丹酚酸B在制备抗轮状病毒制剂中的应用

丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用。


背景技术：

2.轮状病毒(rotavirus，rv)是一种属于呼肠孤病毒科的非包膜双链rna病毒，由三层同心蛋白质层形成，包裹着11段双链rna(dsrna)构成的基因组，编码六种结构蛋白(vp1-4、vp6、vp7)和六种非结构蛋白(nsp1-6)。rv是引起婴幼儿严重肠胃炎的主要病原体，感染rv会导致严重腹泻、脱水，甚至死亡。目前对于rv引起的肠炎尚无特效药，接种疫苗是预防轮状病毒的主要方法，但在发展中国家却收效甚微。因此，研究新型防治rv感染的药物具有重要意义。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明提供丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用。
4.丹酚酸b(salvianolic acid b,sal b)化学结构式如下：
[0005][0006]
是从中药材丹参的根和茎中提取的具有高活性表达的一种水溶性物质。本发明研究显示，丹酚酸b通过抑制轮状病毒vp6的基因表达，实现抑制轮状病毒的生物合成的效果。
[0007]
丹酚酸b在制备由抗轮状病毒引起的疾病的制剂中的应用。
[0008]
作为优选的技术方案，所述丹酚酸b的有效浓度为64-256μm。
[0009]
丹酚酸b抗轮状病毒生物合成的能力与阳性药物利巴韦林无显著差异，丹酚酸b有效浓度为64-256μm时抑制率高于50％，抗轮状病毒生物合成作用显著。
[0010]
更优选的，所述丹酚酸b的有效浓度为256μm。
[0011]
本发明的另一目的是，提供一种抗轮状病毒的制剂，包括丹酚酸b。
[0012]
作为优选的技术方案，所述丹酚酸b的有效浓度为64-256μm。
[0013]
更优选的，所述丹酚酸b的有效浓度为256μm。
[0014]
作为优选的技术方案，所述制剂还包括药学上允许的辅料。
[0015]
作为优选的技术方案，所述制剂为固体、半固体或液体的形式。
[0016]
作为优选的技术方案，所述制剂为溶液剂、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或散剂。
[0017]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用。丹酚酸b在0μm-256μm，对细胞没有药物毒性，且在64-256μm能够有效抑制轮状病毒的生物合成。丹酚酸b通过抑制结构蛋白vp6，发挥抗轮状病毒生物合成的作用，对轮状病毒无吸附和直接抑制作用，为抗轮状病毒制剂提供新途径。
附图说明
[0018]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0019]
图1为正常ma104细胞；
[0020]
图2为轮状病毒感染48h后的ma104细胞；
[0021]
图3为丹酚酸b对ma104细胞的毒性结果，(与未处理的对照组相比，***p《0.001，****p《0.0001)；
[0022]
图4为丹酚酸b抗rv吸附作用结果，(与ribavirin组比较，
△
p《0.05)；
[0023]
图5为丹酚酸b对rv抗生物合成作用(与ribavirin组比较，无显著性差异)；
[0024]
图6为丹酚酸b对rv直接抑制作用(与ribavirin组比较，
△△△
p《0.001)；
[0025]
图7为丹酚酸b对rv感染ma104细胞病毒结构蛋白vp6基因表达的影响(与rv组比较,
###
p《0.001,
####
p《0.0001)；
[0026]
注：本发明试验结果利用graphpad(prism8.0)软件对统计结果进行图表绘制，p《0.05表示差异具有统计学意义。(***p《0.001，****p《0.0001表示与未处理的对照组相比；
△
p《0.05，
△△△
p《0.001表示与ribavirin组相比；
###
p《0.001,
####
p《0.0001表示与rv组相比)。
具体实施方式
[0027]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]
本发明实施例公开了丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用，所用试剂均为市售可得，对其来源不做具体限定，所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
[0029]
实施例1
[0030]
1.试验主要材料与试剂
[0031]
丹酚酸b标准品：上海源叶生物科技有限公司，批号：b20261。
[0032]
wa株轮状病毒，由本实验室(广东医科大学病原生物学实验室)提供。
[0033]
恒河猴胚胎肾细胞(ma104细胞)，来源于中山大学细胞库。
[0034]
抗轮状病毒vp6抗体abcam(cambridge，uk)。
[0035]
2.主要试剂配制方法
[0036]
丹酚酸b母液：称取丹酚酸b标准品适量，在超净台内用细胞级dmso溶解后加入适量高糖dmem培养基稀释，混匀，以dmso终浓度不超过0.5％为标准。用一次性无菌针管将药液通过0.22μm滤膜过滤除菌，即得丹酚酸b母液。
[0037]
利巴韦林：100mg/ml的利巴韦林和高糖dmem培养基以1：100的比例稀释至1mg/ml。
[0038]
完全培养基(含10％胎牛血清、1％双抗)：在超净工作台内向450ml的高糖dmem培养基中加入fbs50ml和双抗(抗青链霉素)5ml，充分混匀后分装到标记好的50ml离心管中，用封口膜封口并标记日期，4℃保存。
[0039]
20μg/ml不含edta的胰蛋白酶消化液：不含edta的0.25％胰蛋白酶消化液和高糖dmem培养基以1：125的比例稀释至20μg/ml。
[0040]
病毒生长维持液：20μg/ml不含edta的胰蛋白酶消化液和高糖dmem培养基以1：20的比例稀释至1μg/ml。
[0041]
mtt配制：将250mgmtt粉末溶于50mlpbs，超声至mtt粉末溶解，用0.22um滤膜过滤，分装至10mlep管中，用封口膜封口并标记日期，避光保存于-20℃冰箱。
[0042]
实施例2
[0043]
轮状病毒感染ma104细胞形态变化
[0044]
将rv病毒置于37℃水浴锅中迅速溶解，将溶解后的病毒和20μg/ml不含edta的胰蛋白酶消化液按照1：1的比例混匀，置于co2培养箱中孵育30min，将孵育好的病毒液加入到生长到80～90％的ma104细胞中，然后继续向培养瓶中加入3ml病毒生长维持液，放入co2培养箱中继续培养。病毒感染后的ma104细胞会发生细胞病变cpe(cytopathiceffect)，当病变程度达到75％时，将病毒收集，于-20℃冰箱中反复冻融3次后，低温离心，收取上清液，上清液为所扩增的病毒液。重复上述过程，扩增rv。
[0045]
如附图1所示，正常ma104细胞形状为三角形或梭形，细胞轮廓明显清晰；如附图2所示，感染rv后的ma104细胞，细胞发生明显病变，细胞边界变得模糊，细胞间距离增大，细胞内黑色颗粒增加，最后细胞完全脱落，漂浮。
[0046]
实施例3
[0047]
丹酚酸b对ma104细胞的毒性(mtt法检测)
[0048]
当ma104细胞长至单层时，进行消化、离心和重悬，混悬液进一步稀释后取10μl于血细胞计数板上计数，计算所需细胞体积。随后在96孔板中进行细胞铺板，每孔加100μl细胞混悬液，细胞密度为8
×
104个/ml。用不同浓度的丹酚酸b处理长至单层的细胞72h，mtt法检测丹酚酸b对ma104细胞的毒性。每孔加入10ul的mtt溶液，培养箱中孵育3-4h后，取出96孔板，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μldmso，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，于490nm波长下检测并记录吸光度。
[0049]
细胞的相对存活率公式为：
[0050]
细胞存活率＝{(a
实验组-a
空白
)(a
对照组-a
空白
)
×
100％}
[0051]
如附图3所示，丹酚酸b浓度为512μm时，细胞存活率低于95％，开始出现毒性。在0-256μm浓度范围内对ma104细胞无明显毒性，因此可以选择16-256μm以内的药物浓度作为后续实验的给药浓度。
[0052]
实施例4
[0053]
丹酚酸b对抗轮状病毒机理
[0054]
为了研究丹酚酸b是否具有体外抗rv感染的作用，在ma104细胞模型上从丹酚酸b抗rv的吸附、生物合成和直接抑制作用三方面进行研究。
[0055]
1.丹酚酸b抗rv吸附作用
[0056]
在生长至单层的ma104细胞的96孔培养板内加入不同浓度的丹酚酸b药液，每个浓度药液重复4孔，每孔100μl。阳性对照组中加入等体积的利巴韦林(ribavirin)，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积dmem培养液，置于37℃、5％co2培养箱中孵育2h。将药液吸出，除正常细胞对照组以外的其余各组均加入100tcid50的病毒液(病毒与20μg/ml胰酶37℃作用30min)，每孔100μl，37℃、5％co2培养箱中孵育2h，将病毒吸出，加入维持液，每孔100μl，将96孔板置于37℃、5％co2培养箱中孵育连续观察72h后，用mtt法检测。每孔加入1/10体积的mtt溶液，培养箱中孵育3-4h后取出96孔板，小心吸去孔内培养液，每孔加入150uldmso，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，于490nm波长下检测并记录吸光度。计算药物对病毒的抑制率，重复实验3次。
[0057]
病毒抑制率(％)＝(药物组的平均a值-病毒对照组的平均a值)/(正常细胞对照组的平均a值-病毒对照组的平均a值)
×
100％
[0058]
如附图4所示，与ribavirin组相比，丹酚酸b在16μm时有统计学差异，在32-256μm浓度范围内抗rv吸附作用与利巴韦林无显著差异，但抑制率均低于50％，表明丹酚酸b无明显抗rv吸附作用。
[0059]
2.丹酚酸b抗rv生物合成作用
[0060]
将100tcid50病毒液(病毒与20μg/ml胰酶37℃作用30min)加入到生长至单层的ma104细胞的96孔培养板内，每孔100μl，加入前用pbs将细胞冲洗2次。设正常细胞对照组，加入等体积dmem培养液，将96孔板置于37℃、5％co2培养箱中孵育2h，将病毒液吸出，分别加入不同浓度丹酚酸b和利巴韦林，每孔100μl，设病毒对照组，只加入维持液，每孔100μl。将96孔板置于37℃、5％co2培养箱中孵育连续观察72h后，用mtt法检测。每孔加入1/10体积的mtt溶液，培养箱中孵育3-4h后取出96孔板，小心吸去孔内培养液，每孔加入150uldmso，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，于490nm波长下检测并记录吸光度。计算药物对病毒的抑制率，重复实验3次。
[0061]
病毒抑制率(％)＝(药物组的平均a值-病毒对照组的平均a值)/(正常细胞对照组的平均a值-病毒对照组的平均a值)
×
100％
[0062]
如附图5所示，与ribavirin组相比，丹酚酸b不同浓度药物组均无显著性差异，但对rv生物合成的抑制作用随药物浓度升高而增大，呈明显的量－效关系。其中，丹酚酸b浓度在64-256μm时抑制率高于50％，对rv有明显的抗生物合成作用。
[0063]
3.丹酚酸b对rv的直接抑制作用
[0064]
将不同浓度的丹酚酸b药液与50tcid50病毒液(病毒与20μg/ml胰酶37℃作用30min)、dmem与50tcid50病毒液，利巴韦林与50tcid50病毒液等体积混合后放入37℃、5％co2培养箱中孵育2h。用pbs将细胞冲洗2次后将其加入到生长至单层ma104细胞的96孔培养板内，正常细胞对照组加入等体积dmem。37℃、5％co2孵育2h，然后将混合液吸出，加入维持液，每孔100μl，将96孔板置于37℃、5％co2培养箱中孵育连续观察72h后，用mtt法检测。每孔加入1/10体积的mtt溶液，培养箱中孵育3-4h后取出96孔板，小心吸去孔内培养液，每孔
加入150uldmso，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，于490nm波长下检测并记录吸光度。计算药物对病毒的抑制率，重复实验3次。
[0065]
病毒抑制率(％)＝(药物组的平均a值-病毒对照组的平均a值)/(正常细胞对照组的平均a值-病毒对照组的平均a值)
×
100％
[0066]
如附图6所示，与ribavirin组相比，丹酚酸b在16-256μm浓度范围内直接抑制rv的抑制率分别为14.18％、15.18％、16.47％、15.82％、12.71％，具有统计学差异且对rv抑制率较低，均低于50％，表明丹酚酸b无直接抑制rv的作用。
[0067]
实施例5
[0068]
丹酚酸b对rv结构蛋白vp6基因表达量的影响
[0069]
(1)总rna的提取及定量
[0070]
①
为了进一步验证丹酚酸b是否有抗rv合成作用，设置药物组(用不同浓度的丹酚酸b药液处理rv感染后的ma104细胞)，利巴韦林组、正常组和rv组，去上清液，pbs清洗两次，每孔添加1mltrizol试剂，静置5min，用枪头吹打细胞后将其收集于1.5ml的无酶ep管中。向管中加入200μl的氯仿，涡旋震荡15s后室温静置5min，离心(4℃，12000r/min，15min)，离心后的样品分三层，即无色的上层、白色中间层和红色的下层。
[0071]
②
小心吸取上清液至新的1.5ml无酶的ep管中(体积约400μl)，加入等体积的预冷的异丙醇，上下剧烈震荡混匀，离心(4℃，12000r/min，15min)。
[0072]
③
离心后ep管底部可见白色沉淀，去上清保留沉淀，加入配制好的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无酶水按照3：1比例配制)1ml，摇晃混匀，离心(4℃，12000r/min，10min)，弃去上清液，室温放置15min-20min，晾干。
[0073]
④
晾干后向ep管中加入20μldepc水，轻轻吹打管壁溶解rna。nanodrop微量紫外分光光度计测定样品的rna浓度后可直接用于实验或-80℃保存样品备用。
[0074]
(2)mrna的逆转录反应
[0075]
①
去除基因组dna反应
[0076]
在冰上按照下列成分配制反应混合液，反应体积为20μl，操作按照evom-mlvrtkitwithgdnacleanforqpcrii说明书进行。该实验下所用耗材皆为axygen无酶耗材。
[0077]
表1去基因组dna反应体系
[0078][0079]
*1：rna量可根据需要添加。在20μl反转录体系中，最多使用1μgtotalrna；使用探针法时，最多使用2μgtotalrna。
[0080]
反应条件：42℃2min，4℃。
[0081]
②
反转录反应
[0082]
按照下表内容进行反应液的配制，进行反转录反应。
[0083]
表2反转录反应体系
[0084][0085]
反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃。
[0086]
(3)realtimepcr反应
[0087]
实时定量pcr的采用sybrgreeni荧光标记，检测药物组、利巴韦林组、正常组和rv组的vp6表达水平，采用green premixprotaqhsqpcrkitii试剂盒，内参选用gapdh。实验用axygen专用的real-timepcr板，按照下列下表配制实时荧光定量pcr扩增反应体系，反应液配制在冰上进行操作(反应总体系为10μl)。
[0088]
表3qpcr反应体系
[0089][0090][0091]
表4 qpcr反应条件
[0092][0093]
表5引物序列
[0094][0095]
结果如附图7所示，与rv组相比，ribavirin组vp6基因表达明显降低，有统计学差异(
####
p《0.0001)，表明ribavirin具有抗rv的作用。与rv组相比，丹酚酸b组在64、128、256μm浓度下vp6表达量均明显降低，有统计学差异，且存在剂量效应相关性，其中丹酚酸b在256μm时抑制vp6的表达最为显著(
####
p《0.0001),表明丹酚酸b可通过抑制vp6的基因表达发挥抗rv的作用。
[0096]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0097]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用。2.丹酚酸b在制备由抗轮状病毒引起的疾病的制剂中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述丹酚酸b的有效浓度为64-256μm。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述丹酚酸b的有效浓度为256μm。5.一种抗轮状病毒的制剂，其特征在于，包括丹酚酸b。6.根据权利要求5所述的抗轮状病毒的制剂，其特征在于，所述丹酚酸b的有效浓度为64-256μm。7.根据权利要求6所述的抗轮状病毒的制剂，其特征在于，所述丹酚酸b的有效浓度为256μm。8.根据权利要求5所述的抗轮状病毒的制剂，其特征在于，所述制剂还包括药学上允许的辅料。9.根据权利要求5所述的抗轮状病毒的制剂，其特征在于，所述制剂为固体、半固体或液体的形式。10.根据权利要求5所述的抗轮状病毒的制剂，其特征在于，所述制剂为溶液剂、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或散剂。

技术总结
本发明公开了一种丹酚酸B在制备抗轮状病毒制剂中的应用，涉及医药技术领域。丹酚酸B在16-256μM对细胞没有药物毒性，且在64-256μM能够有效抑制轮状病毒的生物合成，丹酚酸B通过抑制结构蛋白VP6发挥抗轮状病毒生物合成的作用，丹酚酸B对轮状病毒无吸附和直接抑制作用，为抗轮状病毒提供新途径。为抗轮状病毒提供新途径。为抗轮状病毒提供新途径。


技术研发人员：宋丽军 赵文昌
受保护的技术使用者：广东医科大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/13