SIRT1激动剂及其在相关疾病治疗中的应用

sirt1激动剂及其在相关疾病治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种sirt1激动剂及其在相关疾病治疗中的应用。


背景技术：

2.sirtuins去乙酰化酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)作为辅助因子催化蛋白的去乙酰化，同时将nad
+
分解为烟酰胺(nam)和2'-o-酰基-adp-核糖(oaadpr)。人体中已发现的sirtuins有七种亚型(sirt1-sirt7)，它们具有不同的亚细胞定位和功能，其中sirt1分布于脑、心脏、肾脏、肝、视网膜、子宫、骨骼肌、血管和脂肪等组织中，主要位于细胞核，也可通过核质转运至细胞质，在生理过程中发挥着重要作用，主要体现在几个方面：1)sirt1通过对组蛋白的去乙酰化、调节组蛋白及其修饰酶的表达和活性来影响染色质凝聚，调控基因的转录和表达；2)sirt1通过调节foxo3a、lkb1、p53的乙酰化水平,参与dna损伤修复和机体衰老过程；3)sirt1对于胚胎和大脑发育非常重要，sirt1基因缺失的小鼠受精卵只有20％可发育成熟，但是发育迟缓，眼睛和心脏有畸形，且有无脑儿出现；另外，sirt1对于创伤性脑损伤和阿尔茨海默氏症中的神经元也具有保护作用；4)心肌细胞中sirt1组织特异性高表达可减少心肌梗死所影响范围并能促进肌体恢复；5)pgc-1α抑制糖酵解基因的表达以及葡萄糖激酶g6p和丙酮酸激酶pepck的活性，sirt1通过对pgc-1α的去乙酰化，使其与hnf4α形成复合物以调节糖异生相关基因的表达和pepck、g6p的活性，促进肝糖代谢；6)上调sirt1可促进foxo3a去乙酰化，从而抑制puma，减轻急性肾损伤(aki)；7)sirt1通过增加溶酶体数量和去乙酰化溶酶体相关蛋白，促进原代星形胶质细胞中的β-淀粉样肽(aβ)降解，这利于减轻阿尔茨海默病(ad)症状。此外，在亨廷顿病(hd)小鼠模型中，sirt1的特异性敲除可导致脑病理恶化，而sirt1的过度表达可提高存活率。由此可见，sirt1的多效性使其成为缓解衰老症状、预防和治疗与老化相关疾病(如炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病和癌症)所关注的一个热点靶标。为此，发展强效、高选择性的sirt1激动剂，促进sirt1去乙酰化酶反应，可应用于相关疾病的治疗。
3.迄今已报道了几种sirt1激动剂，其中之一是天然产物白藜芦醇，关于白藜芦醇是否是真正的sirt1激活剂，过去曾存在争议，因为白藜芦醇表现出来的活性实际上是由于它与底物乙酰化赖氨酸后面的荧光基团存在相互作用而造成的，如果乙酰化底物上没有荧光基团或类似性质的化学基团，白藜芦醇对sirt1酶活没有影响。另外，人工合成的一些所谓sirt1激动剂，如srt1720，在饮食诱导肥胖或基因突变(lepob/ob)小鼠中可提高胰岛素敏感性，降低血糖水平，增加线粒体容量，但在体内它并非直接作用于sirt1而是经由其它信号通路发挥作用；具有相同化学骨架的化合物srt2104在口服给药时表现出不佳药代动力学特性。另外，1,4-二氢吡啶衍生物、15-恶唑并[4,5-b]吡啶和相关杂环类似物也有被报道为sirt1激动剂。这些化合物对sirt1所表现出来的活性都依赖于乙酰化赖氨酸后面的荧光基团，只有当底物的乙酰化赖氨酸残基后面紧跟香豆素(coumarin，amc)、罗丹明(tamra)荧光基团或其它类似化学基团时，酶学实验才能观察到这些化合物对sirt1酶活的促进作用，
因此，现在人们认为这些化合物并非真正的sirt1激动剂。即使这些化合物在细胞或动物模型上能够促进sirt1生理底物的去乙酰化，那也是通过其他信号通路引起的，并非作用于sirt1。这些化合物其中有些曾以sirt1激动剂名义进入i期临床，这说明，sirt1激动剂的确具有临床应用前景，也说明发展真正sirt1激动剂的重要性和迫切性。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种sirt1激动剂，能够促进sirt1酶活。
[0005]
本发明的第一方面，提供一种通式(i)所示的化合物，
[0006]
x0-x1-x2-x3
ꢀꢀꢀ(i)[0007]
式中，x0为半胱胺酸或半胱胺酸前体procysteine；
[0008]
x1为任意氨基酸或氨基酸类似物；
[0009]
x2为精氨酸或赖氨酸；
[0010]
x3不存在，或为任意化学基团、氨基酸、氨基酸类似物或羧基端带有化学基团修饰的氨基酸或氨基酸类似物。
[0011]
在另一优选例中，所述化学基团选自下组：酰胺化、糖基化、醇基化、醛基化、酮基化、环氧酮基化、异羟肟酸肽、酯基化、n-烷基化、巯基乙胺化、amc、afc、pna、peg、dap(dnp)、lys(dye)、rh110。
[0012]
在另一优选例中，x1选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、以及侧链带保护基的上述氨基酸类似物或其非蛋白源性氨基酸类似物。
[0013]
在另一优选例中，x3选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、以及侧链带保护基的上述氨基酸类似物或其非蛋白源性氨基酸类似物。
[0014]
在另一优选例中，所述氨基酸类似物选自：β-氨基酸、α,α-双取代氨基酸、非α-氨基酸、仲胺型氨基酸、α,β-双氨基酸、含硫氨基酸、含卤素氨基酸、freidinger型氨基酸。
[0015]
在另一优选例中，α,α-双取代氨基酸中取代基各自独立地为卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、取代或未取代的c1-c12烷基、取代或未取代的c2-c12不饱和烃基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c1-c6酰基、取代或未取代的c3-c12环烃基、-l1-(ch2)m-取代或未取代的c6-c12芳基、-l1-(ch2)m-取代或未取代的3-12元杂环基、-l1-(ch2)m-c(＝o)-n(r8)(r9)，其中，l1为无、-o-或-s-；m为0、1、2、3、4或5；r8和r9各自独立地选自：氢、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的3-12元杂环基、或取代或未取代的c6-c12芳基；
[0016]
上述各取代是指包含选自下组的一个或多个取代基：卤素、羟基、苯基、c1-c12烷基、c1-c12卤代烷基、c2-c12不饱和烃基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷氧基、c3-c12环烃基、3-12元杂环基、氰基、硝基、羟甲基、羧基、巯基。
[0017]
在另一优选例中，x0、x1、x2、x3各自独立地为l-型、d-型或dl-型。
[0018]
在另一优选例中，x0为半胱胺酸，x1为色氨酸，x2为精氨酸，x3不存在时，x0、x1、x2
不同时为l-型。
[0019]
在另一优选例中，x0为半胱胺酸；
[0020]
x1为色氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸、半胱胺酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸；
[0021]
x2为精氨酸或天冬酰胺；
[0022]
x3为精氨酸、谷氨酸或色氨酸。
[0023]
本发明的第二方面，提供一种药物组合物，所述组合物包含第一方面所述的化合物以及药学上可接受的载体。
[0024]
本发明提供新型的化合物，可以单独使用，或者将其与可药用的辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等。该药物组合物可以按照制药学上常规方法制得。
[0025]
在另一优选例中，所述药物组合物进一步包含至少一种其他治疗剂。优选地，所述药物组合物中包含的所述至少一种其他治疗剂选自其他抗癌剂、免疫调节剂、抗炎剂、降糖剂、抗过敏剂、止吐剂、疼痛缓解剂、细胞保护剂及其组合。
[0026]
本发明的第三方面，提供第一方面所述的化合物或第二方面所述的药物组合物的用途，(a)用于制备sirt1激动剂；或(b)用于制备治疗与sirt1酶活性相关疾病的药物。
[0027]
在另一优选例中，所述与sirt1酶活性相关疾病选自：炎症、covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病。
[0028]
本发明的第四方面，提供一种体外非治疗性激动sirt1酶的方法，述方法包括向有此需要的体系中加入第一方面所述的化合物或第二方面所述的药物组合物。
[0029]
本技术提供含有x0-x1-x2-x3(如(cys/procysteine)-x1-(arg/lys)、(cys/procysteine)-x1-(arg/lys)-x3)氨基酸序列通式的化学结构及其拟肽或包含有这些氨基酸序列通式或其拟肽的化合物，其中x1为任意氨基酸或氨基酸类似物，x3不存在或为任意化学基团、氨基酸、氨基酸类似物或羧基端带有化学基团修饰的氨基酸或氨基酸类似物，序列中的氨基酸残基可以是l-型氨基酸、d-型氨基酸；该专利不涵盖全l-型氨基酸cys-trp-arg多肽(其n-端、c-端未做化学修饰)，但涵盖cys-trp-arg的拟肽或包含此氨基酸序列或其拟肽的化合物，其中的氨基酸残基可以是l-型氨基酸、d-型氨基酸。本技术化合物作为sirt1激动剂，不同于之前报道的所谓“sirt1激动剂”，其对sirt1酶活的促进作用不依赖于底物上乙酰化赖氨酸后面的化学基团，是真正的sirt1激动剂，cys氨基酸残基的-nh2及侧链上的-sh通过与sirt1酶反应产物oaadpr糖环上c1
′
原子形成可逆的共价结合，促进反应产物从酶复合物体解离出来，从而促进sirt1酶反应。本技术化合物对sirt1具有高度亚型选择性，能够用于炎症、covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病等相关疾病的治疗。
[0030]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0031]
图1中a)示出检测sirt1催化amc标记乙酰肽去乙酰反应的荧光实验原理。trypsin为胰蛋白酶；b)为采用amc荧光检测方法测定本技术的化合物及白藜芦醇(resveratrol)促进sirt1酶反应的剂量-效应曲线。图中所示为相对活性，初始酶活性(即不加化合物)设置为1，当其值达到1.5时，即为化合物的ec
1.5
。
[0032]
图2中a)示出检测sirt1催化abz标记乙酰肽去乙酰反应的荧光实验原理。trypsin为胰蛋白酶；b)为采用abz荧光检测方法测定本技术的化合物及白藜芦醇(resveratrol)促进sirt1酶反应的剂量-效应曲线；c)为hplc分析结果，表明化合物cerw促进sirt1对gqstsrhkk
ac
lm多肽的去乙酰化反应。
[0033]
图3中a)为amc荧光检测方法测定化合物cwr对sirt1、sirt2、sirt3、sirt5、sirt6酶反应的剂量-效应曲线；b)为amc荧光检测方法测定cwr对sirt3、sirt3
r158m
酶反应的剂量-效应直方图。
[0034]
图4中a)示出化合物促进sirt1酶反应的机制：化合物的cys氨基酸残基n端α-氨基氮、侧链巯基与sirt1酶反应产物oaadpr糖环上c1
′
原子形成可逆共价结合，促进反应产物从酶复合物体解离出来，从而促进sirt1酶反应；b)为amc荧光检测方法测定cwr及其n-端乙酰化类似物对sirt1酶反应的剂量-效应曲线。其中，ac-cwr为n-端乙酰化cwr。
[0035]
图5中a)示出化合物cwr与sirt1的相互作用，红色代表乙酰化肽；绿色、蓝色、黄色和红色分别代表c、n、s、o原子。化合物上半胱氨酸残基n端α-氨基氮、侧链巯基和oaadpr形成噻唑烷环，化合物中的精氨酸被sirt1的glu214、asp292和asp298的酸性氨基酸包围，形成盐桥(或静电)相互作用。虚线框内图：sirt1的保守精氨酸arg274与adpr核糖环c1
′
碳原子间的距离；b-e)依次示出sirt2、sirt3、sirt5、sirt6对应的保守精氨酸与adpr核糖环c1
′
碳原子间的距离。
[0036]
图6示出化合物通过作用于sirt1影响细胞内p53乙酰化水平，其中a-b)对照组用5
‰
(v/v)dmso处理，实验组用10μm dox处理，同时加0μm、5μm、10μm和25μm化合物，其中0μm表示添加等体积的水；c)敲减sirt1后，化合物cdwdrd对细胞内p53乙酰化水平的影响。dox组用10μm dox处理，而对照组用5
‰
(v/v)dmso处理，实验组用10μm dox、25μm cdwdrd和不同浓度的si-sirt1处理(从左到右，浓度逐渐增加)。误差条表示平均值
±
sem(n＝5)*与对照组相比，p《0.05，***p《0.001。newman-keuls事后检验的单因素方差分析。
具体实施方式
[0037]
本技术的发明人经过广泛而深入地研究，研发出一种具有x0-x1-x2-x3(如cys-x1-(arg/lys)、cys-x1-(arg/lys)-x3氨基酸序列)通式结构的化合物，其采用一种全新的作用机制促进sirt1酶活：即cys氨基酸残基的-nh2及侧链上的-sh通过与sirt1酶反应产物oaadpr糖环上c1
′
原子形成可逆的共价结合，促进反应产物从酶复合物体解离出来，从而促进sirt1酶反应。不同于之前报道的所谓“sirt1激动剂”，本技术的化合物对sirt1酶活的促进作用不依赖于底物上乙酰化赖氨酸后面的化学基团，是真正的sirt1激动剂，且残基由l-型氨基酸变为d-型氨基酸，不会导致化合物活性消失，这利于提高其代谢稳定性。另外，这类化合物对sirt1具有高度亚型选择性，它对sirt2、sirt3、sirt5、sirt6酶活没有任何影响。本技术的化合物，作为sirt1激动剂，能够用于炎症、covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心
血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病等相关疾病的治疗。在此基础上，完成了本发明。
[0038]
化合物
[0039]
本技术的化合物，具有如下通式所示的结构：
[0040]
x0-x1-x2-x3(i)
[0041]
式中，x0为procysteine或cys；
[0042]
由于procysteine(ca号：19771-63-2；名称：l-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(l-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid))在体内可被5-oxo-l-prolinase(5-氧代-l-脯氨酸酶)转化为cysteine，因此，本技术涵盖含有(cys/procysteine)-x1-(arg/lys)、(cys/procysteine)-x1-(arg/lys)-x3氨基酸序列通式的化学结构及其拟肽、或含有这些氨基酸序列通式或其拟肽的化合物。
[0043]
x1为任意氨基酸或氨基酸类似物；在另一优选例中，x1选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、以及侧链带保护基的上述氨基酸类似物或其非蛋白源性氨基酸类似物。
[0044]
x2为精氨酸或赖氨酸。
[0045]
x3不存在，或为任意化学基团、氨基酸、氨基酸类似物或羧基端带有化学基团修饰的氨基酸或氨基酸类似物。在另一优选例中，x3选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、以及侧链带保护基的上述氨基酸类似物或其非蛋白源性氨基酸类似物。
[0046]
序列中的氨基酸残基可以是l-型氨基酸、d-型氨基酸。在另一优选例中，x0、x1、x2、x3各自独立地为l-型或d-型。
[0047]
通式i不涵盖全l-型氨基酸cys-trp-arg多肽(其n-端、c-端未做化学修饰)，但涵盖cys-trp-arg的拟肽或含有此氨基酸序列或其拟肽的化合物，其中的氨基酸残基可以是l-型氨基酸、d-型氨基酸。
[0048]
本技术的化合物采用一种全新的作用机制促进sirt1酶活：即cys氨基酸残基的-nh2及侧链上的-sh通过与sirt1酶反应产物oaadpr糖环上c1原子形成可逆的共价结合，促进反应产物从酶复合物体解离出来，从而促进sirt1酶反应。
[0049]
不同于之前报道的所谓“sirt1激动剂”，本技术的化合物对sirt1酶活的促进作用不依赖于底物上乙酰化赖氨酸后面的化学基团，是真正的sirt1激动剂，且残基由l-型氨基酸变为d-型氨基酸，不会导致化合物活性消失，这利于提高其代谢稳定性。
[0050]
另外，这类化合物对sirt1具有高度亚型选择性，它对sirt2、sirt3、sirt5、sirt6酶活没有任何影响。
[0051]
已有研究报道，促进sirt1对于炎症、covid-19、糖尿病、乳腺癌、心血管疾病、急性肾损伤、脑缺血所致神经损伤、神经退行性疾病具有积极的保护作用。本技术的化合物，作为sirt1激动剂，能够用于炎症、covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病等相关疾病的治疗。
[0052]
药物组合物
[0053]
本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全有效量范围内的活性成分，以及药学上可接受的载体。
[0054]
本发明所述的“活性成分”是指本发明所述的式i化合物。
[0055]
本发明所述的“活性成分”和药物组合物，能够促进sirt1酶活，且对sirt1具有高度亚型选择性，它对sirt2、sirt3、sirt5、sirt6酶活没有任何影响，能够用于炎症、covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病等相关疾病的治疗。
[0056]“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。
[0057]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0058]
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
[0059]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
[0060]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0061]
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0062]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0063]
本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物(如抗肿瘤药、消炎药等)联合给药。
[0064]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0065]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件(如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0066]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0067]
氨基酸及缩写如下表所示。
[0068]
名称英文三字母单字母甘氨酸glycineglyg丙氨酸alaninealaa缬氨酸valinevalv亮氨酸leucineleul异亮氨酸isoleucineilei脯氨酸prolineprop苯丙氨酸phenylalaninephef酪氨酸tyrosinetyry色氨酸tryptophantrpw丝氨酸serinesers苏氨酸threoninethrt半胱胺酸cystinecysc蛋氨酸methioninemetm天冬酰胺asparagineasnn谷氨酰胺glutarnineglnq天冬氨酸aspartic acidaspd谷氨酸glutamic acidglue赖氨酸lysinelysk精氨酸arginineargr组氨酸histidinehish
[0069]
多肽化合物的制备
[0070]
本发明中所有多肽均采用wang树脂、基于fmoc的固相方法合成，氨基酸残基的耦联顺序是自羧基端向胺基端(即自右向左)。氨基酸的fmoc脱保护及耦联过程如下：带有fmoc保护的多肽最右端氨基酸残基的wang树脂用20％哌啶处理，脱除fmoc保护；带fmoc保护的多肽右端第二个氨基酸残基在n-甲基吗啉(nmm)存在的情况下被2-(1h-苯并三唑-1-氧基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)活化并与上述树脂反应1小时，从而与树脂上脱fmoc保护的氨基酸耦联。重复上述fmoc脱保护及耦联步骤直至多肽所有氨基酸残基都耦联到树脂上，最后用三氟乙酸(tfa)去除多肽上的fmoc并将其从树脂上切割下来，再通过高效液相色谱(hplc)使用c18 pep rpc反相柱纯化样品得到纯的目标多肽(溶剂a：0.1％tfa/水，溶剂b：0.1％tfa/mecn，流速：10.0毫升/分钟，洗脱梯度：10％
–
90％溶剂b，30分钟)。
[0071]
实施例1
[0072]
含cys-x-(arg/lys)、cys-x-(arg/lys)-x氨基酸序列通式结构的化合物促进sirt1酶反应
[0073]
文献中筛选sirt1激动剂的实验方法普遍采用一种“fluor de lys”(fdl)肽rhkkac amc作为底物(图1中a)。rhkk源于sirt1生理底物p53蛋白的第379-382位氨基酸残基，其中第382位赖氨酸被乙酰化，且在c端连接7-氨基-4-甲基香豆素(amc)，即构成所谓的fdl。然而这种实验方法的缺点是化合物会与荧光基团amc有相互作用，造成化合物促进sirt1酶活的假阳性结果。因此，将采用fdl实验方法找到的“sirt1激动剂”用于体内实验时，可能无法观察到激动活性，原因是，自然状态下sirt1生理底物的乙酰赖氨酸之后并没有荧光基团或类似性质的化学基团。
[0074]
采用fdl方法(图1中a)，将0.5μm sirt1、750μm nad
+
、31.25μm rhkkacamc和不同浓度(0.5μm、1.5μm、4.5μm、13.5μm、40.5μm、121.5μm)的化合物置于酶反应缓冲液(即25mm tris-hcl、ph 8.0、137mm nacl、2.7mm kcl、1mm mgcl2)中，37℃下反应45分钟。然后，添加含有10mm烟酰胺的胰蛋白酶(0.5mg/ml)，在37℃下培养30min。使用酶标仪(polarstar optima，bmg labtech)在340nm激发波长和490nm发射波长下测量荧光，评价了多肽化合物cwr对sirt1酶活有促进作用，ec
1.5
为3.16μm(图1中b)，优于对照化合物白藜芦醇(ec
1.5
为19.2μm)。有趣的是，含有d型氨基酸的肽cdwdrd的活性与cwr相当，而反向d型肽rdw
dcd
没有表现出任何活性。这表明化合物的氨基酸序列对于活性至关重要，即使是氨基酸序列的简单反转也会导致活性消失。
[0075]
为了进一步验证氨基酸手性对活性的影响，组合了具有不同手性的半胱氨酸(cys，c)、色氨酸(trp，w)和精氨酸(arg，r)，但不改变氨基酸序列(包括cdwr、cwdr、cwrd、cdwdr、cdwrd、cwdrd，其中下标d表示d型氨基酸，未带下标的为l型氨基酸)，并测定了它们的活性，发现氨基酸残基由l-型变为d-型不至于造成cwr活性消失(表1)。这些结果表明化合物cwr的活性主要取决于氨基酸序列而非氨基酸手性。
[0076]
表1化合物对sirt1的激动活性
[0077]
[0078][0079]
a ec
1.5
：酶活性提高50％所需化合物浓度
[0080]
b max a：最大激动倍数；
[0081]
c na：“not active”，没有活性
[0082]
实施例2
[0083]
化合物活性与乙酰化底物上荧光基团amc无关
[0084]
为了排除化合物cwr的激活效应是由于化合物和amc的相互作用所致，采用其他分析方法和底物进一步验证了化合物活性。
[0085]
使用乙酰化多肽abz-gvlkacay
no2
gv-nh2为底物，该肽源自氨甲酰磷酸合成酶1(cps1)(图2中a)。将0.05μm sirt1、500μm nad
+
、10μmabz-gvlkacay
no2
gv-nh2和不同浓度(0.5μm、1.5μm、4.5μm、13.5μm、40.5μm、121.5μm)的化合物置于37℃反应30分钟后加入含10mm烟酰胺的胰蛋白酶(0.01mg/ml)，37℃孵育15分钟，在320nm激发波长、420nm发射波长处测量酶反应产物abz-gvlk的荧光(图2中a)，评价化合物对sirt1酶活的影响。
[0086]
实验结果表明，cwr和cdwdrd的活性仍然存在，而rdw
dcd
依然没有活性(图2中b)。相比之下，没有观察到对照化合物白藜芦醇的活性，这进一步证实：与白藜芦醇不同，含cys-x1-(arg/lys)、cys-x1-(arg/lys)-x3氨基酸序列通式结构的化合物对sirt1酶活的促进作用与荧光基团amc无关。
[0087]
由于乙酰化多肽abz-gvlkacay
no2
gv-nh2在氨基端仍有荧光基团abz，为考察化合物在乙酰化底物处于未修饰状态下对sirt1酶反应的影响，采用高效液相色谱(hplc)方法定量分析sirt1酶反应产物的量来评价化合物的活性。不含荧光基团的乙酰化底物(gqstsrhkkaclm)和去乙酰化底物(gqstsrhkklm)在hplc上的保留时间分别为6.8分钟、6.0分钟。在预实验中，发现化合物cwr和去乙酰化底物gqstsrhkklm的保留时间非常接近、难以区分，这妨碍了在化合物cwr存在的情况下对酶反应产物gqstsrhkklm的定量分析，因此，设计合成了另一个化合物cerw，其保留时间与gqstsrhkklm的保留时间明显不同，并且通过fdl方法(图1中a)测得cerw与cwr具有相似的活性(表1)。hplc实验结果如图2中c所示，有化合物cerw的实验组在保留时间6.0min处的峰面积明显大于无cerw的对照组，表明化合物cerw促进了sirt1酶反应，在相同反应条件下，与对照组相比，实验组产生了更多量的去乙酰化肽gqstsrhkklm，这些结果清楚地证明化合物的活性不依赖于底物乙酰化赖氨酸残基后面的荧光基团。
[0088]
实施例3
[0089]
化合物促进sirt1酶反应的机制及对sirt1选择性作用的原因
[0090]
每种sirtuins在生理过程中都有其独特作用，因此发展sirt1激动剂应考虑其选择性。
[0091]
采用实施例1中的分析方法测定了化合物cwr对sirt2/3/5/6的活性(sirt2、sirt3、sirt5、sirt6的浓度分别为0.62μm、1.0μm、1.2μm、5.0μm)，发现对这些酶都没有影响(图3中a)。基于化合物的构效关系，推断化合物cwr对sirt1的高选择性应源自化合物的半胱氨酸与sirt1酶反应产物oaadpr共价结合附近区域的sirt1氨基酸残基(图4中a)，因此，基于化合物cwr的半胱氨酸残基n端α-氨基氮、侧链巯基和oaadpr形成噻唑烷环，采用分子模拟方法将cwr对接到sirt1中(图5中a)。发现cwr中的精氨酸被glu214、asp292和asp298的酸性氨基酸包围，并与这些残基形成盐桥(或静电)相互作用，因此，化合物第三位氨基酸残基侧链带正电荷(如arg、lys)，可增强化合物与sirt1的相互作用。
[0092]
基于化合物与sirt1的结合模型，发现噻唑烷环周围的氨基酸残基在sirt1/2/3/5/6中非常保守。然而，与sirt2/3/5/6相比较，sirt1中adpr(二磷酸腺苷核糖)核糖环的c1
′
碳原子与保守的精氨酸(即sirt1中的arg274)之间的距离与其它sirtuins明显不同。sirt1
的arg274与adpr核糖环的c1
′
之间距离为而sirt2(pdb id:5d7o)、sirt3(pdb id:4bn4)、sirt5(pdb id:4f56)、sirt6(pdb id:3pki)相应的精氨酸与c1
′
分别相距分别相距和(图5中b-e)。推测在sirt2/3/5/6中，这个保守的精氨酸残基与化合物的半胱氨酸残基n端α-氨基氮竞争，攻击oaadpr中核糖环的c1
′
碳原子，从而阻止噻唑烷环的形成，这应是本技术化合物选择性促进sirt1酶反应的原因。
[0093]
为验证这一观点，将sirt3中保守的精氨酸残基arg158突变为met，有趣的是，突变体sirt3
r158m
的酶活性消失，表明保守的arg158对sirt3酶活至关重要，这与上述推测一致。当化合物cwr添加到反应体系中，cwr恢复了突变型sirt3
r158m
酶的活性，并以浓度依赖方式促进sirt3
r158m
酶反应(图3中b)。这表明本技术化合物对sirt1的选择性的确是由于sirt1/2/3/5/6中这个保守的精氨酸残基与oaadpr核糖环的c1
′
之间的距离不同而造成的。
[0094]
实施例4
[0095]
化合物作用于sirt1促进细胞内p53去乙酰化
[0096]
p53是sirt1的生理底物，调节sirt1酶反应可改变p53的乙酰化水平。为了在细胞水平上验证本技术化合物的活性，将人乳腺癌mcf-7细胞放在37℃含有5％co2的增湿培养箱里，在含10％fbs(gibco，产品号：10091-148)的dmem(gibco，产品号：12430-054)培养基中生长。为检测化合物对p53乙酰化水平的影响，用不同浓度的化合物(5μm、10μm、25μm)和10μm的阿霉素(dox)处理mcf-7细胞6小时。作为对照，未加阿霉素、化合物的mcf-7细胞一起培养6小时。然后，用pbs洗涤细胞三次，收集细胞进行western blot分析(p53抗体，abcam，产品号：ab75754；p53(k382乙酰化)抗体，abcam，产品号：ab754)。
[0097]
采用上述实验方法，分别用cdwdrd、swr和阿霉素(dox)一起处理mcf-7乳腺癌细胞，阿霉素可诱导mcf-7细胞凋亡从而产生大量乙酰化p53。结果表明，随着化合物cdwdrd浓度的增加，p53乙酰化水平逐渐降低，而swr不影响p53乙酰化水平(图6中a-b)。
[0098]
接下来，通过基因敲减实验来检测化合物是否通过作用于sirt1促进细胞内p53去乙酰化。将含有8μl脂质体lipo 2000的250μl opti培养基添加到另一含有sirt1 sirna(12nm，24nm，48nm，96nm)的250μl opti培养基中，充分混合并静置20分钟后，将其添加到含有4.5ml dmem培养基的mcf-7细胞中，于37℃、5％co2培养箱中孵育4小时。离心除去培养基，再用5ml含10％fbs的dmem培养基替换，继续培养12小时。再次除去培养基并用5ml无血清dmem培养基替换，25μm cdwdrd和10μm dox与细胞一起培养6小时。作为对照，未加阿霉素、化合物的mcf-7细胞一起培养6小时，而作为dox组，10μm dox与mcf-7细胞一起培养6小时。收集这些样本进行western blot分析。
[0099]
敲减实验结果表明，随着sirt1-sirna浓度的增加，mcf-7中的sirt1表达量逐渐降低(图6中c)，表明sirt1敲减成功。此外，随着sirt1-sirna浓度的增加(15nm、30nm、60nm、120nm)，乙酰化p53表达量逐渐增加，这一结果表明，cdwdrd降低p53乙酰化的作用逐渐减弱，化合物是通过选择性作用于细胞内sirt1来降低p53乙酰化水平。
[0100]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种通式(i)所示的化合物，x0-x1-x2-x3
ꢀꢀꢀ
(i)式中，x0为半胱胺酸或半胱胺酸前体；x1为任意氨基酸或氨基酸类似物；x2为精氨酸或赖氨酸；x3不存在，或为任意化学基团、氨基酸、氨基酸类似物或羧基端带有化学基团修饰的氨基酸或氨基酸类似物。2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，x1选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、以及侧链带保护基的上述氨基酸类似物或其非蛋白源性氨基酸类似物。3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，x3选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、以及侧链带保护基的上述氨基酸类似物或其非蛋白源性氨基酸类似物。4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，x0、x1、x2、x3各自独立地为l-型、d-型或dl-型。5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，x0为半胱胺酸，x1为色氨酸，x2为精氨酸，x3不存在时，x0、x1、x2不同时为l-型。6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，x0为半胱胺酸；x1为色氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸、半胱胺酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸；x2为精氨酸或天冬酰胺；x3为精氨酸、谷氨酸或色氨酸。7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的化合物以及药学上可接受的载体。8.如权利要求1所述的化合物或权利要求7所述的药物组合物用途，其特征在于，(a)用于制备sirt1激动剂；或(b)用于制备治疗与sirt1酶活性相关疾病的药物。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述与sirt1酶活性相关疾病选自：炎症、covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病。10.一种体外非治疗性激动sirt1酶的方法，其特征在于，所述方法包括向有此需要的体系中加入如权利要求1所述的化合物。

技术总结
本发明公开了一种，结构如式I所示，式中，X0、X1、X2、X3的定义如说明书和权利要求书中所述。本发明的化合物，作为SIRT1激动剂，对SIRT1具有高度亚型选择性，能够用于炎症、Covid-19、败血症、糖尿病、癌症、心血管疾病、急性肾损伤、神经损伤、神经退行性疾病等相关疾病的治疗。X0-X1-X2-X3


技术研发人员：刘东祥 余年达
受保护的技术使用者：中国科学院上海药物研究所
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/9