一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis，简称tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性传染病，已经存在数千年。自2007年，结核病就一直位居单一传染性疾病死因之首。近几年，每年约有1000万人死于结核病。自从1943年，链霉素作为第一个抗结核药物的发现，后续异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等一/二线抗结核药物也陆续被成功研发，用于结核病的治疗。但是，这些药物至今已经使用了几十年，对一种或几种一/二线抗结核药物产生耐药的菌株在结核病流行国家中均被发现。目前，临床上面临的主要问题是越来越多的耐药结核病的出现，包括单耐药、多耐药、耐多药和广耐药等。近40年来，经过一系列研究和临床试验，fda批准的仅有3个抗肺结核新药：贝达喹啉，德拉马尼和普托马尼，也主要是针对有效地治疗耐药结核病。其区别于已有药物的作用靶点，基于新型药物靶点发现活性分子是开发新型药物的重要途径。
3.因此，运用抑制结核分枝杆菌的新靶标，筛选高效活性分子，是获得能够有效抑制结核分枝杆菌，同时对耐药结核分枝杆菌具有显著抑制作用的活性分子及候选药物的有效手段，亦是本领域技术人员亟需解决的关键问题。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用。
7.进一步地，所述水杨酸类化合物为5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)，其结构式如(i)所示：
[0008][0009]
进一步地，本发明所述结核病是由结核分枝杆菌经呼吸道传播而引起的全身性慢性传染病。
[0010]
进一步地，所述水杨酸类化合物对结核分枝杆菌具有特异性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。
[0011]
更进一步地，所述水杨酸类化合物通过破坏所述结核分枝杆菌的细胞壁进而实现
抗结核的作用。
[0012]
更进一步地，所述水杨酸类化合物通过对所述结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶进行抑制表现出抗结核作用。
[0013]
本发明还提供了一种抗结核药物，含有效量的式(i)所示的化合物；
[0014][0015]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0016]
本发明公开了一种水杨酸类化合物lavendustin c的应用，本发明中的lavendustin c通过抑制结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶，进而显著抑制了对药物敏感型的结核分枝杆菌。而且本发明对临床多药耐药菌株也有强效抑制作用。因此，lavendustin c是制备抗结核药物的一种优良的候选药物。
附图说明
[0017]
构成本技术的一部分的附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
[0018]
图1为实施例1中的化合物(i)的1h nmr图谱；
[0019]
图2为实施例1中的化合物(i)的
13
c nmr图谱；
[0020]
图3为实施例2中的化合物(i)抗结核分枝杆菌h37ra的效果；
[0021]
图4中的图(a)为实施例3中的化合物(i)对革兰氏阴性菌的抑制效果图，图(b)为实施例3中的化合物(i)对革兰氏阳性菌的抑制效果图；
[0022]
图5为实施例4中的化合物(i)对活细胞的影响的图片，其中，图(a)为对活细胞a549的影响图，图(b)为对活细胞rko的影响图，图(c)为对活细胞mcf-7的影响图；
[0023]
图6为实施例5中的化合物(i)对结核分枝杆菌菌体的影响的图片，其中，图(a)为空白对照组与实验组的菌体对比图，图(b)为空白对照组与实验组的菌体的菌壁完整性对比图；
[0024]
图7为实施例6中的化合物(i)对结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶的影响图。
具体实施方式
[0025]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0026]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0027]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规
技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0028]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0029]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0030]
本发明的实施例中的5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)为文献(kobayashi t,et al.involvement of cam kinase ii in the impairment of endothelial function and enos activity in aortas oftype 2diabetic rats[j].clin sci(lond).2012,123(6):375-86.)所记载的化合物。
[0031]
实施例1
[0032]
一种化合物(i)5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)的结构式如(i)所示：
[0033][0034]
其1h nmr图谱如图1所示，
13
c nmr图谱如图2所示，图1-2波谱数据如下：
[0035]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ12.79(1h,s)，11.44(1h,s)，8.83(1h,s)，8.60(1h,s)，7.43(1h,d,j＝9.0hz)，7.01(1h,s)，6.62(1h,d,j＝9.0hz)，6.56(1h,d,j＝3.0hz)，6.45(1h,dd,j＝9.0,3.0hz)，6.17(1h,dd,j＝9.0,1.8hz)，5.90(1h,s)，4.15(2h,s)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ172.59,164.00,155.56,150.29,147.66,131.48,125.95,116.05,114.98,114.40,105.91,100.42,96.91,41.14.
[0036]
实施例2
[0037]
实施例1中的化合物(i)5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)的抗结核分枝杆菌h37ra的效果验证如下：
[0038]
基于微孔板的alamarblue实验，检测化合物(i)对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度，具体实验步骤如下：
[0039]
(1)准备浓度为106cfu/ml的病原菌悬液，以500μl/孔加入至48孔板；
[0040]
(2)将化合物(i)按照二倍稀释法加入到步骤(1)所得含菌液的48孔板，浓度梯度设置为10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、1μm、0.5μm、0.25μm、0.125μm；同时设置添加抗结核药物异烟肼(inh浓度为0.4μm)处理孔为阳性对照组，只含有菌液的处理孔为空白对照组；
[0041]
(3)将步骤(2)所得48孔板用封口膜密封，放至37℃恒温培养箱，培养7天后，每个孔分别取出100μl放入到96孔板中，再加入50μl刃天青显色液进行显色；
[0042]
(4)显色期间，实时观察96孔板中每个孔液体的颜色变化，直到空白对照组颜色由
蓝色变为粉色，取出96孔板，观察拍照。结果如图3所示，化合物(i)对上述结核分枝杆菌具有显著的抑制活性，且当化合物(i)浓度为1μm以上时，其抑制活性与异烟肼(inh)对照组相似。
[0043]
实施例3
[0044]
实施例1中的化合物(i)5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的抑制效果：
[0045]
基于微孔板的alamarblue实验，检测化合物(i)对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌最小抑菌浓度，具体实验步骤如下：
[0046]
(1)准备浓度为105cfu/ml的细菌悬液，以100μl/孔加入至96孔板；
[0047]
(2)将化合物(i)加入到步骤(1)所得含菌液的96孔板，浓度梯度设置为100μm、50μm、20μm、10μm、1μm；同时设置添加氨苄青霉素(amp浓度为50μg/ml)处理孔为阳性对照组，只含有菌液的处理孔为空白对照组；
[0048]
(3)将步骤(2)所得96孔板用封口膜密封，放至37℃恒温培养箱，培养1天后，加入50μl刃天青显色液进行显色；
[0049]
(4)显色期间，实时观察96孔板中每个孔液体的颜色变化，直到空白对照组颜色由蓝色变为呈黄色(受培养基颜色影响)，取出96孔板，观察拍照。结果如图4所示，通过图(a)可以知晓化合物(i)对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)基本无毒，通过图(b)可以知晓在50μm以内对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)基本无毒。
[0050]
实施例4
[0051]
实施例1中的化合物(i)5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)对活细胞的影响：
[0052]
基于微孔板的cck-8实验，检测化合物(i)对细胞的毒性，验证药物的安全性，具体实验步骤如下：
[0053]
(1)选择a549、rko、mcf-7三种细胞进行实验，将细胞分别进行消化、计数后，调整细胞浓度为5
×
104个/ml，作为铺板的细胞悬液，以100μl/孔的添加量加入到96孔板中，然后放于37℃的co2恒温培养箱培养12h；
[0054]
(2)将化合物(i)加入到步骤(1)所得的96孔板中，浓度梯度设置为100μm、50μm、20μm、10μm、1μm；同时设置添加紫杉醇(浓度为10μm)处理孔为阳性对照组，只含有细胞的处理孔为对照组，只含有培养基的孔为空白组，然后放回37℃的co2恒温培养箱继续培养48h；
[0055]
(3)将步骤(2)中的96孔板从恒温培养箱中取出，去除上清液，避光，加入100μl cck-8(10％)，然后放回37℃的co2恒温培养箱孵育，每隔30min，用荧光酶标仪检测96孔板中每个孔的液体在450nm发射波长下的吸收值，去除培养基和cck-8的背景后，计算活性存活率；
[0056]
其中，活性存活率＝((实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值))
×
100％。
[0057]
结果如图5所示，lavendustin c对a549、rko、mcf-7三种细胞均无毒性，作为临床药物的开发具有一定的安全性。
[0058]
实施例5
[0059]
实施例1中的化合物(i)5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)对结核
分枝杆菌菌体的影响：
[0060]
基于电镜实验，观察化合物(i)对结核分枝杆菌菌体的影响，具体实验步骤如下：
[0061]
(1)将m.tb h37ra培养两瓶，每瓶20ml，待菌液od595值为0.3左右时，其中一瓶菌液中加入浓度为2
×
mic的化合物(i)作为实验组；另一瓶菌液中加入与实验组化合物等体积的dmso作为空白对照组。将2瓶菌液放置于37℃摇床振荡培养24h；
[0062]
(2)将步骤(1)中的各菌液平均分为两份，转移至50ml无菌离心管中，4℃，3000
×
g离心10min，收集菌体沉淀；
[0063]
(3)向步骤(2)中得到的两份沉淀(实验组和对照组)中加入5ml pbs(0.1m，ph 7.4)洗涤菌体沉淀，洗涤3次，最后加入500μl的2.5％戊二醛，4℃固定过夜，待测扫描电镜。
[0064]
(4)向步骤(2)得到的两份沉淀(实验组和对照组)中只加入500μl的2.5％戊二醛，4℃固定过夜，待测透射电镜；
[0065]
(5)将步骤(3)和(4)所得的菌体进行电镜检测，观察化合物(i)对结核分枝杆菌菌体的影响。结果如图6中(a)所示，与空白对照组比较，实验组菌体长度明显缩短，表面起皱扭曲，甚至部分断裂，可见碎片；图6中(b)结果显示，实验组菌壁完整性被破坏，轮廓变得模糊。综上，通过图6可以表明lavendustin c通过破坏细菌细胞壁表现出抗结核作用。
[0066]
实施例6
[0067]
实施例1中的化合物(i)5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸(lavendustin c)对结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶的影响：
[0068]
基于体外代谢实验，研究化合物(i)对结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶的影响，具体实验步骤如下：
[0069]
(1)基于结核分枝杆菌h37ra蛋白信息rv0734，设计结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶mtmet-ap1，选择bl21(de3)感受态细胞，通过itpg(1mm，16℃低温诱导24h)，镍柱纯化获得纯化蛋白；
[0070]
(2)利用步骤(1)中获得的蛋白验证化合物(i)的抑制作用，反应体系(200μl)包括：hepes(100mm)，nacl(50mm)，cocl2(200μm)，mtmet-ap1(11μg/ml)以及荧光探针ddan-mt(2.5μm)，设抑制剂浓度(μm)梯度为：1、2、4、6、8、10、15、20、25、30，控制dmso体积《1％，37℃下反应30min；
[0071]
(3)向步骤(2)中加入100μl乙腈终止实验，于20000
×
g下离心20min，去除蛋白。吸取200μl上清液通过酶标仪分析其荧光响应值(激发波长：λ
ex
600nm，发射波长：λ
em 668nm)。结果如图7所示，通过结果可知lavendustin c的ic
50
为16.50μm，其通过抑制结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶活性表现出抗结核作用。
[0072]
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用。2.根据权利要求1所述的一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用，其特征在于，所述水杨酸类化合物为5-(2,5-二羟基苄基氨基)水杨酸，其结构式如(i)所示：3.根据权利要求1所述的一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用，其特征在于，所述水杨酸类化合物对结核分枝杆菌具有特异性。4.根据权利要求3所述的一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用，其特征在于，所述水杨酸类化合物通过破坏所述结核分枝杆菌的细胞壁进而实现抗结核的作用。5.根据权利要求3所述的一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用，其特征在于，所述水杨酸类化合物通过对所述结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶进行抑制表现出抗结核作用。6.一种抗结核药物，其特征在于，含有效量的式(i)所示的化合物；

技术总结
本发明公开了一种水杨酸类化合物在制备抗结核药物中的应用，属于生物医药技术领域。所述水杨酸类化合物对结核分枝杆菌具有靶向性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。所述水杨酸类化合物通过对结核分枝杆菌中的甲硫氨酸氨基肽酶进行抑制进而表现出抗结核作用。而且本发明对临床多药耐药菌株也有强效抑制作用。因此，所述水杨酸类化合物是制备抗结核药物的一种优良的候选药物。物的一种优良的候选药物。物的一种优良的候选药物。


技术研发人员：王超 冯磊 马骁驰 张铭 于振龙 武玉卓
受保护的技术使用者：大连医科大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/13