肉及肉制品中L-羟脯氨酸的检测方法与流程

肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法
技术领域
1.本发明属于食品检测领域，尤其涉及肉及肉制品中游离态l-羟脯氨酸的检测方法。


背景技术：

2.羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特征氨基酸，胶原蛋白又是结缔组织的主要成分。羟脯氨酸的存在促进了胶原蛋白的形成，进而影响了肉的质地和感官特性。因此，评估肉及肉制品中羟脯氨酸的含量是评估其质量的一种简单而实用的方法。
3.由于羟脯氨酸通常以蛋白质的形式存在于样品中，因此要将羟脯氨酸解离为游离态后再进行测定。目前，常用的肉及肉制品中蛋白质水解方法包括酸水解法、微波水解蛋白法以及酶解法。羟脯氨酸的检测方法包括比色法、氨基酸分析法、毛细管胶束电动色谱法、高光谱成像法、结缔组织胶原蛋白的自身荧光法、核磁共振碳谱、核磁共振成像法、柱前衍生高效液相色谱法、柱后衍生高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法以及高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测法。
4.目前测定肉及肉制品中羟脯氨酸最广泛的方法是酸水解-比色法。虽然这种方法能够检测猪肉中羟脯氨酸的含量，但是这种方法实验过程繁琐、氧化程度及反应颜色难以控制、耗时长。利用酶解蛋白质中酶的反应条件苛刻、特异性强，成本高且难于保存。彭碧宁等人利用氨基酸分析仪对酱油中羟脯氨酸的含量进行了测定，此法自动化程度好，重现性和准确度较好，然而需要专业的氨基酸分析仪和较多缓冲液。同样，毛细管胶束电动色谱自动化程度高、灵敏度高、工作时间短，能有效测定乳制品中羟脯氨酸的含量，然而其费用较高，尚未有较大普及范围，比较局限于精密检测研究的实验室，普通实验室难以实现。利用高光谱成像技术检测羟脯氨酸在1991年被提出，虽然在样品前处理上简单环保，但数据量大且需要专业的计算机编程来完成，数据分析时间较长，故至今仍未大范围使用。核磁共振碳谱法适用范围小，对纯度80％以上的单体化合物才能进行较准确检测。高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测器在2008年即被提出，然而仪器费用高，适用范围不够宽，普及范围有限，亦未成为羟脯氨酸检测的主流方法。因此，寻求一种快速、准确、简单的羟脯氨酸检测方法是肉制品行业亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种快速、准确、适用范围广的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法。
6.由于羟脯氨酸没有紫外或荧光响应，为提高分析检测灵敏度和分离选择性，将羟脯氨酸衍生化，接上发光或发色基团，形成具有紫外相应的衍生物，再进行定性定量分析。随着衍生氨基酸技术不断完善，近年来，pitc法已成为普遍用于rp
–
hplc分析氨基酸方法之一。羟脯氨酸可与异硫氰酸苯酯(pitc)反应生成能用紫外检测的ptc-羟脯氨酸。
7.本发明所采用的具体技术方案如下：
8.本发明提供了一种肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，具体如下：
9.s1，制备待测样品：将样品使用微波消解仪进行消解，以破坏样品内脂肪和蛋白质并释放出游离氨基酸，得到待测样品；利用l-羟脯氨酸标准品得到不同浓度的标准系列溶液；
10.s2，衍生：将所述标准系列溶液和所述待测样品分别与异硫氰酸苯酯(pitc)进行衍生，以生成能用紫外检测到的ptc-羟脯氨酸；
11.s3，分离检测：采用高效液相色谱-紫外检测方法，分离检测步骤s2中标准系列溶液和待测样品衍生后生成的l-羟脯氨酸，得到待测样品的色谱图和标准系列溶液的色谱图并将两者进行比较，使用外标法对样品中l-羟脯氨酸含量进行测定。
12.作为优选，所述步骤s1中消解过程具体如下：
13.称取制样均匀的样品0.8～1g置于50ml消解管中，向所述消解管中加入质量浓度为5％～50％的盐酸10ml，随后将所述消解管放入微波消解仪中；微波消解仪的消解温度为110～140℃，消解时间为20～60min。
14.进一步的，盐酸浓度较佳地为50％，消解温度较佳地为130℃，消解时间较佳地为60min。
15.作为优选，所述步骤s1中，标准系列溶液是将l-羟脯氨酸标准品溶于水所得的浓度在1-1000mg/l之间的至少五组不同浓度的子溶液。
16.作为优选，所述步骤s2具体如下：
17.取所述待测样品200μl上清液至刻度试管中并用氮气吹干，向试管中加入200μl 0.1mol/l盐酸进行涡旋溶解，得到预备待测液；随后向所述标准系列溶液和所述预备待测液的各试管中加入含0.1mol/l异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl以及含1mol/l三乙胺的乙腈溶液100μl，涡旋混合后并于10～40℃水浴衍生10～60min，接着向各试管中加入质量分数为50％的乙腈溶液并定容至1ml，过0.22μm滤膜备用。
18.进一步的，衍生温度较佳地为30℃，衍生时间较佳地为30min。
19.作为优选，所述步骤s3中高效液相色谱的条件如下：
20.流动相a：钠离子浓度为0.1mol/l的乙酸钠缓冲液，利用冰乙酸调节ph至6.3～6.7；流动相b：甲醇；所述流动相a与所述流动相b按照下述体积比进行梯度洗脱：第0min时加入95％的流动相a和5％的流动相b，第8min时加入95％的流动相a和5％的流动相b，第20min时加入20％的流动相a和80％的流动相b，第26min时加入95％的流动相a和5％的流动相b；洗脱时的流速为1.0ml/min。
21.作为优选，所述步骤s3中紫外检测器的检测波长为210～270nm。
22.进一步的，检测波长较佳地为254nm。由于羟脯氨酸没有紫外或荧光响应，为提高分析检测灵敏度和分离选择性，将羟脯氨酸衍生化，接上发光或发色基团，形成具有紫外相应的衍生物ptc-羟脯氨酸，再进行定性定量分析。
23.作为优选，所述步骤s3中高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和保护柱；所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为3μm、150mm
×
4.6mm，所述保护柱的规格为3μm、12.5mm
×
4.6mm。
24.作为优选，所述步骤s3中高效液相色谱的色谱柱的柱温为20～40℃，进样量为10～50μl。
25.进一步的，色谱柱的柱温较佳地为35℃，进样量较佳地为20μl。
26.作为优选，所述步骤s3具体如下：
27.将标准系列溶液中不同浓度的子溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积；随后以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；接着将待测样品注入液相色谱仪中，得到峰面积，并根据所述标准曲线，得到待测样品中l-羟脯氨酸的质量浓度。
28.本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
29.(1)利用微波消解仪进行蛋白质的消解，与传统酸水解方法相比，消解时间极大缩短，提取周期短。
30.(2)与传统酸水解方法相比，消解液用量减少，降低了成本，更加经济。
31.(3)与传统酸水解方法相比，微波消解仪能精确控制消解温度和压力，且反应在密闭条件下进行，实验更佳安全。
32.(4)与传统茚三酮显色方法相比，减少了显色剂的使用，对环境污染小。
33.(5)本发明的检测方法普适性更强，不需要昂贵的氨基酸分析仪和/或液相色谱质谱联用仪，适用于更多的常规实验室。
附图说明
34.图1为实施例中羟脯氨酸标准品高效液相色谱图(其中羟脯氨酸浓度为100mg/l，进样量为20μl)。
35.图2为实施例中新鲜猪肉样品经本发明方法处理后高效液相色谱图(进样量为20μl)。
36.图3为实施例中腊肠样品经本发明方法处理后高效液相色谱图(进样量为20μl)。
具体实施方式
37.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
38.实施例
39.本实施例采用的实验条件如下：
40.检测仪器：高效液相色谱仪配二极管阵列检测器。
41.消解仪器：上海屹尧仪器科技发展有限公司，topex+微波消解仪。
42.l-羟脯氨酸标准品(cas:51-35-4)由trc试剂公司生产，购自上海安谱实验科技有限公司。
43.色谱柱：c18反相色谱柱(150mm
×
4.6mm，3μm)；
44.柱温：35℃；
45.进样量：20μl；
46.检测波长：254nm；
47.流速：1.0ml/min；
48.流动相a：钠离子浓度为0.1mol/l乙酸钠缓冲液，其ph通过冰乙酸调节至6.5。
49.流动相b：甲醇；
50.梯度洗脱程序：
51.洗脱步骤洗脱时间(min)a相体积比(％)b相体积比(％)10955289553202080426955
52.步骤1)标准曲线的绘制：
53.称量0.0100g羟脯氨酸，用水定容至10ml，得到羟脯氨酸标准储备液，于2～8℃保存。准确移取一定量羟脯氨酸标准储备液，用水稀释定容，配制成5.00mg/l、10.0mg/l、20.0mg/l、50.0mg/l、100mg/l系列标准工作液。分别取不同浓度的系列标准工作液200μl于试管中，向各试管中加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯(pitc)的乙腈溶液100μl、1mol/l三乙胺的乙腈溶液100μl，涡旋混合，30℃水浴衍生30min，加入50％乙腈溶液定容至1ml。过0.22μm滤膜，待hplc检测。
54.将系列标准工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。得到羟脯氨酸标准曲线方程为y＝ax+b，其中，a＝10981.8，b＝-1264.47，r2为0.999。
55.步骤2)新鲜猪肉中羟脯氨酸的含量测定：
56.将市场购买的新鲜猪肉用绞肉机均质。试样放入密封容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化后24h内尽快分析。称取制样均匀样品约1g(精确到0.0001)于50ml消解管中，加入6mol/l(50％盐酸)的盐酸10ml，放入微波消解仪中，消解温度为130℃，消解时间为60min，消解完成后取200μl上清液至刻度试管中氮气吹干，加入200μl 0.1mol/l盐酸涡旋溶解。向试管中加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯(pitc)的乙腈溶液100μl、1mol/l三乙胺的乙腈溶液100ul，涡旋混合，30℃水浴衍生30min，加入50％乙腈溶液定容至1ml。过0.22μm滤膜，待hplc检测。
57.取20μl试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，如图2所示。根据标准曲线方程计算得到待测液中羟脯氨酸的质量浓度，通过以下公式计算得到样品中羟脯氨酸含量：
[0058][0059]
式中：
[0060]
x—试样中待测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)。
[0061]
a—由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，单位为毫克每升(mg/l)。
[0062]
v—样品提取液定容体积，单位为毫升(ml)。
[0063]
m—试样质量，单位为克(g)。
[0064]
待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当稀释后，重新测定。测得结果如表1和图2所示。
[0065]
结果表明，通过本发明方法对新鲜猪肉样品中l-羟脯氨酸的含量测定具有较好的可行性。
[0066]
步骤3)腊肠中羟脯氨酸的含量测定：
[0067]
将市场购买所得腊肠按照步骤2)中的方法进行微波消解蛋白质和衍生化处理后
用高效液相色谱仪进行含量测定，所得结果如表1和图3所示。
[0068]
结果表明，通过本发明方法对腊肠样品中l-羟脯氨酸的含量测定具有较好的可行性。
[0069]
表1市售新鲜猪肉及腊肠样品中羟脯氨酸的含量
[0070][0071][0072]
本发明的检测方法采用微波消解对样品进行前处理，高效液相色谱进行含量测定，与传统湿法消解相比，微波消解试剂用量少，空气污染小，消解速度快且消解彻底，大大缩短了消解时间，仪器在设定好所需的压力、微波消解时间和消解功率等程序条件下，放入样品后，即可自动完成全部操作，操作方便，减轻了分析人员的劳动强度，提高了工作效率。简便易行，适用于大批量肉及肉制品中l-羟脯氨酸的含量测定。实验结果表明，本方法与经典方法比较，测定结果基本一致，方法精密度小于5％，重现性好。
[0073]
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，具体如下：s1：将样品使用微波消解仪进行消解，以破坏样品内脂肪和蛋白质并释放出游离氨基酸，得到待测样品；利用l-羟脯氨酸标准品得到不同浓度的标准系列溶液；s2：将所述标准系列溶液和所述待测样品分别与异硫氰酸苯酯进行衍生，以生成能用紫外检测到的ptc-羟脯氨酸；s3：采用高效液相色谱-紫外检测方法，分离检测步骤s2中标准系列溶液和待测样品衍生后生成的l-羟脯氨酸，得到待测样品的色谱图和标准系列溶液的色谱图并将两者进行比较，使用外标法对样品中l-羟脯氨酸含量进行测定。2.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中消解过程具体如下：称取制样均匀的样品0.8～1g置于50ml消解管中，向所述消解管中加入质量浓度为5％～50％的盐酸10ml，随后将所述消解管放入微波消解仪中；微波消解仪的消解温度为110～140℃，消解时间为20～60min。3.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中，标准系列溶液是将l-羟脯氨酸标准品溶于水所得的浓度在1-1000mg/l之间的至少五组不同浓度的子溶液。4.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s2具体如下：取所述待测样品200μl上清液至刻度试管中并用氮气吹干，向试管中加入200μl 0.1mol/l盐酸进行涡旋溶解，得到预备待测液；随后向所述标准系列溶液和所述预备待测液的各试管中加入含0.1mol/l异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl以及含1mol/l三乙胺的乙腈溶液100μl，涡旋混合后并于10～40℃水浴衍生10～60min，接着向各试管中加入质量分数为50％的乙腈溶液并定容至1ml，过0.22μm滤膜备用。5.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s3中高效液相色谱的条件如下：流动相a：钠离子浓度为0.1mol/l的乙酸钠缓冲液，利用冰乙酸调节ph至6.3～6.7；流动相b：甲醇；所述流动相a与所述流动相b按照下述体积比进行梯度洗脱：第0min时加入95％的流动相a和5％的流动相b，第8min时加入95％的流动相a和5％的流动相b，第20min时加入20％的流动相a和80％的流动相b，第26min时加入95％的流动相a和5％的流动相b；洗脱时的流速为1.0ml/min。6.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s3中紫外检测器的检测波长为210～270nm。7.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s3中高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和保护柱；所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为3μm、150mm
×
4.6mm，所述保护柱的规格为3μm、12.5mm
×
4.6mm。8.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s3中高效液相色谱的色谱柱的柱温为20～40℃，进样量为10～50μl。9.根据权利要求1所述的肉及肉制品中l-羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤s3具体如下：
将标准系列溶液中不同浓度的子溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积；随后以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；接着将待测样品注入液相色谱仪中，得到峰面积，并根据所述标准曲线，得到待测样品中l-羟脯氨酸的质量浓度。

技术总结
本发明公开了一种肉及肉制品中L-羟脯氨酸的检测方法，属于食品检测领域。方法包括将样品使用微波消解仪进行消解，利用L-羟脯氨酸标准品得到不同浓度的标准系列溶液；将标准系列溶液和待测样品分别与异硫氰酸苯酯进行衍生；采用高效液相色谱-紫外检测方法，分离检测L-羟脯氨酸，得到待测样品和标准系列溶液的色谱图并将两者进行比较，使用外标法对样品中L-羟脯氨酸含量进行测定。本发明的检测方法采用微波消解对样品进行前处理，高效液相色谱进行含量测定，与传统湿法消解相比，微波消解试剂用量少，空气污染小，消解速度快且消解彻底，大大缩短了消解时间，操作方便，简便易行。简便易行。简便易行。


技术研发人员：朱帅 郑仕剑 余荣璐 张水锋 盛华栋
受保护的技术使用者：浙江方圆检测集团股份有限公司
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/9