一种重组人源Ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌及其构建方法和应用与流程

一种重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白的制备方法和应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是动物和人体内细胞外基质中含量最丰富的蛋白，广泛存在于皮肤骨骼等中，起到支撑稳定和支持伸张的作用。尤其在伤口恢复和愈合方面有着重要的作用。胶原蛋白中发挥其生物学功能的主要结构是其三螺旋结构，ⅲ型胶原蛋白由三条相同的α1肽链组成三螺旋结构。胶原蛋白在体内合成途径十分复杂，而且脯氨酸羟化酶在其合成的过程中起到至关重要的作用。而确保其能形成有活性的三螺旋结构，需要α链上的脯氨酸发生羟基化修饰。这一过程需要脯氨酸羟基化酶催化完成。
3.因为胶原蛋白良好的促进愈合能力，其作为美容材料、医疗材料等领域应用广泛。现在主要使用的胶原蛋白仍然为从动物体内提取的天然胶原蛋白，这些提取过程困难且容易破坏其三螺旋结构，且非人源有可能带来过敏和病毒隐患。同时动物源的天然胶原蛋白往往不易溶于水，给后续加工和使用造成困难。
4.巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)作为一种外源蛋白表达系统，不仅简单易于培养，而且成本低表达量高。除此之外，真核表达系统可以对外源蛋白进行修饰如糖基化、蛋白磷酸化等，还不含有细菌内毒素。因此选取毕赤酵母作为工程菌生产胶原蛋白成为可能。由于毕赤酵母细胞不表达脯氨酸羟化酶，所以需要额外引入此种酶的基因。
5.故本领域亟需研发一种能够表达良好且安全性高的重组ⅲ型三螺旋胶原蛋白的工程菌来解决上述问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌及其构建方法和应用。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：本发明的第一方面提供了一种重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，包括如下步骤：s1．将优化后的脯氨酸羟化酶基因插入至穿梭表达载体ppic9k质粒中得到重组载体a；s2.将优化后的人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链基因片段插入至ppiczαa质粒中得到重组载体b；s3．将重组载体a转化至宿主菌株毕赤酵母中，筛选后再将重组载体b转化至宿主菌株毕赤酵母中，筛选得到重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。
8.优选地，优化后的脯氨酸羟化酶基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.优选地，优化后的人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链基因片段的核苷酸序列如seq id no：5所示。
10.优选地，所述步骤s1包括如下步骤：s11．合成含有荧光egfp标签的小球菌病毒脯氨酸羟化酶的dna片段1；s12．设计扩增引物，对dna片段a进行扩增，得到两端含有ecori和noti酶切位点的扩增片段；s13．使用ecori和noti限制性内切酶对扩增片段和ppic9k质粒进行酶切；s14．使用连接酶对扩增片段和ppic9k质粒进行连接，过夜培养，得到含有脯氨酸羟化酶基因的重组载体a；s15．将重组载体a转化至大肠杆菌中进行质粒克隆，获取大量目的重组载体a。
11.优选地，所述步骤s2包括如下步骤：s21、合成含有人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链的dna片段序列b；s22、设计含有his亲和标签的扩增引物，对dna片段序列b进行扩增，得到两端含有ecori和noti酶切位点的扩增片段；s23、使用ecori和noti限制性内切酶对扩增片段和ppiczαa质粒进行酶切；s24、使用连接酶对扩增片段和ppiczαa质粒质粒进行连接，得到含有人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的重组载体b。
12.优选地，步骤s3包括如下步骤：制作感受态宿主菌株毕赤酵母，使用限制性内切酶将含有脯氨酸羟化酶基因的重组载体a进行线性化，然后电击转化至宿主菌株毕赤酵母，做阳性克隆子筛选，培养后选取有产生荧光的工程菌。
13.优选地，步骤s4包括如下步骤：选取有荧光的工程菌，制作感受态宿主菌株毕赤酵母，将线性化的含有人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的重组载体b电转至宿主菌株毕赤酵母，筛选后的得到重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。
14.优选的，所述宿主菌株毕赤酵母为gs115毕赤酵母。
15.本发明的第二方面还提供了一种由上述构建方法得到的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。
16.本发明的第三方面还提供了一种由上述重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌在制备人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白中的应用。
[0017]ⅲ型三螺旋胶原蛋白由三条相同的α1肽链组成三螺旋结构。为了确保其能形成有活性的三螺旋结构，需要α链上的脯氨酸发生羟基化修饰，这一过程需要脯氨酸羟基化酶催化完成。毕赤酵母细胞不表达此种羟化酶，所以需要额外引入此种酶的基因。小球藻病毒1（pbcv-1）的脯氨酸羟基化酶基因与人源脯氨酸羟基化酶基因类似，且易于表达。
[0018]
本发明选取人ⅲ型胶原蛋白α链基因和小球藻病毒1（pbcv-1）的脯氨酸羟基化酶基因作为目的基因。根据人ⅲ型胶原蛋白α链基因，选取该序列中第908至1446位的599个氨基酸，并在结尾处加入6his纯化标签。根据小球藻病毒1（pbcv-1）的脯氨酸羟基化酶基因，选取其中的34至242位的208个氨基酸（100-726个基因），除去n端，并加入荧光标记。然后按照毕赤酵母的密码子对两组目的基因进行优化， 并且规避基因工程操作中有可能用到的
酶切位点。在两段目的基因前后后加入基因工程所需的酶切位点的基因。
[0019]
本发明选取的工程菌为毕赤酵母gs115（量产高型），质粒为ppic9k/ppiczαa。两种质粒皆为分泌表达载体。毕赤酵母gs115为组氨酸缺陷型，缺少his4基因。方便筛选转化子。
[0020]
本发明选取先构建表达脯氨酸羟化酶的工程菌，后表达人源重组ⅲ型三螺旋胶原蛋白的方法。此种方法简易且后续生产成本低，质粒可通过大肠杆菌批量克隆，获取途径简单。重组蛋白为胞外分泌，方便收集和纯化。所得重组蛋白可发挥其作为ⅲ型三螺旋胶原蛋白的生物学功能。
[0021]
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：（1）本发明所述的工程菌构建方法通过选取与人源类似且结构简单更易表达的脯氨酸羟化酶与穿梭质粒相连，降低了成本且简单方便生产。
[0022]
（2）本发明通过选取表达良好的人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白片段，并进行优化，解决了ⅲ型胶原蛋白不好表达的问题，且选取片段表达成功率高，具有ⅲ型胶原蛋白的生物学功能。
[0023]
（3）本发明通过具有表达脯氨酸羟基化酶的酵母细工程菌,可以确保胶原蛋白分子序列中的脯氨酸位点进行羟基化,有效的提高了胶原分子间的相互作用力，热稳定性和抗酶解水平。
[0024]
（4）利用本发明的工程菌制备得到的三螺旋构象能够实现细胞粘附、迁移、增殖等多种生物学功能，满足下游产品对生物学活性的最大化的需求。
附图说明
[0025]
图1是实施例的含有优化的脯氨酸羟基化酶基因的重组质粒的构建示意图；图2是实施例的含有优化的ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的重组质粒的构建示意图；图3是含有ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的ppiczα a的质粒酶切电泳图；图4是人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白在gs115菌株中表达的蛋白免疫印迹图；图5是实施例所述的制得的ⅲ型三螺旋胶原蛋白的溶液。
具体实施方式
[0026]
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0027]
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例
[0028]
1.构建载体1.2构建含有脯氨酸羟基化酶基因的质粒先构建可以表达脯氨酸羟基化酶的重组毕赤酵母菌株。选择质粒ppic9k，插入优化过的pbcv-1的脯氨酸羟基化酶基因(seq id no:1所示)和egfp荧光标记（n端）（如图1所示）。采用全基因合成获得目的基因片段，并用含有酶切位点的引物进行pcr。
[0029]
优化过的脯氨酸羟基化酶基因序列：
agaagagaaggttttgaaacttctgatagacctggtgtttgtgatggtaaatactacgaaaaaatcgatggttttctgtctgatattgaatgtgatgttttgattaacgctgctattaagaaaggtttgattaagtctgaagtcggtggtgctactgaaaatgatcctattaagttggatcctaagtctcgtaactctgaacaaacttggttcatgcctggtgaacatgaagttattgataagattcaaaagaagaccagagaatttttgaactctaaaaagcattgcatcgataagtacaactttgaagatgttcaagttgctagatacaagccaggtcaatactattaccatcattacgatggtgacgattgtgatgatgcttgtcctaaagatcaaagattggctactttgatggtttacttgaaagctcctgaagaaggtggtggtggtgaaactgattttccaactttgaagactaagattaagcctaagaaaggtacttctattttcttctgggttgctgatccagttactagaaaattgtataaggaaactctgcatgctggtttgcctgttaaatctggtgaaaagattattgctaaccaatggattagagctgttaaa（seq id no:1）。
[0030]
上下游扩增引物：上游5
’‑3’
：ccggaattccaccatcatcatcatcacgtgagcaagggcg（seq id no:2）；下游5
’‑3’
： gcaaatggcattctgacatcc（seq id no:3）；连接引物：ttgcggccgcttagctttgaaaatacagattttccttgtacagctcgtc（seq id no:4）；酶切位点：ecorⅰ（gaattc），notⅰ（gcggccgc）。
[0031]
全基因合成进行两步pcr。第一步50μl体系中加入0.5-1pmol/个oligo和dna聚合酶，约65
°
c，进行15个循环，获得全长片段。第二轮用1μlpcr产物做模板，加入20pmol全长引物和高保真dna聚合酶，20-25个循环，获得目的基因。最后用t4-dna连接酶（16
°
c，过夜）将目的基因和连接至酶切后的质粒。
[0032]
1.2. 质粒克隆质粒ppic9k是穿梭质粒，将其用cacl2热激法转导至大肠杆菌，进行培养克隆，24h后破碎菌体提取质粒，进行酶切sds电泳或菌落pcr检测。获取大量含有目的质粒。
[0033]
1.3. 构建含有ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的质粒构建含有优化后的ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因和6
×
his标签（c端）(seq id no:2所示)的质粒，选择质粒ppiczαa，插入优化后的ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因和6
×
his标签（c端）（如图2所示）。用全基因合成获得目的基因片段，并用含有酶切位点的引物进行pcr。约65
°
c，进行15个循环，获得全长片段。
[0034]
优化后的ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因序列（含有6
×
his标签）：gctggtaacactggtgctcctggttctccaggtgtttctggtccaaagggtgacgctggtcaaccaggtgaaaaaggttctccaggagcccaaggtccaccaggtgctccaggtccattgggtattgctggtattactggtgctagaggtttggctggtcctccaggtatgcctggtcctagaggttctccaggtccacaaggtgttaagggtgaatctggtaaaccaggtgctaacggtttgtctggtgaaagaggtcctccaggaccacaaggtttgcctggtttggctggaactgctggtgaaccaggtagagatggtaacccaggttctgatggtttgcctggaagagatggttctcctggtggtaaaggtgacagaggtgaaaacggttctccaggtgctcctggagcccctggtcatcctggtcctccaggtccagttggtccagctggtaaatctggtgacagaggagaatctggtccagctggacctgctggtgctcctggtccagctggttctcgtggtgctccaggacctcaaggtcctagaggagataaaggtgaaactggtgaaagaggagctgctggtattaagggtcatagaggttttccaggtaaccctggtgctcctggttcccctggtccagccggtcaacaaggtgctattggttctccaggtcctgctggtcctagaggtcctgttggtccatctggtccaccaggaaaggatggtacttctggtcatcctggacctattggtccaccaggtcctagaggtaacagaggtgaaagaggttctgaaggttctccaggtcatccaggtcaa
cctggtcctcctggtccacctggtgctccaggtccttgttgtggtggtgttggtgctgctgctattgctggtatcggtggtgaaaaggctggtggtttcgctccttattacggtgacgaaccaatggattttaagattaacactgatgaaatcatgacctctttgaaatctgttaatggtcaaattgagtctttgatttctcctgatggttctcgtaaaaatccagctagaaactgtagagatttgaaattttgtcacccagaattgaaatctggtgaatattgggttgatccaaatcaaggttgtaaattggatgctattaaggttttctgtaacatggaaactggtgagacttgtatttctgctaacccattgaatgttcctagaaaacattggtggactgattcttctgctgaaaagaaacatgtttggtttggtgaatctatggatggtggtttccaattctcttatggtaaccctgaattgccagaagatgttttggatgttcatttggctttcttgagattgttgtcttctcgtgcttctcaaaatattacttatcattgtaagaactccatcgcttatatggatcaagcttctggtaacgttaagaaggctttgaagttgatgggttctaacgaaggtgagtttaaagctgaaggtaattctaaattcacctatactgttttggaggatggttgtactaagcatactggtgaatggtctaagactgttttcgaatacagaactagaaaggctgttagattgcctattgttgatattgctccatatgatattggtggtccagatcaagaatttggtgttgatgttggtccagtttgttttcttcatcatcatcatcaccattaa（seq id no:5）。
[0035]
上下游扩增引物：上游：tactattgccagcattgctgc（seq id no:6）；下游：gcaaatggcattctgacatcc（seq id no:7）；酶切位点：ecorⅰ（gaattc），notⅰ（gcggccgc）。
[0036]
最后用t4-dna连接酶（16
°
c，过夜）将目的基因连接至质粒。
[0037]
1.4. 质粒克隆获取大量含目的基因的ppiczαa质粒，将目的基因插入大肠杆菌的质粒中，进行克隆培养，后破碎菌体提取质粒，对质粒进行酶切电泳回收目的基因。然后将目的基因与酶切质粒相连接。选取质粒做测序酶切电泳验证，如图3所示。
[0038]
2.转菌制作感受态毕赤酵母。取100μl的酵母菌液，加入ypd液体培养基过夜培养，培养到od值在1.3-1.5之间。两次离心弃上清用无菌水重悬后两次离心弃上清用冰浴1m的山梨醇重悬。
[0039]
验证后使用sali限制性内切酶将含有羟化酶基因的质粒进行线性化，然后电击转化至酵母菌，电压1700v、时间8ms、电击2次。做阳性克隆子筛选，30
°
c培养3天。选取有产生荧光的酵母菌。之后再次制作感受态毕赤酵母，将线性化的含有人源胶原蛋白基因的质粒电转后进行筛选，将不同量的混合液涂布于100ug/ml zeocin抗生素ypd平板上，30度，48h，待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有10ml ypd液体培养基试管中(抗生素zeocin浓度100ug/ml)，30度，180rpm过夜培养。
[0040]
3.小试培养取阳性的菌株（10棵菌株）进行小试培养，先分别接入装有10ml ypd的试管中，24h后取500ul接入到50ml ypd液体培养基中。zeocin 浓度200ug/ml,30
°
c。48h从培养基中取样，离心收集上清液。对上清使用对应试剂检测，携带6
×
his标签蛋白，选择对应的anti-his抗体的dot-bot。结果分析，选出阳性信号最强的菌株，使用此菌株放大培养。
[0041]
4.发酵纯化进行1l摇瓶诱导表达，接种至含有博来霉素的bmgy液体培养基中，震荡培养24小时，之后加入含有1％甲醇的bmmy液体培养基中进行72小时的诱导表达。收集上清。
[0042]
his-tag标签融合蛋白选取ni柱亲和纯化，选取低压层析系统，上清溶液以0.5 ml/min流速上样至结合缓冲液（50 mm nah2po4，10 mm咪唑，0.3 m nacl，ph8.0）预平衡的ni-ida
ꢀ‑
besds 6ff亲和层析柱。随后用结合缓冲液以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线。然后用冲洗缓冲液（50 mm nah2po4，20 mm咪唑，0.3 m nacl，ph8.0） 以1 ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线。最后用洗脱缓冲液（50 mm nah2po4，250 mm咪唑，0.3 m nacl，ph8.0）以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。将收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用结合缓冲液进行透析过夜。回收率大于70%，纯度大于95%，水溶性良好，如图5所示。将透析得到的胶原蛋白进行冻干（-80
°
c，24h），得到胶原蛋白粉末。
[0043]
5. 验证5.1． sds-page电泳：目的蛋白的分子量。
[0044]
选取10%的sds 聚丙烯酰胺凝胶，三组10μl重组蛋白溶液上样后开始电泳，浓缩胶100v，15-20min，分离胶200v，50-50min。
[0045]
免疫印迹：验证重组蛋白为ⅲ型三螺旋胶原蛋白。
[0046]
取电泳后凝胶转至提前浸泡过的硝酸纤维素膜，加冰块60v2h，转膜后染色备用。放入tbs封闭1h。pbst稀释过的一抗，室温下孵育1.5h后，pbst洗4次，每次10 min。二抗同步骤后进行显色处理。当能够清晰的看到显色带时，用蒸馏水清洗3次，每次10min。结果如图4所示，可在约55kda看到明显条带。
[0047]
5.2. 包被细胞培养板：蛋白生物学功能和细胞毒性。
[0048]
接种人皮肤成纤维细胞，37
°
c培养3至7天，采用无重组蛋白包被的细胞板作为对照。观察并用cck8试剂盒和酶标仪测其在450nm处光吸收值计算增殖率。
[0049]
将实验组的吸收值/对照组的吸收值后
×
100%，结果见下表，可以看出不同浓度组的细胞增殖率均大于100%，证明细胞毒性为0，且可以促进皮肤细胞殖。
[0050]
表1 不同浓度组的光吸收值和细胞增殖率
[0051]
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

技术特征：
1.一种重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：s1．将优化后的脯氨酸羟化酶基因插入至穿梭表达载体ppic9k质粒中得到重组载体a；优化后的脯氨酸羟化酶基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；s2.将优化后的人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链基因片段插入至ppiczαa质粒中得到重组载体b；s3．将重组载体a转化至宿主菌株毕赤酵母中，筛选后再将重组载体b转化至宿主菌株毕赤酵母中，筛选得到重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。2.根据权利要求1所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：优化后的人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链基因片段的核苷酸序列如seq id no：5所示。3.根据权利要求1所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤s1包括如下步骤：s11．合成含有荧光egfp标签的小球菌病毒脯氨酸羟化酶的dna片段1；s12．设计扩增引物，对dna片段a进行扩增，得到两端含有ecori和noti酶切位点的扩增片段；s13．使用ecori和noti限制性内切酶对扩增片段和ppic9k质粒进行酶切；s14．使用连接酶对扩增片段和ppic9k质粒进行连接，过夜培养，得到含有脯氨酸羟化酶基因的重组载体a；s15．将重组载体a转化至大肠杆菌中进行质粒克隆，获取大量目的重组载体a。4.根据权利要求1所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤s2包括如下步骤：s21、合成含有人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链的dna片段序列b；s22、设计含有his亲和标签的扩增引物，对dna片段序列b进行扩增，得到两端含有ecori和noti酶切位点的扩增片段；s23、使用ecori和noti限制性内切酶对扩增片段和ppiczαa质粒进行酶切；s24、使用连接酶对扩增片段和ppiczαa质粒质粒进行连接，得到含有人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的重组载体b。5.根据权利要求1所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：步骤s3包括如下步骤：制作感受态宿主菌株毕赤酵母，使用限制性内切酶将含有脯氨酸羟化酶基因的重组载体a进行线性化，然后电击转化至宿主菌株毕赤酵母，做阳性克隆子筛选，培养后选取有产生荧光的工程菌。6.根据权利要求1所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：步骤s4包括如下步骤：选取有荧光的工程菌，制作感受态宿主菌株毕赤酵母，将线性化的含有人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白基因的重组载体b电转至宿主菌株毕赤酵母，筛选后的得到重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。7.根据权利要求5所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于：所述宿主菌株毕赤酵母为gs115毕赤酵母。
8.一种由权利要求1-7任一所述的构建方法得到的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。9.一种由权利要求8所述的重组人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌在制备人源ⅲ型三螺旋胶原蛋白中的应用。

技术总结
本发明提供了一种重组人源Ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌及其构建方法和应用，所述构建方法包括如下步骤：S1．将优化后的脯氨酸羟化酶基因插入至穿梭表达载体pPIC9k质粒中得到重组载体A；S2.将优化后的人源Ⅲ型三螺旋胶原蛋白alpha 1链基因片段插入至pPICZαA质粒中得到重组载体B；S3．将重组载体A转化至宿主菌株毕赤酵母中，筛选后再将重组载体B转化至宿主菌株毕赤酵母中，筛选得到重组人源Ⅲ型三螺旋胶原蛋白工程菌。本发明的工程菌制备得到的三螺旋构象能够实现细胞粘附、迁移、增殖等多种生物学功能，满足下游产品对生物学活性的最大化的需求。化的需求。化的需求。


技术研发人员：李慧 许洋
受保护的技术使用者：天津辅元生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/8/9