外泌体miRNA生物标志物在奶牛围产期脂肪肝诊断与预警中的应用

外泌体mirna生物标志物在奶牛围产期脂肪肝诊断与预警中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及外泌体mirna生物标志物在奶牛围产期脂肪肝诊断与预警中的应用。


背景技术：

2.脂肪肝作为围产期(奶牛产前三周至产后三周的这段时间称为围产期)奶牛高发易发的代谢紊乱性疾病，有研究表明，在围产期，5-10％的奶牛患重度脂肪肝，30-40％患中度或轻度脂肪肝，该病的发生会降低产奶量、奶牛生产繁殖性能，造成较高的奶牛淘汰率。因此，准确诊断脂肪肝既有利于奶牛健康，利于养殖的可持续性；又可以通过预警性诊断提前调整并预防，减少产奶量降低带来的牧场经济损失；同时，降低了奶牛围产期的淘汰率，避免淘汰牛带来的经济损失。
3.目前，脂肪肝的检测方法主要有肝脏活检、血清生理生化、蛋白质组学和代谢组学、数字化图像技术等。其中，最为准确和直接的方法是肝活检，但其需手术取肝，对牛体造成二次伤害，增大损失。临床上目前比较认可的诊断方法为reid提出的y值法(reid et sl.,1983)，需要3项血清生化指标进行计算，但是不能准确判断脂肪肝的发病程度，精准性差，不适用于规模化牧场(hu et al.,2018；zhang et al.,2022)。因此，行业迫切需要开发和研究诊断高效、精确、操作方便和对基本无害甚至无创的新方法。
4.mirna(microrna)是一种长度约为22nt的具有调节功能的小非编码rna，机体内几乎所有细胞都可产生(bartel,2018；ha et al.,2014)。已有研究显示mirna参与了动物几乎所有的发育和病理过程(ha and kim,2014)。并且研究人员发现特定的循环mirna可对许多类型疾病进行诊断判别及预后，行使生物标志物的作用(jamali et al.,2018)。
5.外泌体是具有内体起源的直径大小范围为40～160nm细胞外囊泡(kalluri et al.,2020)。外泌体广泛分布于血液、唾液、脑脊液、母乳、和尿液等各种体液中，其可携带包括mirna在内的生物分子(xu et al.,2022)。随着研究的进一步推进，外泌体正在成为一种潜在有价值的围产期奶牛脂肪肝进展的非侵入性液体活检工具。
6.与其他核酸相比，mirna是较为理想的生物标志物候选物。在血液中mirna的持久稳定性，且mirna在有rna酶的情况下依然可以较为稳定地存在，而不被降解(mitchell et al.,2008)，使得其在诊断中用作非侵入性生物标志物具有重要价值(wang et al.,2009)。mirna作为生物标志物具用快速、灵敏、无创、经济、高效等优点，这也使得mirna成为多种疾病诊断及预后的有效生物标志物(jamali et al.,2018)。本专利的发明人团队在前期研究(cn 105420405 b)中借助人、小鼠、大鼠脂肪肝模型已发现的差异mirnas，选择部分mirnas在疑似脂肪肝牛的血清中检测，最终得到了一组可以用于预测奶牛脂肪肝以及奶牛围产期相关代谢疾病的牛血清mirna分子标记，利用该分子标记可以用于奶牛生产实践中对于患病牛的早期发现和诊断。但是，前述研究中仍存在以下问题：
7.(1)所筛选的mirna分子标记并非直接来源于牛，其特异性与灵敏度有待提高。
8.(2)牛群体是基于几种生化指标的变化来判断奶牛患脂肪肝病的可能性，谈不上精准诊断，只是疑似患病，因而其诊断方法存在一定局限性和较大的误差(一项研究指出，围产期奶牛脂肪肝患病率的误差可高达30-50％左右，主要是由于血清中生化指标存在的时序性和生理变异所致，这些变异可能导致判断困难和误诊)。与之相对应的，用于诊断的牛血清mirna分子标记的灵敏度和特异性也有待进一步提升。


技术实现要素：

9.针对上述现有技术，本发明的目的是提供外泌体mirna生物标志物在奶牛围产期脂肪肝诊断与预警中的应用。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.本发明的第一方面，提供如下1)-12)至少一项所述外泌体mirna作为生物标记物在制备诊断或预警围产期奶牛脂肪肝病的试剂盒中的应用：
12.1)bta-mir-2285bn，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
13.2)bta-mir-2285ce，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
14.3)bta-mir-10225b，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
15.4)bta-mir-369-5p，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
16.5)bta-mir-219-3p，其核苷酸序列如seq id no.5所示；
17.6)bta-mir-11988，其核苷酸序列如seq id no.6所示；
18.7)bta-mir-296-3p，其核苷酸序列如seq id no.7所示；
19.8)bta-mir-10174-3p，其核苷酸序列如seq id no.8所示；
20.9)bta-mir-378c，其核苷酸序列如seq id no.9所示；
21.10)bta-mir-27a-3p，其核苷酸序列如seq id no.10所示；
22.11)novel_118，其核苷酸序列如seq id no.11所示；
23.12)novel_173，其核苷酸序列如seq id no.12所示。
24.上述12个外泌体mirna作为生物标志物均能准确识别围产期奶牛脂肪肝，每一个外泌体mirna的auc值均符合诊断学意义，具有较高的临床诊断应用价值；而且，多个外泌体mirna联合应用时，auc比单个更接近于1，诊断效果更好。
25.进一步的，多个外泌体mirna联合应用时，基于不同的外泌体mirna组合，可实现不同的诊断效果，具体的：
26.将novel_118、bta-mir-2285bn和bta-mir-2285ce这3个外泌体mirnas组合使用，可用于诊断围产期奶牛中度脂肪肝。
27.将bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p、bta-mir-10225b、novel_173、bta-mir-11988、bta-mir-10174-3p和bta-mir-378c这7个外泌体mirna组合使用，可用于诊断围产期奶牛重度脂肪肝。
28.将novel_173、bta-mir-378c和bta-mir-27a-3p这3个外泌体mirna组合使用，可用于区分围产期奶牛中度脂肪肝和重度脂肪肝。
29.将bta-mir-369-5p、novel_118、bta-mir-10225b、bta-mir-219-3p、bta-mir-296-3p和bta-mir-10174-3p这6个外泌体mirna组合使用，可用于区分围产期脂肪肝奶牛和正常奶牛。
30.本发明的第二方面，提供检测外泌体mirna的试剂在制备用于非侵入性识别围产期奶牛脂肪肝病的产品中的用途；
31.所述外泌体mirna为seq id no.1-seq id no.12至少一项所示的mirna。
32.进一步的，所述试剂为检测奶牛血清外泌体中mirna的试剂，或者直接检测血清中mirna的试剂。
33.优选的，所述试剂中包含qpcr检测用引物，其序列如seq id no.16-seq id no.27所示。
34.本发明的有益效果：
35.(1)本发明所发现的12个具有诊断价值的在奶牛脂肪肝病相应患病阶段，在识别、预警、鉴定、诊断的mirna生物标志物，特别是其中3个mirna中的至少1种可不经外泌体提取富集，在血清mirna中即可诊断奶牛是否患病。利用本发明的生物标志物对脂肪肝奶牛进行鉴别和诊断，具有较高的特异性和敏感性、标志物自身性质稳定、操作简便、价格较低，并且是一种无创且非侵入性的检测手段，对牛体的无害无伤，符合动物福利与健康养殖的理念，未来可广泛应用于奶牛的规模化养殖，促进奶业健康、高效发展。
36.(2)本发明提供的mirna生物标志物在诊结合共43头围产期奶牛的筛选、验证，发现在对脂肪肝的识别和诊断，具有较高的灵敏度和特异性，对于未来围产期奶牛脂肪肝的诊断具有较大使用价值和的意义。
37.(3)本发明筛选的mirna生物标志物本身来源于牛，针对性更强；本发明通过肝活检法准确诊断后确定奶牛健康状况，可100％诊断奶牛的健康或患病程度；基于上述改进，本发明发现的mirna标志物与过往本团队发现的mirnas标志物(奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病的牛血清microrna分子标记，zl201610034351.3)更灵敏、特异性更强。
附图说明
38.图1：本发明的生物标记物的发现流程图。
39.图2：测序奶牛群体各组肝组织脂肪含量。
40.图3：各组间差异mirnas火山图。筛选标准|log2(fc)|≥0.5；p≤0.05。
41.图4：各组间差异mirnas维恩图。火山图筛选结果，共得到28个(去掉重复的mirna)差异表达的mirna。
42.图5：经roc曲线筛选分析所得各组间共12个(去掉重复的mirna)mirna韦恩图结果。筛选标准为auc＞0.7(同时p＜0.05)。另，sfl vs mfl组筛选标准为auc＞0.7。
43.图6：mfl vs norm组roc曲线筛选所得3条mirna的roc曲线及该组3条mirna联合诊断roc曲线。筛选标准为auc＞0.7，p＜0.05。
44.图7：sfl vs norm组roc曲线筛选所得7条mirna的roc曲线及该组7条mirna联合诊断roc曲线。筛选标准为auc＞0.7，p＜0.05。
45.图8：sfl vs mfl组roc曲线筛选所得3条mirna的roc曲线及该组3条mirna联合诊断roc曲线。筛选标准为auc＞0.7。
46.图9：fl vs norm组roc曲线筛选所得6条mirna的roc曲线及该组6条mirna联合诊断roc曲线。筛选标准为auc＞0.7，p＜0.05。
47.图10：筛选所得12个mirna测序表达量小提琴图。
48.图11：验证新群体奶牛各组肝组织脂肪含量。验证新群体三组共12头经肝活检诊断确定健康状况的奶牛，
49.图12：在血清mirnas中仍具有诊断价值的3个mirna验证情况。图中上面三张图片左侧纵坐标以及红色折线、圆黑点和柱状图表示该mirna在血清验证集的表达情况；图中右侧纵坐标以及蓝色折线、方蓝点表示该mirna在测序集的表达情况。
具体实施方式
50.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
51.如前所述，由于mirna的来源以及判断奶牛是否患脂肪肝所使用的方法存在的误差，使得发明人团队在前期研究中开发的牛血清mirna诊断奶牛脂肪肝的特异性和准确性仍有待进一步提高。
52.有鉴于此，本发明对此进行了进一步的研究。血清外泌体中含有较多的mirnas。先富集外泌体，那就可以富集到更多的mirnas纳入数据库用于后续筛选。因此，本发明从血清外泌体mirna入手，筛选能够诊断或预警围产期奶牛脂肪肝病的外泌体mirna。
53.本发明的外泌体rna生物标志物的发现过程如图1所示，具体如下：
54.将已进行肝活检鉴定的围产期奶牛群体分为测序集(n＝31)和血清验证集(n＝12)。其中，在测序集(n＝31)中，norm(正常组，n＝12)，mfl(中度脂肪肝组，n＝8)，sfl(重度脂肪组肝，n＝11)。在测序集奶牛血清中进行血清外泌体mirna标志物筛选，首先对其进行small rna-seq，获得全部的mirna表达谱。
55.进一步的，使用多变量统计正交偏最小二乘判别分析(opls-da)模型，基于非线性迭代偏最小二乘算法，同样可以进行降维处理(有监督的分类模型)。其可以运用正交偏最小二乘回归建立测序须获得的mirna表达量和样品类别之间的关系模型，可以最大程度地反映分类组别之间的差异，来实现对样品类别的建模预测。并计算每种mirna的vip值作为后续参考。
56.进一步的，对测序获得的mirnas根据不同组别，筛选组间差异mirnas。对于两两比较组mfl vs norm、sfl vs norm和sfl vs mfl中表达的全部mirnas进行统计分析，分析采用基于负二项分布的deseq2进行(love et al.,2014)。差异基因的筛选标准是|log2(fc)|≥0.5；p≤0.05，各组间结果以差异火山图进行显示。
57.进一步的，对获得的各组间差异表达的mirnas，通过roc曲线筛选分析评价所得mirna的诊断价值。当roc曲线auc在0.7～0.9(同时p＜0.05)，表示其具有中等准确度。当roc曲线auc＞0.9(同时p＜0.05)，表示其具有高准确度。选各组间取auc＞0.7(同时p＜0.05)的mirnas，筛选得到具有中等以上诊断能力的mirnas，将所得各组mirnas作为候选mirna生物标志物。
58.进一步的，将mfl组和sfl组看作患病组，记为fl组，同样进行roc曲线筛选分析评价所得mirna的诊断价值。筛选标准同样是auc＞0.9，p＜0.05。
59.此时，所得各组各mirnas为对脂肪肝具有中等以上诊断能力的围产期奶牛血清外
泌体mirna，并且对组间mirna进行联合诊断结果显示联合更是具有更高的诊断应用价值。由于sfl vs mfl所得标志物较少，故扩大筛选范围，其筛选标准为auc＞0.7。
60.进一步的，将每组所得经roc曲线筛选分析所得候选mirna进行联合诊断分析，使用logistic回归分析和roc曲线分析进行联合诊断分析，得出联合诊断分析的auc(auc＞0.7)值、p值(p＜0.05)和联合诊断roc曲线。
61.进一步的，由于外泌体提取条件较为苛刻，具体表现为操作繁琐，耗时较长，故本发明在血清验证集进行验证时，不进行外泌体富集，直接在已经肝活检诊断健康状况的围产期奶牛血清中直接提取mirnas。
62.故在血清验证集(n＝12)(奶牛已经肝活检诊断健康状况)，norm组(正常组，n＝4)，mfl组(中度脂肪肝组，n＝4)，sfl组(重度脂肪组肝，n＝4)。血清验证集不进行外泌体提取富集，直接在血清mirnas中进行对测序筛选到的候选外泌体mirna标志物进行rt-qpcr验证和roc曲线诊断分析验证。
63.验证时使用内参和外参结合的方式，内参使用u6，外参选取在奶牛中不存在的cel-mir-39-3p外参标准品。通过比较，并考虑到具体使用时加入外参会增加验证负担，本发明在具体应用时可直接使用内参u6用于后续进行定量。
64.使用加尾法对所得mirna对其进行rt-qpcr验证和roc曲线诊断分析验证，分析验证候选血清外泌体mirnas生物标志物在血清mirnas不经过外泌体富集，是否仍具有的诊断能力和价值。
65.本发明最终发现了12个具有诊断价值的血清外泌体mirna生物标志物，这12个血清外泌体mirna生物标志物分别为：
66.bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p、bta-mir-10225b、bta-mir-10174-3p、bta-mir-2285bn、bta-mir-2285ce、bta-mir-11988、bta-mir-378c、bta-mir-296-3p、bta-mir-27a-3p、novel_118和novel_173，上述12个血清外泌体mirna生物标志物的至少一个均可作为识别相应患病程度的脂肪肝病奶牛的非侵入性血清外泌体mirna生物标志物；并且发现其中3个mirna，该mirna为bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p、bta-mir-10174-3p中的至少1种可不经外泌体提取富集，直接可在血清mirna中进行围产期奶牛脂肪肝识、预警或诊断。
67.本发明的12个具有诊断价值的血清外泌体mirna的序列信息如表1和序列表中的seq id no.1-seq id no.12所示：
68.表1：mirna成熟序列及mirbase数据库登录号
[0069][0070]
注：根据wipo st.26标准的规定，表中mirna序列中的尿嘧啶“u”在序列表中用“t”表示。
[0071]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
[0072]
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
[0073]
实施例1：发明涉及生物样本情况及方法
[0074]
以围产期中国荷斯坦奶牛作为生物样本，将生物样本分为测序集(n＝31)和血清验证集(n＝12)。
[0075]
根据所采集肝组织的脂肪含量结果，对奶牛罹患脂肪肝的程度进行分类(诊断情况参见图2)，根据患病奶牛的脂肪含量不同，将所有测序样本为三组(n＝31)：norm组(正常组)脂肪含量为0.082％
±
0.071％(n＝12)；mfl组(中度脂肪肝组)的脂肪含量为29.49％
±
6.30％(n＝8)；sfl组(重度脂肪肝组)脂肪含量为74.70％
±
8.23％(n＝11)。再对其进行外泌体提取、外泌体总rna提取和small rna测序。
[0076]
实施例2：经差异表达分析初步筛选
[0077]
实施例1中small rna测序共得309种mirnas。经deseq2分析，根据|log2(fc)|≥0.5，p≤0.05的筛选标准(如图3)，得到三组，mfl vs norm比较组(7个)，所得mirna为bta-mir-22-3p、bta-mir-3600、novel_118、bta-mir-2285bn、bta-mir-2285ce、bta-mir-219-3p、bta-mir-424-5p；sfl vs norm比较组(20个)，所得mirna为bta-mir-219-3p、bta-mir-424-5p、bta-mir-296-3p、bta-mir-10174-3p、bta-mir-124a、bta-mir-11988、bta-mir-2376、bta-mir-369-5p、bta-mir-10225a、bta-mir-1388-5p、bta-mir-10225b、bta-mir-411c-5p、bta-mir-30f、novel_72、bta-mir-221、bta-mir-6529a、bta-mir-6529b、bta-mir-409b、novel_173、bta-mir-378c；sfl vs mfl比较组(8个)，所得mirna为bta-mir-6529a、bta-mir-6529b、bta-mir-409b、novel_173、bta-mir-378c、bta-mir-27a-3p、bta-mir-425-5p、bta-mir-1468，去掉重复mirnas，共28个显著差异表达的mirnas(见图4)。
[0078]
实施例3：经roc曲线筛选获得mirna生物标志物
[0079]
进一步对实施例2中初步筛选的28个显著差异表达的mirnas进行诊断能力roc筛选分析，选取auc＞0.7，p＜0.05的mirnas，获得mfl vs norm(3个)(见表2)、sfl vs norm(7
个)(见表3)、sfl vs mfl(3个)(见表4)、fl vs norm(6个)(见表5)，去掉重复mirnas，共12个具有诊断意义的围产期奶牛血清外泌体mirna生物标志物(见图5)：bta-mir-2285bn、bta-mir-2285ce、novel_118、bta-mir-11988、bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p、bta-mir-10225b、bta-mir-10174-3p、novel_173、bta-mir-378c、bta-mir-296-3p、bta-mir-27a-3p。该12个mirna的测序表达量小提琴图如图10所示。
[0080]
表2：mfl vs norm诊断中度roc分析结果(3个mirnas+联合诊断分析)
[0081][0082]
表3：sfl vs norm诊断重度roc分析结果(7个mirnas)
[0083][0084][0085]
表4：sfl vs mfl自患病个体中诊断重度roc分析结果(3个mirnas)
[0086][0087]
表5：fl vs norm诊断患病roc分析结果(6个mirnas)
[0088][0089]
实施例4：各组所得mirna生物标志物分别进行联合诊断分析
[0090]
为提高实施例3所得mirna生物标志物的诊断效能，将各组所得mirna分别进行联合诊断分析，如图6和表2所示，mfl vs norm比较组3个mirna联合诊断auc＝1(p＝0.0001)，具有较高的诊断效果；如图7和表3所示，sfl vs norm比较组7个mirna联合诊断auc＝1(p《0.0001)，具有较高的诊断效果；如图8和表4所示，sfl vs mfl比较组3个mirna联合诊断auc＝0.921(p＝0.002)，亦具有较高的诊断效果；如图9和表5所示，fl vs norm比较组6个mirna联合诊断auc＝1(p《0.0001)，具有较高的诊断效果。
[0091]
因此，基于不同的外泌体mirna生物标志物的组合，可实现不同的诊断效果，具体的：
[0092]
将novel_118、bta-mir-2285bn和bta-mir-2285ce这3个外泌体mirnas组合使用(见表2)，可用于诊断围产期奶牛中度脂肪肝。
[0093]
将bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p、bta-mir-10225b、novel_173、bta-mir-11988、bta-mir-10174-3p和bta-mir-378c这7个外泌体mirna组合使用(见表3)，可用于诊断围产期奶牛重度脂肪肝。
[0094]
将novel_173、bta-mir-378c和bta-mir-27a-3p这3个外泌体mirna组合使用(见表4)，可用于区分围产期奶牛中度脂肪肝和重度脂肪肝。
[0095]
考虑到在实际生产过程中，对于脂肪肝的诊断，主要应解决的应是首先区分出所饲养的奶牛是否患有脂肪肝(无论患病程度如何)，其次才是区分出患病奶牛的患病程度，以便对其对症施治，以节约节省医疗、人力等资源，因此，将bta-mir-369-5p、novel_118、bta-mir-10225b、bta-mir-219-3p、bta-mir-296-3p和bta-mir-10174-3p这6个外泌体mirna组合使用(见表5)，可用于区分围产期脂肪肝奶牛和正常奶牛。
[0096]
利用本发明的外泌体mirna生物标志物对围产期奶牛患病情况进行诊断的方法为：
[0097]
采集正常牛及疑似牛或待诊断牛的血液样品，分离血清，提取血清mirnas(也可不经过外泌体富集mirnas)，用实时荧光定量pcr技术检测标志mirna的相对表达量，与正常牛的表达水平相比较，发生与其在脂肪肝中的变化趋势相同，则说明疑似牛存在隐患。
[0098]
判断的标准：log2(fc)》0时为升高；log2(fc)《0时为降低。
[0099]
如表2中的bta-mir-2285bn或bta-mir-2285ce作为诊断标记时，待测牛如果比正常牛呈上升的表达，则表明待测牛存在患中度脂肪肝的可能性。反之，如果用bta-mir-10174-3p(表3所示)作为诊断标记时，其在待测牛血清中如果比正常牛呈下降的表达水平，
则表明待测牛存在患重度脂肪肝的可能性。
[0100]
实施例5：不经外泌体提取富集，直接在血清mirna中验证mirna生物标志物
[0101]
在血清验证集(n＝12)(如图11)：norm组(正常组，n＝4)的脂肪含量为0.28％
±
0.34％；mfl组(中度脂肪肝组，n＝4)的脂肪含量为32.75％
±
6.21％；sfl组(重度脂肪组肝，n＝4)的脂肪含量为73.09％
±
8.03％。为便于应用，减少操作步骤，新群体不进行外泌体提取富集，直接在血清中对测序集筛选到的外泌体mirna标志物进行rt-qpcr验证和roc曲线诊断验证。
[0102]
进一步，验证时使用内参和外参结合的方式，内参使用u6(引物序列见表6、序列表中seq id no.13-14)，外参选取在奶牛中不存在的cel-mir-39-3p外参标准品(引物序列见表6、序列表中seq id no.15)。通过比较，并考虑到具体使用时加入外参会增加验证负担，本发明在具体应用时可直接使用内参u6用于后续进行定量，采用poly-a加尾反转录方法验证待测mirna，使用“mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒(sybr green)(fp411)”进行检测，各mirna生物标记物检测所用的定量引物序列见表7、序列表中seq id no.16-27。
[0103]
该cel-mir-39-3p(mimat0000010)其序列(5
′‑3′
)为：ucaccggguguaaaucag cuug。(seq id no.28)
[0104]
注：根据wipo st.26标准的规定，该mirna序列中的尿嘧啶“u”在序列表中用“t”表示。
[0105]
表6：验证过程中使用的内外参及其引物
[0106][0107]
表7：mirna正向引物序列
[0108][0109]
选取auc＞0.7，p＜0.05的候选mirnas，结果得到sfl vs mfl组(3个)(见表8、图12)：bta-mir-369-5p(auc＝1，p＝0.0209)、bta-mir-219-3p(auc＝0.9375，p＝0.0433)和
bta-mir-10174-3p(auc＝1，p＝0.0495)。fl vs norm组(2个)(见表9、图12)：bta-mir-369-5p(auc＝1，p＝0.0082)、bta-mir-10174-3p(auc＝1，p＝0.0201)。前后两种方法提取mirna的方法不同、检测方法不同，但二者之间的变化趋势依然一致。再次证明这些mirna用于诊断标志物的可靠性。
[0110]
表8：sfl vs mfl组-在血清mirnas中验证候选mirnas的诊断能力及其变化趋势
[0111][0112]
注：表中“变化情况(测序集)”所示结果为测序数据所得的该mirna在sfl vs mfl组中变化结果，此处展示目的是为与该mirna在sfl vs mfl组rt-qpcr验证数据进行直观比较。前后两种方法提取mirna的方法不同、检测方法不同，但二者之间的变化趋势依然一致。再次证明这些mirna用于诊断标志物的可靠性。
[0113]
表9：fl vs norm组-在血清mirnas中验证候选mirnas的诊断能力
[0114][0115]
因此，bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p和bta-mir-10174-3p这3个mirnas直接在血清中依然具有诊断意义的围产期奶牛血清外泌体mirna生物标志物。
[0116]
在实验室研究中，可经外泌体富集获取更多的mirnas，以便进行表达差异分析或研究分析，故而从外泌体mirnas中筛选生物标志物；另外，考虑到实际生产应用过程，目前大多数养殖环境及检测机构不具备提取外泌体的能力，因此，本发明还对上述外泌体mirna生物标志物直接在血清中的检测能力进行了验证，结果表明：本发明中的用于诊断标志物的mirnas(bta-mir-369-5p、bta-mir-219-3p和bta-mir-10174-3p)可不经过外泌体富集，直接进行mirna的检测、诊断依然可行。
[0117]
实施例6：结合本实验室先前研究，比较分析本次筛选结果
[0118]
跟本实验室先前的研究(cn105420405b)比较发现，在本次测序、筛选过程中，除与本发明得到的同家族的两个mirnas【mir-27a-3p(其在mirbase数据库中登录号为mi0000860；本发明为bta-mir-27a-3p，其登录号为mimat0003532)和mir-378a-3p(其mirbase数据库中登录号为mi0003719；本发明为bta-mir-378c，其登录号为mimat0025551)】外，其余各mirnas在本发明筛选过程中，变化不显著或有偏差甚或检测不到(见表10)。
[0119]
表10：本发明所得mirna与原发明所得mirna对应情况1[0120][0121]
注：1.本表所列的6个mirnas是本发明所源于的测序原始数据中获得的血清表达信息，其余的mirnas。
[0122]
2.各mirna的登录号来自mirbase数据库。
[0123]
3.na表示本发明的样品测序数据中无检测值。
[0124]
相比之下，本发明鉴定的标志物更适合作为奶牛围产期脂肪肝及代谢紊乱症的诊断标志物，具用更高的灵敏度和特异性。原因有三：首先，本发明筛选的源头群体就是“金标准”肝活检诊断的患病牛群和正常牛群，因而筛选得到的mirnas具有更强的针对性和更高的准确性。其次，本发明的mirnas均经roc分析，验证了其作为诊断标志物的灵敏度与准确性；再次，本发明的mirnas经过他群验证依然具用诊断准确性。
[0125]
原专利是根据人、小鼠、大鼠的文献报道mirnas，然后选择若干mirnas在牛的血清中检测，最终专利了在牛血清中显著差异表达的几种mirnas标记。可见其用于奶牛精准诊断的片面性。这也是本发明要基于经过“金标准”——肝活检诊断的脂肪肝奶牛/正常奶牛进行针对性筛选标志物的最大原因之所在。另外，之前专利的牛群体是基于几种生化指标的变化来判断奶牛患脂肪肝病的可能性，谈不上精准诊断，只是疑似患病。
[0126]
综上，本发明鉴定的外泌体mirna生物标志物更适合作为奶牛围产期脂肪肝及代谢紊乱症的诊断标志物，具用更高的灵敏度和特异性。
[0127]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.seq id no.1-seq id no.12至少一项所述外泌体mirna作为生物标记物制备诊断或预警围产期奶牛脂肪肝病的试剂盒中的应用。2.外泌体mirna组合作为生物标记物在制备诊断围产期奶牛中度脂肪肝的产品中的应用；所述外泌体mirna组合由seq id no.1、seq id no.2和seq id no.11所示的外泌体mirna组成。3.外泌体mirna组合作为生物标记物在制备诊断围产期奶牛重度脂肪肝的产品中的应用；所述外泌体mirna组合由seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.9和seq id no.12所示的外泌体mirna组成。4.外泌体mirna组合作为生物标记物在制备区分围产期奶牛中度脂肪肝和重度脂肪肝的产品中的应用；所述外泌体mirna组合由seq id no.9、seq id no.10和seq id no.12所示的外泌体mirna组成。5.外泌体mirna组合作为生物标记物在制备区分围产期脂肪肝奶牛和正常奶牛的产品中的应用；所述外泌体mirna组合由seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8和seq id no.11所示的外泌体mirna组成。6.检测外泌体mirna的试剂在制备用于非侵入性识别围产期奶牛脂肪肝病的产品中的用途；所述外泌体mirna为seq id no.1-seq id no.12至少一项所示的mirna。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂为检测奶牛血清外泌体中mirna的试剂，或者直接检测血清中mirna的试剂。8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述试剂中包含qpcr检测用引物，其序列如seq id no.16-seq id no.27所示。

技术总结
本发明公开了外泌体miRNA生物标志物在奶牛围产期脂肪肝诊断与预警中的应用，属于生物技术领域。本发明所发现的12个具有诊断价值的在奶牛脂肪肝病相应患病阶段，在识别、预警、鉴定、诊断的miRNA生物标志物，特别是其中3个miRNA中的至少1种可不经外泌体提取富集，在血清miRNA中即可诊断奶牛是否患病。利用本发明的生物标志物对脂肪肝奶牛进行鉴别和诊断，具有较高的特异性和敏感性、标志物自身性质稳定、操作简便、价格较低，并且是一种无创且非侵入性的检测手段，对牛体的无害无伤，符合动物福利与健康养殖的理念，未来可广泛应用于奶牛的规模化养殖，促进奶业健康、高效发展。高效发展。高效发展。


技术研发人员：师科荣 侯宪朋 刘廷俊 闫晓冉 范思思 张璇
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/8/13