一种佛罗里达鲳鲹性别鉴定位点、引物、方法及应用

18219546-1-r的核苷酸序列如seq id no：4所示。
13.所述上游引物tca-tov3-18219546-1-f的核苷酸序列为：
14.gcgtcttttagagtgcgtga(如seq id no：3所示)。
15.所述下游引物tca-tov3-18219546-1-r的核苷酸序列为：
16.ccaacccacaccagcattac(如seq id no：4所示)。
17.本发明还提供了一种佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定试剂盒，所述试剂盒包括所述引物。
18.本发明佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒的成功开发，为佛罗里达鲳鲹活体性别鉴定的广泛应用提供了工具；可促进对佛罗里达鲳鲹性别决定、性别控制等研究工作的开展和育种工作的开展。
19.本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用一代测序进行佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，包括以下步骤：提取待测佛罗里达鲳鲹的基因组dna，采用上述的引物或试剂盒，以基因组dna为模板，进行pcr扩增，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，电泳结果表明，雌性佛罗里达鲳鲹扩增出一个条带。
20.pcr扩增时，采用的pcr反应体系优选为：20ng/μl dna模板1.0μl，10
×
taq buffer，mg
2+
free，2.5μl，浓度为2.5mm的dntps 2.0μl，浓度为25mm的mgcl
2 1.5μl，浓度为10mm的正向引物和反向引物各0.5μl，浓度为5u/μl的taq 0.1μl，ddh2o补齐25.0μl。
21.pcr扩增时，采用的pcr反应程序优选为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸60sec，循环35次，72℃延伸10min。
22.采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，电泳结果表明，雌性佛罗里达鲳鲹扩增出一个条带，条带大小在200～300bp之间。
23.本发明还提供了一种利用二代测序进行佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，包括以下步骤：
24.(1)提取待测佛罗里达鲳鲹的基因组dna；
25.(2)利用第二代测序技术对获得的dna进行重测序；
26.(3)利用基因型分型软件对上述的位点tca-tov3-18219546进行分型；
27.(4)通过分析tca-tov3-18219546位点的基因型判断性别。
28.其中雌性个体基因型为gacca/g，雄性个体基因型为g/g。
29.本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述位点、引物、试剂盒以及方法在佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定中的应用。
30.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
31.(1)本发明设计的佛罗里达鲳鲹性别特异性分子标记引物，特异性好，灵敏度好，准确度高，鉴定成功率高达100％；
32.(2)本发明方法可一次性快速批量准确鉴定佛罗里达鲳鲹尤其是生长早期佛罗里达鲳鲹的性别；
33.(3)本发明位点、引物、试剂盒和方法对于佛罗里达鲳鲹性别决定、性别控制具有重要的科研价值和实际应用价值。
附图说明
34.图1为实施例1中1雌1雄两个个体在tca-tov3-18219546位点第二代测序序列比对图，上图为雄性，下图为雌性，雄性个体测序序列均包含缺失序列，雌性个体存在两种测序序列，框中黑线细线表示缺失，灰色宽线表示不存在缺失；
35.图2为实施例2中利用tca-tov3-18219546-1引物对佛罗里达鲳鲹个体进行琼脂糖凝胶电泳的电泳图，雌性条带中包含两种dna，大小分别为229bp和225bp，雄性条带中包含一种dna，大小为225bp，因琼脂糖凝胶电泳分辨率有限，均显示为一条明亮的带，从左数第一条泳道表示marker100，第二条泳道表示雄性个体，第三条泳道表示雌性性个体；
36.图3为实施例2中采用tca-tov3-18219546-1引物双向扩增一雌一雄两个个体扩增产物测序峰图，前两条峰图为杂合峰，说明是雌性个体，后两条峰为重合峰，说明是雄性个体，其中第一、三条峰图使用正向引物tca-tov3-18219546-1-f进行测序，第二、四条峰图使用反向引物tca-tov3-18219546-1-r进行测序。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
38.实施例1
39.收集佛罗里达鲳鲹2个个体，包括1个雌性和1个雄性，性别通过解剖鉴定。提取基因组总dna进行二代重测序(illumina公司)，利用bwa软件将测序序列比对到tca-tov3-18219546序列(ncbi数据库：gca_022709315.1)，利用integrative genomics viewer观察比对情况，如图1所示，雌性个体在位点tca-tov3-18219546具有两种测序序列，一种包含缺失，一种不包含缺失，雄性个体在位点tca-tov3-18219546仅具有一种测序序列，均存在缺失。
40.位点tca-tov3-18219546位于如seq id no：1-2所示序列中的第248位，所述位点tca-tov3-18219546具有两个等位基因，其中雌性个体基因型为gacca/g，如seq id no：1中所示，雄性个体基因型为g/g，如seq id no：2中所示，雄性存在一个四碱基acca的缺失变异。
41.tattagaaacagcacactaatgccaggtagggctttcctttgctctcacagcagcttcaggtcattgtgcatgcacagattccacatgatgttggaaatattcctttgacattctggtccatgttgacatgatcgattgtgtttagtctatgccacaatgaggaacctggccaagaaggagcgtcttttagagtgcgtgaaaggcctgcacaaggacaccttggacattctccaaatggacgtgact[gacca/g]acagtccattcttgatgcaagggacaaggttgtggagaagcgtgtggacatactgggtatgcctaagtgtcagtgtgttgttaggaagattgcagtttctgtatgttaatgagctttatcctcacaacttacagtgtgtaatgctggtgtgggttggatggggccgctggagctgcagtccttggactccatgaggcacattctggaggtcaacctcttaggtaccatccagaccattca(如seq id no：1-2所示)。
[0042]
方括号中即为用于性别鉴定的位点，方括号内用斜线分割两个等位基因，其中雌性个体基因型为gacca/g，雄性个体基因型为g/g。
[0043]
因此，该位点是佛罗里达鲳鲹的性别决定位点，在基因组范围内具有唯一性，可以
利用基因型分型软件对位点tca-tov3-18219546进行分型，通过分析tca-tov3-18219546位点的基因型判断性别。
[0044]
合成用于扩增位点tca-tov3-18219546的引物tca-tov3-18219546-1，该引物tca-tov3-18219546-1包括正向引物tca-tov3-18219546-1-f和反向引物tca-tov3-18219546-1-r，其中：
[0045]
正向引物tca-tov3-18219546-1-f为5
’‑
gcgtcttttagagtgcgtga-3’(如seq id no：3所示)。
[0046]
反向引物tca-tov3-18219546-1-r为5
’‑
ccaacccacaccagcattac-3’(如seq id no：4所示)。
[0047]
本实施例也可以将上述引物加上pcr常规扩增试剂制成试剂盒。
[0048]
实施例2
[0049]
一种佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定方法，包括以下步骤：提取待测佛罗里达鲳鲹的基因组dna，以提取的基因组dna为模板，利用实施例1中合成的引物tca-tov3-18219546-1进行pcr扩增，采用sanger法(第一代测序技术)对扩增产物测序，根据峰型鉴定雌雄个体。
[0050]
本实施例的实施对象是佛罗里达鲳鲹，取1个雌性和1个雄性，性别通过解剖鉴定，然后来验证该引物的可行性。
[0051]
(1)dna的提取
[0052]
从佛罗里达鲳鲹活体上剪取约1平方厘米鳍条(该过程对于佛罗里达鲳鲹活体无实质性伤害，采样后佛罗里达鲳鲹个体重新放回后经观察可健康生长)，保存于95％酒精，采样后佛罗里达鲳鲹个体重新放回。
[0053]
利用市售dna提取试剂盒或者常规酚仿法等提取组织dna。
[0054]
(2)佛罗里达鲳鲹别特异性标记的扩增
[0055]
以实施例1中合成的引物tca-tov3-18219546-1的正向引物tca-tov3-18219546-1-f(5
’‑
gcgtcttttagagtgcgtga-3’)和反向引物tca-tov3-18219546-1-r(5
’‑
ccaacccacaccagcattac-3’)为扩增引物，以提取的佛罗里达鲳鲹dna为模板，用普通的taq酶进行pcr扩增。
[0056]
pcr的反应体系为：20ng/μl dna模板1.0μl，10
×
taq buffer(mg
2+
free)2.5μl，浓度2.5mmdntps 2.0μl，浓度25mm mgcl
2 1.5μl，10mm正向引物和反向引物各0.5μl，5u/μl taq 0.1μl，ddh2o补齐25.0μl；
[0057]
pcr反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸60sec，循环35次，72℃延伸10min。
[0058]
(3)扩增片段sanger法检测
[0059]
将步骤(2)中的扩增产物进行电泳检测扩增片段，如图2所示，雌性条带中包含两种dna，大小分别为229bp和225bp，雄性条带中包含一种dna，大小为225bp，因琼脂糖凝胶电泳分辨率有限，仅显示为一条明亮的带。
[0060]
利用自动测序仪进行测序，观察峰型，如图3所示，前两条峰图为杂合峰，说明是雌性个体，后两条峰为重合峰，说明是雄性个体，其中第一、三条峰图使用正向引物tca-tov3-18219546-1-f进行测序，第二、四条峰图使用反向引物tca-tov3-18219546-1-r进行测序。因此，峰型为杂合峰的个体是雌性，峰型是纯合峰(重合峰)的个体是雄性。
[0061]
利用相同方法对21个待测佛罗里达鲳鲹个体进行性别鉴定，基因型分型结果与解剖鉴定结果100％一致。
[0062]
因此，可以将实施例1-2中的位点、引物、试剂盒以及方法应用在佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定中。
[0063]
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定位点，其特征是：所述位点为位点tca-tov3-18219546，所述位点tca-tov3-18219546位于如seq id no：1-2所示序列中的第248位，所述位点tca-tov3-18219546具有两个等位基因，其中雌性个体基因型为gacca/g，如seq id no：1中所示，雄性个体基因型为g/g，如seq id no：2中所示，雄性存在一个四碱基acca的缺失变异。2.一种佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定引物，其特征是：所述引物用于扩增权利要求1中所述位点tca-tov3-18219546，所述引物为tca-tov3-18219546-1，所述引物tca-tov3-18219546-1包括上游引物tca-tov3-18219546-1-f和下游引物tca-tov3-18219546-1-r，其中所述上游引物tca-tov3-18219546-1-f的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述下游引物tca-tov3-18219546-1-r的核苷酸序列如seq id no：4所示。3.一种佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定试剂盒，其特征是：所述试剂盒包括权利要求2中的引物。4.一种利用一代测序进行佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：提取待测佛罗里达鲳鲹的基因组dna，采用权利要求2中的引物或权利要求3中的试剂盒，以基因组dna为模板，进行pcr扩增，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物，电泳结果表明，雌性佛罗里达鲳鲹扩增出一个条带。5.根据权利要求4所述佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，其特征是：pcr扩增时，采用的pcr反应体系为：20ng/μl dna模板1.0μl，10
×
taq buffer，mg
2+
free，2.5μl，浓度为2.5mm的dntps 2.0μl，浓度为25mm的mgcl
2 1.5μl，浓度为10mm的正向引物和反向引物各0.5μl，浓度为5u/μl的taq 0.1μl，ddh2o补齐25.0μl。6.根据权利要求4所述佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，其特征是：pcr扩增时，采用的pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸60sec，循环35次，72℃延伸10min。7.根据权利要求4所述佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，其特征是：条带大小在200～300bp之间。8.一种利用二代测序进行佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：(1)提取待测佛罗里达鲳鲹的基因组dna；(2)利用第二代测序技术对获得的dna进行重测序；(3)利用基因型分型软件对权利要求1中的位点tca-tov3-18219546进行分型；(4)通过分析tca-tov3-18219546位点的基因型判断性别。9.权利要求1所述位点、权利要求2所述引物、权利要求3所述试剂盒以及权利要求4-8任一项所述方法在佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定中的应用。

技术总结
本发明公开了一种佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定位点，位点Tca-Tov3-18219546位于如SEQ ID NO：1～2所示序列中的第248位，具有两个等位基因，雌性个体基因型为GACCA/G，雄性个体基因型为G/G，雄性存在一个四碱基ACCA的缺失变异。还公开了用于扩增所述位点的引物、试剂盒，以及利用该位点、引物或试剂盒进行佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定的方法和它们在佛罗里达鲳鲹性别快速鉴定中的应用。该引物特异性好，灵敏度好，准确度高，鉴定成功率高达100％；该方法可一次性快速批量准确鉴定佛罗里达鲳鲹尤其是生长早期佛罗里达鲳鲹的性别；对于佛罗里达鲳鲹性别决定、性别控制具有重要的科研价值和实际应用价值。实际应用价值。


技术研发人员：郭梁 何海蓉 黄蓉 沈中源 饶科
受保护的技术使用者：湖南师范大学
技术研发日：2023.01.31
技术公布日：2023/8/9