一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法

1.本发明属于功能性纳米生物技术领域，具体涉及一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法。


背景技术：

2.槲皮素是一种广泛分布于植物和蔬菜中的多羟基类黄酮化合物。槲皮素分子结构中含有的多个羟基可能在其广泛证明的生物和药理活性中发挥关键作用，例如抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌特性。然而，由于槲皮素低水溶性和在中性和碱性环境中以及在小肠、结肠、肝脏和肾脏中的高度不稳定性，导致槲皮素作为功能型活性物质的使用受到其生物利用度差的限制。因此，有必要开发有效的递送体系来提高槲皮素的溶解度和生物可及性。
3.近年来，纳米包埋技术在功能食品、化妆品和医药等材料加工中的应用备受关注。各种纳米尺度的递送体系如纳米颗粒悬浮液、纳米乳液在改善难溶性药物及其他活性成分的生物利用度上显示了巨大的应用潜力。纳米包埋技术可以用来保护生物活性物质，并改善活性物质的释放率和稳定性，同时具有靶向输送和细胞高效吸收的功能优势。目前已使用蛋白质作为模板对多种类型的营养物质（如类胡萝卜素、多酚、功能性脂肪酸、维生素）进行了有效包埋。
4.大豆乳清蛋白是大豆乳清废水的主要成分，具有优异的溶解性、发泡性和高营养价值，但天然大豆乳清蛋白很难满足所有的加工需求，因此需要对其适当改性。超声作为一种新兴的非热加工物理技术，由于其特殊的空化、加热、动态搅拌、剪切应力和湍流等特性，被广泛应用于许多研究领域。大量研究证实，超声处理能改变蛋白质分子结构，破坏蛋白质分子内部的共价键和非共价键，适当的超声处理可以改善蛋白质的功能特性。因此，开发利用大豆乳清蛋白可以很大程度上提高大豆蛋白产业的附加值，拓宽食品加工业中的应用。基于上述背景，探讨采用纳米技术将大豆乳清蛋白应用于纳米颗粒和药物载体方面将有广阔的前景。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供是一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法。
6.本发明的另一目的在于提供上述方法制备的负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒，其包括以下步骤：1）大豆乳清蛋白原液的制备：将大豆乳清蛋白溶解于去离子水中，搅拌，冷藏；大豆乳清蛋白的浓度为10 mg/ml；大豆乳清蛋白溶于去离子水后，室温搅拌2-4 h，然后于4℃水化12 h，待恢复室温后，调节ph为7.0制得大豆乳清蛋白原液；2）负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备：将槲皮素粉末溶于无水乙醇中磁力搅拌30 min后，加入到步骤1）制得的大豆乳清蛋白原液中，于室温下搅拌均匀，得到负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒；
3）大豆乳清蛋白的超声预处理：将步骤1）制得的蛋白原液超声处理10 min，超声中使用冰水浴控制样品温度；4）负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备：将槲皮素粉末溶于无水乙醇中磁力搅拌30 min后，加入到3）制得的超声改性大豆乳清蛋白溶液中，于室温下搅拌均匀，得到负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒。
7.进一步地限定，所述步骤2）和4）所述的槲皮素溶于乙醇的浓度为10 mm，最终样品中槲皮素的浓度为100 μm。
8.进一步地限定，所述步骤2）和4）所述的搅拌是在300-600 r/min下搅拌2 h。
9.进一步地限定，所述步骤3）所述的超声处理，超声功率为300 w。
10.进一步地限定，所述步骤3）所述的使用冰水浴控制样品温度，是将温度控制低于25℃。
11.优点和有益效果：
12.1）本发明利用大豆乳清废水中提出的大豆乳清蛋白作为载体材料来负载槲皮素，有助于减少环境污染和浪费，提高大豆蛋白产业的附加值。
13.2）本发明制备的负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒可以实现对槲皮素的有效包埋和高效输送，可对槲皮素在功能性食品中的生产应用有重要价值。
14.3）本发明负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备方法，操作简便，不涉及有毒有害试剂，安全高效，适合食品、药品等领域的生产应用。
附图说明
15.附图1不同纳米颗粒的平均粒径结果；附图2不同纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱结果；附图3不同纳米颗粒的abts
+
自由基清除能力评定结果；附图4不同纳米颗粒的dpph自由基清除能力评定结果；附图5流程图。
16.具体实施方式：为了更好的介绍本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案及达到的有益效果，现结合具体实施方式作进一步阐述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
17.大豆乳清蛋白的制备方法：将脱脂豆粕破碎成粉，与去离子水按1:10（w/w）的比例混合；调节ph值至8.0，搅拌2 h，离心（9000 r/min, 30 min），收集上清液调节ph值至4.5，搅拌30 min，离心（9000 r/min, 15 min），取上清液，将上清液ph值调至8.0，离心（9000 r/min, 15 min），去除不溶性物质，得到大豆乳清溶液。用硫酸铵对大豆乳清溶液进行盐析（80%饱和度），离心（9000 r/min, 30 min），并将得到的沉淀重新溶解于去离子水中，调节溶液ph值为7.0，透析（截留分子量3500 kda，4 ℃）48 h；冻干制得大豆乳清蛋白。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。
18.实施例1：制备天然大豆乳清蛋白纳米颗粒：取大豆乳清蛋白2.0 g溶于200 ml去离子水中，搅拌2 h，置于4℃水化12 h使蛋白充分溶解，待恢复室温后调节溶液ph为7.0。此时处理得到的大豆乳清蛋白纳米颗粒的粒径为410.60
±
25.89 nm，对于abts
+
和dpph自由基清除能力最弱，分别为38.62
±
0.42%和22.91
±
0.63%。
19.实施例2：制备负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒：取大豆乳清蛋白2.0 g溶于200 ml去离子水中，搅拌2 h，置于4℃水化12 h使蛋白充分溶解，待恢复室温后调节溶液ph为7.0。将槲皮素粉末溶于无水乙醇中，制得10 mm的槲皮素无水乙醇溶液。将1ml槲皮素无水乙醇溶液入到100 ml ph 7.0的大豆乳清蛋白溶液中，于室温下搅拌2 h，最终得到负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒。此时纳米颗粒的粒径增加到821.43
±
26.62 nm，红外光谱中蛋白峰位发生变化，槲皮素的特征吸收峰被掩盖，说明成功制备了负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒；该纳米颗粒的抗氧化性较天然大豆乳清蛋白纳米颗粒显著提高，对于abts
+
和dpph自由基清除能力分别提高到54.21
±
0.84%和51.53
±
0.94%。
20.实施例3：制备超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒：取大豆乳清蛋白2.0 g溶于200 ml去离子水中，搅拌2 h，置于4℃水化12 h使蛋白充分溶解，待恢复室温后调节溶液ph为7.0。将溶液置于冰水浴中进行超声处理，处理条件为300 w，10 min。此时处理得到的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒的粒径为439.25
±
53.07 nm；红外光谱中峰位由天然蛋白的3291.58 cm-1
红移到3293.51 cm-1
，表明超声处理对大豆乳清蛋白的影响与氢键有关；且超声处理后蛋白对于abts
+
和dpph自由基清除能力较天然蛋白分别提高到43.19
±
0.63%和29.60
±
2.32%。
21.实施例4：制备负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒：取大豆乳清蛋白2.0 g溶于200 ml去离子水中，搅拌2 h，置于4℃水化12 h使蛋白充分溶解，待恢复室温后调节溶液ph为7.0。将溶液置于冰水浴中进行超声处理，处理条件为300 w，10 min。将槲皮素粉末溶于无水乙醇中，制得10 mm的槲皮素无水乙醇溶液。将1ml槲皮素无水乙醇溶液入到100 ml ph 7.0的超声改性大豆乳清蛋白溶液中，于室温下搅拌2 h，最终得到负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒。此时纳米颗粒的粒径为595.16
±
18.12 nm，较例3中纳米颗粒略有增加，但比例2中复合纳米颗粒显著减少；同时红外光谱中蛋白峰位发生变化，槲皮素的特征吸收峰被掩盖，说明成功制备了负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒；该纳米颗粒的抗氧化性最高，对于abts
+
和dpph自由基清除能力较天然蛋白分别提高到56.32
±
0.56%和58.15
±
1.02%。

技术特征：
1.一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）大豆乳清蛋白原液的制备：将大豆乳清蛋白溶解于去离子水中，搅拌，冷藏；大豆乳清蛋白的浓度为10 mg/ml；大豆乳清蛋白溶于去离子水后，室温搅拌2-4 h，然后于4℃水化12 h，待恢复室温后，调节ph为7.0制得大豆乳清蛋白原液；2）负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备：将槲皮素粉末溶于无水乙醇中磁力搅拌30 min后，加入到步骤1）制得的大豆乳清蛋白原液中，于室温下搅拌均匀，得到负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒；3）大豆乳清蛋白的超声预处理：将步骤1）制得的蛋白原液超声处理10 min，超声中使用冰水浴控制样品温度；4）负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备：将槲皮素粉末溶于无水乙醇中磁力搅拌30 min后，加入到3）制得的超声改性大豆乳清蛋白溶液中，于室温下搅拌均匀，得到负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤2）和4）所述的槲皮素溶于乙醇的浓度为10 mm，最终样品中槲皮素的浓度为100 μm。3.根据权利要求1所述的一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤2）和4）所述的搅拌是在300-600 r/min下搅拌2 h。4.根据权利要求1所述的一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的超声处理，超声功率为300 w。5.一根据权利要求1所述的一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的使用冰水浴控制样品温度，是将温度控制低于25℃。6.一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒，其特征在于：是由权利要求1-5任一项所述的方法制得。7.权利要求6所述的负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒在食品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种负载槲皮素的大豆乳清蛋白基纳米颗粒的制备方法，属于功能性纳米生物技术领域，其制法包括以下步骤：1）大豆乳清蛋白原液的制备；2）负载槲皮素的大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备；3）大豆乳清蛋白的超声预处理；4）负载槲皮素的超声改性大豆乳清蛋白纳米颗粒的制备。本发明利用大豆乳清废水中提出的大豆乳清蛋白作为载体材料负载槲皮素，有助于减少环境污染和资源浪费，提高大豆蛋白产业的附加值，并且制备方法简单，未使用有毒有害试剂，安全环保绿色，同时可以实现对槲皮素的有效包埋和高效输送，显著提高槲皮素在功能性食品中的生产应用价值。品中的生产应用价值。品中的生产应用价值。


技术研发人员：王欢 曹昕汝 郑乐喜 曹佳 任鲲宇 田甜
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/9