一种快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法

1.本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法。


背景技术：

2.咖啡作为3大无酒精饮料之一，主要是原豆经烘焙、研磨、冲泡或煮沸的方式制成大众休闲饮料，其产量和消费量逐年增加，其中速溶咖啡是从炒磨咖啡豆中提取有效成分后经干燥而生产的，而烘焙咖啡是咖啡豆经烘焙工艺后再加工处理而得到的。咖啡生产过程中产生的有毒物质丙烯酰胺现成为人们关注的焦点问题，丙烯酰胺属于二类致癌物，咖啡饮料中的丙烯酰胺的来源主要集中在烘焙或加热处理阶段。在我国目前标准gb 5009.204-2014和gb 31604.18-2016 中仅是关于“食品中丙烯酰胺的测定”和“食品接触材料及制品丙烯酰胺迁移量的测定”，尚未有明确界定专属于咖啡中丙烯酰胺的限量标准或最大残留限量值规定，国家应建立咖啡中丙烯酰胺的限量标准，咖啡中丙烯酰胺的痕量检测方法的建立是十分必要的。目前，液相色谱-串联质谱法是测定咖啡中丙烯酰胺含量方法中最通用的检测手段，其他检测方法，尤其是快速检测方法，几乎未见报道，而丙烯酰胺主要是咖啡加工过程中产生的，简便、快速的检测方法对咖啡加工过程安全质量的控制具有十分重要的意义。
3.纳米酶是指具有天然酶催化活性的纳米材料。与天然酶相比，纳米酶被称为酶模拟物，是一类具有天然酶功能的纳米材料，具有稳定性高、成本低、催化活性可调等优点，是多种生物传感器的理想候选者。由于铁作为天然辣根过氧化物酶的活性中心，铁基纳米酶受到诸多研究者的青睐，但其纳米酶活性和天然酶比较，还是有一定差距。而纳米酶的重要优点是其活性可以通过掺杂、表面修饰等来调节。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法，该方法以磷钨酸和氯化铜及氯化铁为前驱，微波法合成具有类过氧化酶纳米酶活性的含铜铁磷钨酸纳米酶（cu,fe-pts），fe原子和cu原子的协同作用产生了较大的催化活性面积，在中性条件下，cu,fe-pts纳米酶能在h2o2存在下快速催化tmb底物生成蓝色的ox-tmb，当丙烯酰胺加入到纳米酶体系中，由于配位键及氢键的形成，纳米酶表面的空位活性位点被覆盖，导致cu,fe-pts纳米酶活性降低，体系蓝色变浅，从而建立了丙烯酰胺的比色快速检测方法，将本方法应用于咖啡中丙烯酰胺的检测分析，结果与hplc/ms测定的结果相符；本发明方法只能选择性检测丙烯酰胺，共存的其他物质没有干扰，检出限达0.01μg/ml，且方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。
5.本发明基于过氧化物酶模拟酶快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法步骤如下：（1）将0.25-0.30g磷钨酸溶于40-50ml纯水中，然后加入0.30-0.35g fecl3、0.20-0.30g cucl2，常温搅拌30-40min后，转移到聚四氟乙烯罐中，置于微波消解仪中，在微波、
140-160℃下加热3-4h，冷却至室温，离心，0.22μm滤膜过滤，滤液真空干燥即得cu,fe-pts纳米酶；（2）在cu,fe-pts纳米酶溶液中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液（tmb）、h2o2溶液、丙烯酰胺标准溶液，然后加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液定容，反应5-10min后，在654nm波长处测定吸光度，建立吸光度与丙烯酰胺浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；所述丙烯酰胺在定容后溶液中的浓度为0.067-100μg/ml；cu,fe-pts纳米酶溶液的浓度为2mg/ml，添加量为50-100 μl；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液浓度为50mmol/l，添加量为50-100μl，h2o2溶液浓度为50mmol/l，添加量为20-50μl；（3）提取检测样品中丙烯酰胺，获得样品测定液，在cu,fe-pts纳米酶溶液中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、h2o2溶液、样品测定液，然后加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液定容，反应5-10min后，于654nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中丙烯酰胺含量。
6.所述的离心是在8000-10000r/min下处理10-15min。
7.本发明的优点在于：1、本发明利用具有高负电荷、独特螯合性质和多样结构的金属-氧化物阴离子，具有独特的电子转移性质和调控纳米材料电荷组成的能力磷钨酸与fe
3+
及cu
2+
为原料制备纳米酶（cu,fe-pts），fe原子和cu原子的协同作用产生了较大的催化活性面积，fe(iii)/fe(ii)及cu(ii)/cu(i)协同加速了电子转移，产生更多的
·
oh，从而增强了纳米酶活性；2、 在中性条件下，cu,fe-pts纳米酶能在h2o2存在下快速催化tmb底物生成蓝色的ox-tmb，当丙烯酰胺加入到纳米酶体系中，由于配位键及氢键的形成，纳米酶表面的空位活性位点被覆盖，导致cu,fe-pts纳米酶活性降低，反应体系蓝色变浅，从而建立了丙烯酰胺的比色快速检测方法；3、本发明建立的方法用于测咖啡中丙烯酰胺检测，具有检测可靠、简便、快速的特点，与相关方法比较，具有检测结果一致性，本发明丙烯酰胺检测达到10μg/kg，与 gb 5009.204-2014标准检测低限一致。
附图说明
8.图1为实施例1中合成的cu,fe-pts纳米酶的tem图；图 2为实施例1中cu,fe-pts纳米酶、cu,fe-pts纳米酶+丙烯酰胺氧化tmb+h2o2的紫外-可见吸收光谱；图 3为实施例1中fe-pts纳米酶、fe
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pts纳米酶+丙烯酰胺氧化tmb+h2o2的紫外-可见吸收光谱；图 4为实施例1中cu-pts纳米酶、cu
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pts纳米酶+丙烯酰胺氧化tmb+h2o2的紫外-可见吸收光谱；图5 为不同浓度edta对cu,fe-pts纳米酶+tmb+h2o2氧化体系的影响结果；图6为实施例1中丙烯酰胺抑制cu,fe-pts纳米酶氧化tmb+h2o2的线性紫外-可见吸收光谱；图7为丙烯酰胺线性回归方程；图8为干扰物质对丙烯酰胺检测体系的影响结果。
具体实施方式
9.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
10.实施例1：咖啡样品中丙烯酰胺的测定1、cu,fe-pts纳米酶制备：0.25g磷钨酸、溶于45ml纯水，加入0.30gfecl3，0.25gcucl2，常温搅拌30min后，转移到聚四氟乙烯罐中，置于微波消解仪中，在微波、150℃下加热3h，冷却至室温，8000r/min下离心15min，过0.22μm滤膜，在60℃下真空干燥30h，即得cu,fe-pts纳米酶；图1为cu,fe-pts电镜图，揭示了无金属聚集的层状和堆叠结构；同法制备cu-pts纳米酶及fe-pts纳米酶，方法同上，不同在于分别加入cucl2、fecl3。
11.2、步骤1制得的纳米酶过氧化物酶活性评价（1）取50μl浓度为50mmol/l的tmb，加入2mg/mlcu,fe-pts纳米酶70μl及50mmol/l的h2o250μl，加入0.1mmol/lph7.0磷酸盐缓冲溶液至3ml，摇匀，静置10min，于654nm波长处测定吸光度，在上述体系中加入浓度为1μg/ml丙烯酰胺100μl，同时以不添加丙烯酰胺的为对照；结果见图2，从图中可以看出，cu,fe-pts纳米酶具有强的拟过氧化物酶活性，而加入丙烯酰胺，体系的拟过氧化物酶活性受到抑制；同时按常规方法进行了米氏催化动力学参数测定，结果见表1，cu,fe-pts纳米酶的米氏常数无论对tmb还是h2o2，都小于cu,fe-pts纳米酶+丙烯酰胺体系的米氏常数，表明加入丙烯酰胺后都降低了酶与底物的亲和力，而反应速度在加入丙烯酰胺后都降低了，这些结果与图2一致；表1cu,fe-pts纳米酶动力学对数；（2）在cu-pts纳米酶及fe-pts纳米酶的酶活性检测中，纳米酶添加浓度与上述cu,fe-pts纳米酶一致，检测方法相同，观察丙烯酰胺对cu-pts纳米酶、fe-pts纳米酶活性的影响，结果见图3、图4，结果表明纳米酶活性：fe-pts纳米酶＞cu,fe-pts纳米酶＞cu-pts纳米酶，而加入丙烯酰胺后，丙烯酰胺仅对cu,fe-pts纳米酶+tmb+h2o2体系有明显降低作用。
12.3、edta为氧空位捕获剂，在浓度为6.67、33.33、166.67μg/ml的edta中加入100
µ
g/mlcu,fe-pts纳米酶溶液100μl、50mmol/ltmb20
µ
l，测定吸光度；结果表明，随着edta浓度的增加，吸光度随之下降，表明cu,fe-pts纳米酶存在氧空位，氧空位的存在可提高表面氧气的吸附与活化，进而对底物的氧化有促进作用，结果见图5。
13.4、丙烯酰胺工作曲线制作：在5ml具塞比色管中加入50μl浓度为50mmol/l的tmb、2mg/mlcu,fe-pts溶液70μl、50mmol/l的h2o250μl、丙烯酰胺标准溶液，加入0.1mmol/lph7.0磷酸盐缓冲溶液至3ml，摇匀，其中丙烯酰胺在具塞比色管中浓度为0.067-100μg/ml，静置10min，测定其500~800nm的紫外光谱图，结果见图6；以丙烯酰胺浓度为横坐标，以654nm波长处吸光度a为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见图7；回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表2；
2014 大型仪器设备及专业操作人员，所用时间短，处理成本低，操作简便，在实际检测中具有较强优势。

技术特征：
1.一种快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法，其特征在于，步骤如下：（1）将0.25-0.30g磷钨酸溶于40-50ml纯水中，然后加入0.30-0.35g fecl3、0.20-0.30g cucl2，常温搅拌30-40min后，在微波、140-160℃下加热3-4h，冷却至室温，离心，0.22μm滤膜过滤，滤液真空干燥即得cu,fe-pts纳米酶；（2）在cu,fe-pts纳米酶溶液中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、h2o2溶液、丙烯酰胺标准溶液，然后加入ph 7.0磷酸盐缓冲溶液定容，反应5-10min后，在654nm波长处测定吸光度，建立吸光度与丙烯酰胺浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；（3）提取检测样品中丙烯酰胺，获得样品测定液，在cu,fe-pts纳米酶溶液中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、h2o2溶液、样品测定液，然后加入ph7.0磷酸盐缓冲溶液定容，反应5-10min后，于654nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中丙烯酰胺含量。2.根据权利要求1所述的快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法，其特征在于：cu,fe-pts纳米酶溶液的浓度为2mg/ml，添加量为50-100μl；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液浓度为50mmol/l，添加量为50-100μl，h2o2溶液浓度为50mmol/l，添加量为20-50μl；丙烯酰胺在定容后溶液中的浓度为0.067-100μg/ml。3.根据权利要求1所述的快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法，其特征在于：离心是在8000-10000r/min下处理10-15min。

技术总结
本发明公开了一种快速检测咖啡中丙烯酰胺的方法，该方法以磷钨酸和氯化铜及氯化铁为前驱，微波法合成具有类过氧化酶纳米酶活性的含铜铁磷钨酸纳米酶，在中性条件下，Cu,Fe-PTs纳米酶能在H2O2存在下快速催化TMB底物生成蓝色的ox-TMB，当丙烯酰胺加入到纳米酶体系中，由于配位键及氢键的形成，纳米酶表面的空位活性位点被覆盖，导致Cu,Fe-PTs纳米酶活性降低，检测体系蓝色变浅，从而建立了丙烯酰胺的比色快速检测方法，本发明方法只能选择性检测丙烯酰胺，共存的其他物质没有干扰，检出限达0.01μg/mL，方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。快速等特点。快速等特点。


技术研发人员：李宏 代佳和 施娅楠 杨瑞娟 李秋兰 杨亚玲
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/8/9