂布于蒙金娜溶有机磷溶磷菌分离固体培养基中，培养基ph＝7.0，28℃下培养2-4天；
29.2)挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在lb固体培养基纯化，得到多形单胞菌和氢噬胞菌属，纯化后的多形单胞菌和氢噬胞菌在装有lb液体培养基的密闭容器中保存。
30.不动杆菌的具体通过以下步骤获得：
31.1)将无机磷原生溶磷菌甘油管菌液，涂布于pko解无机磷固体培养基中，培养基ph＝7.0，28℃下培养2-4天；
32.2)挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在lb固体培养基纯化，得到不动杆菌，纯化后的不动杆菌在装有lb液体培养基的密闭容器中保存。
33.无机溶磷菌中的分散泛菌，具体通过以下步骤获得：
34.1)取紫花苜蓿根、茎、叶片各0.5g，加ph7.0的无菌水5ml，在无菌研钵内研磨充分后置于5ml无菌离心管内，4000r/min离心5min，取上清液0.1ml，用无菌水稀释成10-104系列稀释液，分别涂布于pikovskava(pko)解无机磷培养基，28℃培养1-4d，分离所得溶磷菌保存于lb液体培养基，作为紫花苜蓿无机磷原生溶磷菌菌液，甘油管保存；
35.2)将紫花苜蓿无机磷原生溶磷菌甘油管菌液，涂布于pko解无机磷固体培养基中，培养基ph＝7.0，28℃下培养2-4天；挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在lb固体培养基纯化，得到分散泛菌，纯化后的分散泛菌在装有lb液体培养基的密闭容器中保存。经测定从紫花苜蓿中分离的分散泛菌具有高效的无机磷溶解能力。
36.所述的pko解无机磷(pikovskava,1948)培养基配方如下表1所示：
37.表1pko解无机磷(pikovskava,1948)培养基配方(单位：g/l)
[0038][0039]
其中，ca3(po4)2过0.05mm筛并单独灭菌后与培养基混合。
[0040]
所述的蒙金娜溶有机磷培养基(％)配方如下表2所示：
[0041]
表2蒙金娜溶有机磷培养基配方(单位：g/l)
[0042][0043]
其中卵磷脂用75％的酒精加热溶解，单独灭菌，温度降低到70℃后与培养基混合。
[0044]
所述的lb固体培养基(％)配方为：蛋白胺10g/l,酵母粉5g/l，nacl 10g/l，l，琼脂10g/l。
[0045]
所述的lb液体培养基(％)配方为：蛋白胺10g/l,酵母粉5g/l，nacl 10g/l。
[0046]
本发明所述的促生菌剂通过以下步骤制得：(1)从紫花苜蓿与水稻轮作的稻田土中制作有机磷和无机磷原生溶磷菌菌液；(2)分别从原生溶磷菌菌液中分离有机磷溶磷菌(主要包括多形单胞菌和氢噬胞菌)和无机磷溶磷菌(主要包括不动杆菌)；(3)从紫花苜蓿植株中分离无机磷溶磷菌的分散泛菌；(4)有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌活化；(5)把活化的有机磷溶磷菌菌液(多形单胞菌和氢噬胞菌)和无机磷溶磷菌菌液(不动杆菌和分散泛菌)按比例混合，形成一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂。
[0047]
具体制备步骤如下：
[0048]
由保存有机磷溶磷菌、不动杆菌(acinetobacter)(无机磷溶磷菌)和分散泛菌(pantoea)(无机磷溶磷菌)的lb液体培养基按20-30％：20-30％：40-60％的体积比混合，形成一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，其中，有机磷溶磷菌菌液包含多形单胞菌(pleomorphomonas oryzae)和氢噬胞菌(hydrogenophaga)的一种或两种。每1ml lb液体培养基中至少含有机磷溶磷菌(多形单胞菌和氢噬胞菌的一种或两种)、不动杆菌或分散泛菌2x108cfu，每1ml该促生菌剂含有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌的数量不少于2x108cfu，稻田耕翻时每亩地施用10-20升该促生菌剂。
[0049]
实施例一：把有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌按30％：30％：40％的体积比混合，形成溶磷菌剂，其中，每1ml溶磷菌剂中含有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌的浓度依次不少于6x107cfu,6x107cfu和8x107cfu，每亩稻田施入量15升，抽穗期稻田土壤速效p含量增加22％，收获期水稻增产15％。
[0050]
实施例二：把有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌按20％：20％：60％的体积比混合，形成溶磷菌剂，其中，每1ml溶磷菌剂中含有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌的浓度依次不少于4x107cfu、4x107cfu和12x107cfu，每亩稻田施入量15升，抽穗期稻田土壤速效p含量增加42％，收获期水稻增产28％。
[0051]
实施例三：把有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌按30％：20％：50％的体积比混合，形成溶磷菌剂，其中，每1ml溶磷菌剂中含有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌的浓度依次不少于6x107cfu,4x107cfu和10x107cfu，每亩稻田施入量15升，抽穗期稻田土壤速效p含量增加36％，收获期水稻增产22％。
[0052]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，其特征在于，包括有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌。2.如权利要求1所述的一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，其特征在于，所述有机磷溶磷菌是从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离出的适宜水稻生长环境的菌种。3.如权利要求1所述的一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，其特征在于，所述有机磷溶磷菌为多形单胞菌和氢噬胞菌中的一种或两种。4.如权利要求1所述的一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，其特征在于，所述无机磷溶磷菌为不动杆菌和分散泛菌的一种或两种，其中，所述不动杆菌为从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离得到，所述分散泛菌为从紫花苜蓿植物中筛选和分离得到。5.一种使用如权利要求1-4任一项所述的水稻促生菌剂增加水稻产量的方法，其特征在于，所述方法包括：把保存有机磷溶磷菌、不动杆菌和分散泛菌的lb液体培养基按一定体积比混合，制备成溶磷菌促生菌剂施入稻田。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一定体积比为20-30％：20-30％：40-60％，稻田耕翻时每亩地施用10-20升所述促生菌剂。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一定体积比为30％：30％：40％。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一定体积比为20％：20％：60％。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一定体积比为30％：20％：50％。10.如权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，每亩稻田施入量15升所述促生菌剂。

技术总结
本发明公开了一种基于紫花苜蓿溶磷菌的水稻促生菌剂，涉及生物技术农作物促生菌领域。本发明通过从紫花苜蓿与水稻轮作土壤中筛选和分离出适宜水稻生长环境的菌种，包括有机磷溶磷菌和无机磷溶磷菌，按照一定的体积比混合形成了溶磷菌剂，在稻田中施入，从而能促进促进水稻对土壤有机和无机磷的吸收，增加水稻产量。产量。


技术研发人员：安渊 徐蕊 王峥 苏连泰 高鲤 周鹏 游翔凯
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/9